腹部大動脈瘤マウスモデルにおける脈拍伝播速度、分解性およびひずみの測定

要約

この原稿は、腹部大動脈瘤のマウスモデルに対する発光直径、脈拍伝播速度、崩壊性および放射状ひずみを測定するために高周波超音波画像を使用するための詳細なプロトコルについて説明する。

要約

腹部大動脈瘤(AAA)は、最大内膜内径(MILD)を元のサイズの1.5倍上回る腹部大動脈の局在拡張として定義される。臨床および実験的研究では、小さな動脈瘤が破裂する可能性があり、大きな動脈瘤の亜集団は安定したままであることが示されています。従って、大主体のイントラアルミナル直径の測定に加えて、血管壁の構造的特徴に関する知識は、AAAの安定性を評価する重要な情報を提供し得る。大動脈硬化は最近、血管壁の初期の変化を決定するための信頼性の高いツールとして登場しました。パルス伝播速度(PPV)と共に、解圧および放射状ひずみは、大動脈剛性を評価するために関連する非常に有用な超音波ベースの方法である。このプロトコルの主な目的は、画像を取得し、MILD、PPV、崩壊性および放射状ひずみによって決定された大オルタの構造的および機能的特性を分析するための超音波画像システムの使用のための包括的な技術を提供することです。

概要

腹部大動脈瘤(AAA)は、元の血管径を1.5^倍1上回る大動脈の恒久的な局所拡張によって特徴づけられる有意な心血管疾患を表す。AAAは、米国²における死亡率の上位13の原因の中でランク付けされています。AAAの進行は、大動脈壁の変性とエラスチンの断片化に起因し、最終的には大動脈破裂を引き起こします。これらの大動脈壁の変化は、最大内膜内皮径(MILD)の有意な増加なしに起こり得るが、したがって、MILD単独では疾患³の重症度を予測するのに十分ではないことを示唆している。したがって、大動脈壁の初期変化を検出するために追加の要因を同定する必要があり、早期治療の選択肢を導く可能性がある。このプロトコルの全体的な目標は、パルス伝播速度(PPV)、解圧および放射歪みの測定を特徴とする超音波画像を用いて大動脈の機能的特性を評価するための実用的なガイドを提供することです。

Daughertyたちは、AAAを研究するよく特徴づけられた実験モデルであり、Apoe-/-mice4の浸透圧ポンプを介してアンジオテンシンII(AngII)の皮下注入を伴う。超音波画像を使用してMILDの精密な測定は、このマウスモデル⁵でAAAを特徴付けるのに役立っています。AAAの開発時の組織学的変化は広範囲に研究されてきたが、大動脈剛性などの血管壁の機能的性質の変化は十分に特徴付けされていなかった。このプロトコルは、AAAの時間的な進行を研究するための強力なツールとして、高度な分析と組み合わせて高周波超音波の使用を強調しています。具体的には、これらのアプローチにより、PPV、溶解性および放射状ひずみによって測定される血管壁の機能特性を評価することができます。

AAAを有するヒト被験者における最近の臨床研究は、マウスエラスターゼ誘発AAAモデルにおいて、大動脈剛性と大動脈径^6,7との間の正の相関を示唆する。PPVは、大動脈剛性の指標であり、容器壁^6,8における剛性の変化を定量化するための優れた測定として受け入れられている。PPVは脈管構造に沿った2つの部位における脈波形の通過時間を測定することによって計算され、大動脈剛性の地域評価を提供する。我々は最近、PPVで測定された大動脈剛性の増加を実証し、原子間力顕微鏡を用いて決定される細胞レベルにおいて、動脈瘤発生⁹と正に相関する。また、この文献は、大動脈剛性が動脈瘤拡張に先行し、したがって^AAA10の開発中に血管壁の局所的固有特性に関する有用な情報を提供し得る可能性を示唆している。同様に、解圧およびひずみ測定は、動脈フィットネスの以前の変化を測定するための定量ツールです。健康な動脈は柔軟で弾力性があり、剛性が高く、弾力性が低いと、変形性および歪みが減少する。ここでは、マウスのMILD、PPV、崩壊性および放射状ひずみを測定するための高周波超音波システムの使用のための実用的なガイドとステップバイステッププロトコルを提供します。プロトコルは、特定の超音波画像診断機器および付属のビデオチュートリアル用のマニュアルによって提供される基本情報と組み合わせて使用されるべき技術的なアプローチを提供します。重要なことに、私たちの手の中で説明されたイメージングプロトコルは、実験的なAAAの開発と進行の研究において価値があるように見える再現性と正確なデータを提供します。

超音波画像の有用性をさらに実証するために、我々は実験的なAAA¹¹を防止するための薬理学的アプローチを用いて、我々自身の研究から得られた例の画像と測定値を提供する。具体的には、ノッチシグナル伝達は、血管発生および炎症¹²の複数の側面に関与することが提案されている。遺伝子ハプロ不全および薬理学的アプローチを用いて、我々は、これまでに、血管損傷部位におけるマクロファージの浸潤を防止することにより、ノッチ阻害がマウスにおけるAAAの発症を減少させることを実証した^{13、14、15。}現在の記事では、ノッチ阻害のための薬理学的アプローチを使用して、大動脈剛性とAAAに関連する要因との関係に焦点を当てています。これらの研究は、ノッチ阻害が大動脈剛性を減少させることを示しており、これはAAA進行¹¹の尺度である。

プロトコル

マウスの取り扱いおよび超音波画像処理のためのプロトコルは、ミズーリ大学の動物ケアおよび使用委員会(動物プロトコル番号8799)によって承認され、AAALACインターナショナルに従って行われた。

1. マウスの装置のセットアップと準備

1. 機器のセットアップ
   1. 超音波器具、超音波ゲルウォーマー、加熱パッドをオンにします。
   2. 超音波プログラムを開き、各マウスの研究名と説明情報を入力します。
   3. アプリケーションを[一般イメージング] として選択します。
   4. 腹部イメージングに適したトランスデューサを選択します(図1B,C)。この実験では、MS400トランスデューサを使用します。
   5. 麻酔イソファレインと酸素レベルが各実験セッションに適していることを確認します。
   6. 超音波動物イメージングプラットフォームをきれいにします。
2. マウスの準備
   1. マウスケージを加熱パッドの上に置きます(36.5~38.5 °C)。
   2. マウスを尾部で静かに保持し、酸素で満たされたイソファランチャンチャンに入れます。
   3. イソファフルランと酸素の流れを誘導室に向けます。
   4. イソファフルラン気化器をオンにし、イソファフルランレベルを1-2%vol/volに設定します。
   5. 〜2分後、マウスの足パッドをつまんだ際の離脱反射反射の欠如によって麻酔の適切な深さを確認する。
   6. 次に、誘導室供給分岐をオフにし、麻酔ノーズコーンに向けられた分岐をオンにします。
   7. マウスを誘導室から超音波画像処理段階に移し、麻酔のコーンを動物の鼻の上に置く。
   8. 動物のイメージングプラットフォームを右下隅に10°回して傾けると、最適なスキャンが可能になります(図1B)。
   9. 麻酔下での乾燥を防止するためにマウスの両眼に無菌眼科液を1滴入れる。
   10. マウスを麻酔コーンに挿入して、鼻を置いて、上向きの位置にマウスを置きます。
   11. 綿棒を使用して4本の足すべてに電極ゲルを塗布し、心電図の読み取り用の動物イメージングプラットフォーム上の銅リードに足をテープで貼ります(図1C)。
   12. バリカンを使用してイメージングサイトで髪を剃り、脱毛クリームを塗って残りの毛皮を取り除きます。1分未満で放置します。
   13. クリームと髪を湿ったペーパータオルで軽く拭き取ります。
   14. 呼吸を監視し、心拍数が450〜550拍/分の間に維持されていることを確認してください。このレベルを下回る場合は、イソファフルランの流れを減らし、心拍数が回復するまで待ちます。
   15. 調製した皮膚部位にプレウォート超音波ゲル(37°C)を塗布し、トランスデューサーをホルダーに取り付け、ゲルに触れるまで下げます(図1C)。

2. 腹部大動脈の超音波画像

1. トランスデューサを水平に配置します(マウスの中線に垂直)。
2. 超音波ゲルを滑らかにし、綿棒の木の棒を使用して気泡を除去します。
3. トランスデューサを下げ、ジェルに触れた後、横隔膜の下に0.5〜1cm置きます。今、画像を観察するために開始します。
4. 腹部大動脈を短軸図で可視化する (図1C)。
   注:Bモードは、解剖学的に大オータを見つけ、トランスデューサを配置するためのデフォルトで最も効果的なモードです。腹部大動脈は、短軸(すなわち、大動脈の円周断面)における色ドップラーおよびパワードップラーモードを使用して拍動流の存在によって識別される。動物のステージとトランスデューサのマイクロマニピュレータを調整して、大動脈の断面を画像の中心に移動します。
5. トランスデューサーを時計回りに90°回転させ、x軸マイクロマニピュレータノブをゆっくりと調整して、大動脈を長軸ビュー(大動脈の縦断面)で視覚化します。
   注:多くの場合、胃腸ガスが画像に干渉したり、大腸が最適な角度で明確な長軸ビューを可能にしないことがあります。許容長軸ビューが得られるまで、トランスデューサの角度をゆっくりと水平に調整します。問題が解決しない場合は、トランスデューサを高くし、トランスデューサーの下の気泡を確認し、動物ステージの傾き角度を少し調整し、ゲルを再適用し、すべてのステップを再度繰り返します。
6. フォーカスゾーンとフォーカス深度の切り替えボタンを使用して、大オータの領域にフォーカスゾーンと深度を設定します。大オルタ壁の最適なコントラストを達成するために、大オルタのルーメンを暗くするために手動でタイムゲイン補正スライダーを調整します。
7. y軸マニピュレータを調整して、上位の腸間膜と右腎動脈の分岐点を視覚化します。右腎動脈をランドマークとして使用して、上膜大動脈の画像を撮ります(図2A)。
8. Bモード画像の少なくとも100フレームを、上の大小節に記録します。
9. シネストアを押してBモード画像を保存します。
10. インストゥルメントキーボードのMモードボタンを押して、Mモード録音を有効にします。カーソルボールを転がして、黄色のインジケータラインを透明な血管壁画像を持つ通常の大動脈セクション、または動脈瘤の最大直径が観察されるセクションに移動します。
11. SV/ゲートトグルを押し、カーソルボールを調整して、容器の壁が測定ブラケットに含まれていることを確認します。更新ボタンを押して M モードの測定値を記録し、シネストアを押してキャプチャします (図 2A,B)。
    注:動脈瘤の最大直径は、大動脈の最適な長軸図と同じイメージング面にあってはなりません。各Mモード測定のX軸マニピュレータノブを少し調整して、各セクションのMILDがキャプチャされるようにします。
12. ECG ゲート付きキロヘルツ ビジュアリゼーション (EKV) イメージを取得するには、B モードボタンを押して B モード記録に戻ります。
    注: イメージがシャープでない場合は、X 軸マニピュレータを調整して、セクションの長さ (> 6 mm) のルーメンの上壁の最もシャープなイメージを得ます。
13. キーボードのPhysio設定ボタンを押し、[呼吸のギャート]を選択します。呼吸波の平坦な部分の間にのみデータを記録するために、手動でゲラティング遅延とウィンドウを調整します。録音セクションは、呼吸波のトレースに色付きのブロックとして表示されます。
    注:呼吸のゲラティングの調節なしで、EKVイメージは呼吸の間に動物の正常な動きのためにぼやけます。
14. EKVボタンを押してEKVモードを有効にします。適切なメニューで、[標準解像度とフレームレート 3000 以上] を選択します。EKV 画像を記録するには、次の手順を選択します。画像を保存するには、シネストアを押します。EKVモード画像を使用して、パルス伝播速度(PPV)、解圧および放射歪の測定を取得します。
    注: 呼吸に異常な変動がある場合、動物が呼吸が速すぎる、フレームレートの設定が高すぎる場合、EKV記録が失敗する可能性があります。その場合は、フレームレートを低く設定し、動物の呼吸が安定するのを待つ。フレームレートを3000に設定することは、通常、マウスおよびラットの両方に適しています。

3. ポストイメージング手順

1. マウスの腹部から超音波ゲルを、ぬるま湯で湿らせたペーパータオルで軽く拭きます。
2. マウスをヒーターパッドのホームケージに戻します。
3. イソファフルランマシンの電源を切り、動物のイメージングプラットフォームとトランスデューサを湿らせたワイプできれいにします。
4. 超音波スキャン中に収集した画像データをハードドライブに転送します。
5. 超音波装置の電源を切ります。
6. マウスが麻酔から回復し、警告された後、加熱パッドを取り外し、ケージを動物のハウジングラックに戻します。

4. 腹部大動脈画像の分析

1. MILDを測定するためのMモード画像の解析
   1. 超音波プログラムを開き、各マウスの研究名と説明情報を入力します。
   2. 超音波データを解析ソフトウェアで開き、Mモード画像を開いて、心拍を一時停止します。
   3. [計測] をクリックします。
   4. ドロップダウンオプションから血管パッケージを選択します。[深度]をクリックし、内壁から壁まで延びる大動脈のルーメンに線を引きます(図2C,D)。
      注:一貫性のために、測定は大オータが最大に拡大されたときに心周期の収縮期に取られるべきです。3つの異なるハートビートに3本の線を引き、MILDの正確で平均測定を得ます。AAAでは、測定は大オータの最大拡張で行われる。また、腸の運動性からの干渉を避け、画像の明瞭さを確保するために画像を収集する前に、動物4-6時間を速くすることをお勧めします。
2. パルス伝播速度(PPV)の解析
   1. EKV イメージを開き、ハートビートを一時停止します。
   2. 名前アイコンをクリックして、解析ソフトウェアの新しいウィンドウ(Vevo Vacなど)を開きます。
   3. PPV オプション(図 3D の矢印) をクリックします。さらに、大オータの画像とともに小さなウィンドウが表示されます。
   4. 上部の容器の壁をクリックし、上の大オータの壁の両方を覆う約4mmのポインタをドラッグして、長方形のボックスを描きます。
      メモ:すべての画像に対して、ボックスの長さを一定の長さ(4 mm)にしてください。ユーザーは、ボックスを整列するように回転し、ラインを選択し、分析されている容器上の新しい位置にドラッグして、脈波の最も適切で明確な変曲を得ることによって長方形のボックスを調整することができます。長方形のデータの垂直線が表示され、ROI 上で左(上の画像)と右(下の画像)として識別されます。脈波の変曲をより良く可視化するために、図3に示すように、上壁の描画ボックスにのみ役立つ場合があります。ソフトウェアは自動的にPPV(m/s)を計算します。しかし、常に手動でパルス波の正確な変曲点を設定するために紫色の線を調整する方が良いですし、PPVはそれに応じて変化します。
   5. 最後に、[Accept]コマンドを選択して PPV 値を保存します。図とデータをデータストレージドライブにエクスポートします。
3. 溶解性と放射状ひずみの解析
   1. EKV イメージを開き、ハートビートを一時停止します。
   2. ソフトウェアアイコンをクリックします。ソフトウェアは新しいウィンドウを開きます。
   3. トレース新しいROIをクリックし、容器の両方の壁に長方形のボックスを描きます。ソフトウェアは自動的に容器の上部および下壁を追跡する。ユーザーは、緑色の点をクリックして壁に合わせてトレースを調整できます (図 4A,B)。
   4. トレースを受け入れます。ソフトウェアは、選択したROIの分解性(1/Mpa)を計算します。
   5. 放射状ひずみの測定では、左上のメニュー バーから適切なひずみオプションを選択します。放射状ひずみおよび接線ひずみの画像が開きます。
   6. 放射ひずみの値を取得する(%)曲線の頂点にカーソルを移動することによって。データを画像またはビデオ形式でエクスポートします (図 4A,B)。

結果

マウス由来の正常および動脈瘤腹部大動脈の代表的なMモード画像は、それぞれ図2Aおよび図2Bに示される。腹部大動脈は右腎動脈と上腸間膜動脈の隣の位置によって識別されます(図2A)。MILDの計算に用いられる代表的な画像は、収縮期心周期の3つの異なる心拍において、正常および動脈?...

ディスカッション

超音波画像は、PPV、溶解性および放射状ひずみの測定を通じて大小数の機能的特性を決定するための強力な技術を提供する。これらの測定は、AAAのマウスモデルを研究するために特に有益であり、in vivoアプローチは、大動脈病理の時間的発達を理解するために潜在的に重要である縦方向のデータの収集を可能にする。具体的には、インビボ大動脈剛性の測定は、PPVによって腹部大動脈におい...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics