מדידה של מהירות הפצת הדופק, Distensibility והזן במודל מפרצת של אבי העורקים הבטני

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה כדי למדוד את קוטר הלומיאל, מהירות הפצת הדופק, התדירות ואת זן רדיאלי על מודל העכבר של מפרצת אבי העורקים הבטן.

Abstract

מפרצת הבטן של אבי העורקים (AAA) מוגדר כמו התרחבות מקומי של אבי העורקים הבטני החורג קוטר intraluminal המקסימלי (מתון) על ידי 1.5 פעמים של הגודל המקורי שלה. מחקרים קליניים וניסיוניים הראו כי אניואמים קטנים עלולים להיקרע, בעוד שאוכלוסיית המשנה של האניוציה הגדולה עלולה להישאר יציבה. כך, בנוסף למדידה של קוטר intraluminal של אב העורקים, הידע של תכונות מבניות של הקיר כלי עשוי לספק מידע חשוב כדי להעריך את היציבות של ה-AAA. היצרות אבי העורקים התפתחה לאחרונה ככלי אמין כדי לקבוע שינויים מוקדמים בקיר כלי הדם. מהירות הפצת הדופק (PPV) יחד עם הלחץ הרדיאלי ואת הזנים הרדיאליים שימושיים מאוד מבוססי אולטרסאונד שיטות רלוונטיות להערכת נוקשות אבי העורקים. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לספק טכניקה מקיפה לשימוש במערכת הדמיה אולטרסאונד כדי לרכוש תמונות ולנתח את המאפיינים הקונסטרוקטיבי ופונקציונלי של העורקים כפי שנקבע על ידי מתון, PPV, דיאנאואליות ומאמץ רדיאלי.

Introduction

מפרצת אב העורקים הבטן (AAA) מייצגת מחלה משמעותית לב וכלי דם המאופיינת התרחבות קבע מקומי של אבי העורקים העולה על קוטר הספינה המקורית על ידי 1.5 פעמים¹. מדרג AAA בין 13 הגורמים העליונים לתמותה בארצות הברית². ההתקדמות של AAA מיוחסת לניוון של קיר אבי העורקים ושולי אלסטין, בסופו של דבר המוביל לקרע של אבי העורקים. שינויים אלה בחומת אבי העורקים עשויים להתרחש ללא גידול משמעותי בקוטר intraluminal המקסימלי (מתון), ובכך רומז כי מתון לבד אינו מספיק כדי לנבא את חומרת המחלה³. לכן, גורמים נוספים צריכים להיות מזוהים כדי לזהות שינויים ראשוניים בקיר אבי העורקים, אשר עשוי להנחות אפשרויות טיפול מוקדם. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק מדריך מעשי עבור הערכת תכונות פונקציונליות של אבי העורקים באמצעות הדמיה אולטרסאונד כפי שמאופיין במידות של מהירות הפצת הדופק (PPV), דיאנאואליות ומאמץ רדיאלי.

מודל ניסיוני היטב ללמוד AAA, שתוארו לראשונה על ידי דוהרטי ועמיתים, כרוך עירוי תת עורית של אנגיוטנסין II (אנגיוi) באמצעות משאבות אוסמוטי ב -apoe^-/- עכברים⁴. מדידה מדויקת של מתון באמצעות דימות אולטרסאונד היה אינסטרומנטלי באפיון AAA בעכבר זה דגם⁵. למרות שינויים היסטלוגיים במהלך הפיתוח של AAA נחקרו בהרחבה, שינויים במאפיינים הפונקציונליים של קיר כלי הקיבול כגון קשיות אבי העורקים לא מאופיינים היטב. פרוטוקול זה מדגיש את השימוש באולטרסאונד בתדר גבוה בשילוב עם הניתוחים המתוחכמים כמו כלים רבי-עוצמה ללימוד ההתקדמות הטמפורלית של AAA. באופן ספציפי, גישות אלה מאפשרות לנו להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של הקיר כלי כפי שנמדד על ידי PPV, דינוהסבירות ומאמץ רדיאלי.

מחקרים קליניים שנעשו לאחרונה במקצועות האדם עם aaa, כמו גם במודל מורנה elastase מושרה aaa, מציע קורלציה חיובית בין קשיות אבי העורקים ואת קוטר אבי העורקים^6,7. Ppv, מחוון של קשיות אבי העורקים, מקובל כמדידה מצוינת עבור כימות שינויים נוקשות בקיר ספינה^6,8. PPV מחושב על ידי מדידת זמן המעבר של גל הדופק בשני אתרים לאורך ואצלב, ובכך לספק הערכה אזורית של קשיות אבי העורקים. הדגמנו לאחרונה כי מוגבר הקשיחות האבי העורקים כפי שנמדד על ידי PPV, וברמה התאית כפי שנקבע באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, התואם באופן חיובי עם פיתוח מפרצת⁹. יתר על כן, הספרות מציעה כי נוקשות האבי העורקים יכול לפני התרחבות אנאוריפרי ובכך עשוי לספק מידע שימושי על המאפיינים הפנימיים האזוריים של הקיר כלי במהלך הפיתוח של AAA¹⁰. באופן דומה, התקשות ומדידות זן הם כלי כימות למדוד שינויים מוקדם יותר של כושר העורקים. עורקים בריאים הם גמישים אלסטי, בעוד עם נוקשות מוגברת ואלסטיות פחות, דיאנאואואואוזן וירידה. כאן, אנו מספקים מדריך מעשי וצעד אחר צעד פרוטוקול לשימוש במערכת אולטרסאונד בתדר גבוה כדי למדוד תון, PPV, דיאנאואליות ומאמץ רדיאלי של עכברים. הפרוטוקול מספק גישות טכניות שיש להשתמש בהן יחד עם המידע הבסיסי המסופק על-ידי מדריכים עבור מכשירי דימות אולטרסאונד ספציפיים ולימוד הווידאו הנלווה. וחשוב מכך, בידינו פרוטוקול הדימות המתואר מספק נתונים מדויקים ומדוייקים הנראים יקרי ערך בחקר הפיתוח וההתקדמות של AAA ניסיוני.

כדי להדגים עוד יותר את השירות של הדמיה אולטרסאונד, אנו מספקים לדוגמה תמונות ומדידות נלקח מתוך מחקרים שלנו מכוון באמצעות גישות פרמקולוגית למניעת ניסיוני AAA¹¹. במיוחד, איתות חריץ הוצע להיות מעורב היבטים מרובים של פיתוח כלי דם ודלקת¹². באמצעות הגן haploinsufficiency חסור וגישות פרמקוקולוגי, הדגמנו בעבר כי עיכוב חריץ מפחית את התפתחותם של AAA בעכברים על ידי מניעת חדירת מקרופאגים באתר של פציעה וסקולרית^13,14,15. עבור המאמר הנוכחי, באמצעות גישה תרופתי עבור עיכוב חריץ אנו מתמקדים בקשר בין קשיות אבי העורקים וגורמים הנוגעים AAA. מחקרים אלה מדגימים כי העיכוב חריץ מפחית את הקשיות של אבי העורקים, שהוא מדד של התקדמות AAA¹¹.

Protocol

הפרוטוקול לטיפול בעכברים והדמיה אולטרסאונד אושרה על ידי הוועדה לטיפול בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מיזורי והשתמש ועדת (פרוטוקול בעלי חיים מספר 8799) והוא נערך על פי AAALAC אינטרנשיונל.

1. התקנת ציוד והכנת עכברים

1. התקנת ציוד
   1. הפעל את מכשיר האולטרסאונד, מחמם ג'ל אולטרה סאונד וכרית החימום.
   2. פתח את תוכנית האולטרסאונד והזן את שם המחקר והמידע התיאורי עבור כל עכבר.
   3. בחר את היישום כהדמיה כללית.
   4. בחר את התמר המתאים לדימות הבטן (איור 1ב, ג). בניסוי זה, מתמר MS400 משמש.
   5. להבטיח isofהרדמה ורמות החמצן מספיקים עבור כל מפגש ניסיוני.
   6. נקה את פלטפורמת ההדמיה בעלי חיים אולטרה סאונד.
2. הכנה לעכבר
   1. מניחים את כלוב העכבר על גבי משטח חימום (36.5 עד 38.5 ° c).
   2. החזיקו בעדינות את העכבר על-פני בסיס הזנב שלו והניחו בחדר החמצן המלא.
   3. . וזרימת החמצן לחדר האינדוקציה
   4. הפעילו את מכשיר האידוי וקבעו את רמת isof, כדי 1-2% vol/vol. הפעל את לחץ מיכל החמצן ל 1-2 L/min.
   5. לאחר ~ 2 דקות, לאשר את העומק המתאים של הרדמה על ידי העדר רפלקסים נסיגה עם צובט את משטח כף הרגל של העכבר.
   6. לאחר מכן, לכבות את ענף האספקה החדר אינדוקציה ולהפעיל את הענף מכוון לחרוט האף הרדמה.
   7. להעביר את העכבר מחדר אינדוקציה לשלב הדמיה אולטרסאונד ומיקום חרוט ההרדמה מעל האף של החיה.
   8. הטה את פלטפורמת ההדמיה בעלי חיים בסביבות 10 ° לפינה הימנית התחתונה לסריקה אופטימלית (איור 1B).
   9. שים טיפה אחת של פתרון אופטלמולוגי סטרילי בשתי העיניים של עכברים כדי למנוע ייבוש בהרדמה.
   10. למקם את העכבר במצב פרקדן עם האף שלו מוכנס לתוך קונוס ההרדמה.
   11. החל את ג'ל האלקטרודה על כל ארבע כפות הידיים בעזרת משטח כותנה והדבק את כפות הרגליים אל מוביל הנחושת על פלטפורמת ההדמיה בעלי חיים עבור קריאות אלקטרוג (איור 1ג).
   12. השתמש קוצץ לגלח את השיער באתר ההדמיה ולאחר מכן להחיל קרם דפילציה כדי להסיר את הפרווה הנותרת. . לעזוב במשך פחות מ-1 דקות
   13. נגב בעדינות את השמנת והשיער עם מגבת נייר לחה.
   14. נטר את הנשימה וודא שקצב הלב נשמר בין 450-550 פעימות/דקות. אם מתחת לרמה זו, להקטין את זרימת isofלאנה ולחכות עד קצב הלב מתאושש.
   15. החלת ג'ל prewarmed מראש (37 ° c) לאתר העור המוכן וחברו את התמר למחזיק בו והנמך עד שייגע בג (איור 1ג).

2. אולטראסאונד הדמיה של אבי העורקים הבטני

1. הצב את המיתמר אופקית (כלומר, בניצב לקו האמצע של העכבר).
2. להחליק את ג'ל אולטרה סאונד ולהסיר בועות באמצעות מקל עץ של מספוגית כותנה.
3. הנמך את מתמר ומקום 0.5-1 ס מ מתחת לסרעפת לאחר נגיעה ג'ל. . עכשיו תתחיל להתבונן בתמונות
4. דמיינו את אבי העורקים הבטני בתצוגת הציר הקצר (איור 1ג).
   הערה: B-mode הוא מצב ברירת המחדל והיעיל ביותר כדי לאתר את אב העורקים ולמקם את מתמר. העורקים הבטן מזוהה על ידי נוכחות של זרימה פועמת באמצעות צבע דופלר ומצבי דופלר כוח בציר הקצר (כלומר, חתך הרוחב של אבי העורקים). כוונן את המיקרומניפולציה על במת החיות והתמר כדי להביא את חתך העורקים למרכז התמונה.
5. סובב בעדינות את מתמר 90 ° עם כיוון השעון, ולאחר מכן התאם לאט את כפתור המיקרומניפולציה בציר x כדי להמחיש את העורקים בתצוגת ציר ארוך (חלק אורכי של העורקים).
   הערה: במקרים רבים, גזי העיכול עלולים להפריע לתמונה, או שהעורקים לא יהיו בזווית האופטימלית כדי לאפשר תצוגת ציר ארוכה וברורה. התאימו את זווית התמר באיטיות ובמאוזן עד להשגת תצוגה מקבילה של ציר ארוך. אם הבעיות נמשכות, להעלות את מתמר, לבדוק בועות אוויר תחת מתמר, להתאים מעט את זווית הטיית הבמה בעלי חיים, להחיל מחדש ג ' לים, ולחזור על כל השלבים שוב.
6. הגדר את אזור המיקוד ואת העומק באזור של העורקים באמצעות אזור המיקוד והתמקד במצב מעבר בין מעבר, בהתאמה. להתאים את המחוון פיצוי הזמן באופן ידני כדי להכהות את לומן העורקים כדי להשיג ניגודיות אופטימלית של הקיר של העורקים.
7. התאימו את מניפולטור ה-y כדי להמחיש את נקודות ההסתעפות של מצע העליון ואת עורקי הכליה הימניים. השתמש בעורק הכליה הימני כנקודת ציון כדי ללכוד את התמונה של העורקים האופריאני (איור 2א).
8. שיא לפחות 100 מסגרות של תמונות במצב B על אב העורקים של הפרארנאל.
9. הקש cinestore כדי לשמור את התמונות במצב B.
10. לחץ על כפתור M-mode במקלדת המכשיר כדי לאפשר הקלטה במצב M. לגלגל את הכדור הסמן כדי להביא את קו המחוון הצהוב לסעיפים אב העורקים רגיל עם תמונת קיר ברור הספינה, או לסעיפים שבהם הקוטר המקסימלי של מפרצת הוא נצפתה.
11. לחץ על המקש SV/gate והתאם את כדור הסמן כדי לוודא שקירות כלי הקיבול נכללים במסגרת הכן המדידה. לחץ על עדכון כדי להקליט מדידות מצב M ולחץ על cinestore ללכוד (איור 2א, ב).
    הערה: הקוטר המקסימלי של המפרצת אינו יכול להיות באותו מישור דימות כמו התצוגה האופטימלית של הציר הארוך של העורקים. התאימו מעט את כפתור הניפולטור של ציר ה-x לקבלת כל מדידה של מצב M כדי לוודא שהמתון של כל מקטע נלכד.
12. כדי להשיג תמונות ויזואליזציה מגודרת של קילוהרץ (EKV), לחץ על הלחצן b-mode כדי לחזור להקלטה ממצב b.
    הערה: אם התמונות אינן חדות, התאימו את מניפולטור ה-x כדי להשיג את התמונה החדה ביותר של הקיר העליון של לומן מעל אורך מקטע (כלומר, > 6 מ"מ).
13. לחץ על כפתור הגדרות פיזיוo בלוח המקשים ובחר בסדר נשימה. התאם את ההשהיה והחלון באופן ידני כדי לתעד את הנתונים רק במהלך החלקים המעוננים של גל הנשימה. קטעי ההקלטה יוצגו כבלוקים צבעוניים על מעקב של גל הנשימה.
    הערה: ללא התאמת הנשימה, התמונות EKV יהיו מטושטשות בשל התנועה הנורמלית של בעל החיים במהלך הנשימה.
14. לחץ על לחצן ekv כדי להפוך את מצב ה-ekv לזמין. בתפריט המתאים, בחר רזולוציה רגילה וקצב מסגרות 3000 או יותר. בחר באפשרות ' המשך ' כדי להקליט תמונות Ekv. הקש cinestore כדי לשמור את התמונות. השתמש בתמונת מצב EKV כדי להשיג מדידות של מהירות הפצת הפולס (PPV), דיאנליות ומאמץ רדיאלי.
    הערה: הקלטת EKV עלולה להיכשל אם קיימים תנודות חריגות בנשימה, בעל החיים הוא כבוד מהיר מדי, או שהגדרות קצב המסגרות גבוהות מדי. במקרה כזה, הגדר את קצב המסגרות נמוך יותר והמתן עד שהנשמה בעלי החיים תתייצב. הגדרת קצב המסגרות ב-3000 מתאימה בדרך כלל לעכברים וחולדות.

3. שלבים לאחר הדמיה

1. נגב בעדינות את הג האולטרה-סאונד מאזור הבטן של העכבר עם מגבת נייר שהיתה לחלח במים חמים.
2. מניחים את העכבר בכלוב הבית שלו על כרית חימום.
3. כבו את מכונת isof, לנקות את פלטפורמת ההדמיה בעלי חיים מתמר עם מגבונים לחים.
4. העבר את נתוני התמונה שנאספו במהלך סריקת האולטרסאונד לכונן הקשיח.
5. . תכבה את מכשיר האולטרסאונד
6. לאחר העכבר מתאושש הרדמה הוא התראה, להסיר את כרית החימום ולהחזיר את הכלוב למדף הדיור בעלי חיים.

4. ניתוח תמונות אבי העורקים בבטן

1. ניתוח של תמונות מצב M למדוד קל
   1. פתח את תוכנית האולטרסאונד והזן את שם המחקר והמידע התיאורי עבור כל עכבר.
   2. פתח את נתוני האולטרסאונד בתוכנת הניתוח ופתח את התמונה במצב M והשהה את פעימות הלב.
   3. לחץ על מדידות.
   4. בחר בחבילת כלי הדם מהאפשרויות הנפתחות. לחץ על עומק ולצייר קו על פני לומן אבי העורקים הארכת מהקיר הפנימי לקיר (איור 2ג, ד).
      הערה: לצורך עקביות, יש לנקוט את המידות בשלב הסיסטולי של מחזור הלב כאשר העורקים מורחבים באופן מקסימאלי. לצייר שלוש שורות על פני שלושה פעימות לב שונות כדי להשיג מדידות מדויקת וממוצעת של מתון. ב-AAA, המידות מננקטות במהלך הדיגנציה המקסימלית של העורקים. מומלץ גם למהר את בעלי החיים 4-6 h לפני איסוף תמונות כדי למנוע הפרעות תנועתיות המעיים ולהבטיח בהירות התמונה.
2. ניתוח מהירות הפצת הפולס (PPV)
   1. פתח את תמונת ה-EKV והשהה את פעימות הלב.
   2. פתח חלון חדש בתוכנת הניתוח (לדוגמה, Vevo Vac) על-ידי לחיצה על סמל השם.
   3. לחץ על האפשרות Ppv (חץ באיור 3ד). חלון קטן יופיע יותר עם התמונה של העורקים.
   4. לצייר תיבה מלבנית על ידי לחיצה על קיר כלי הקיבול העליון וגרירת המצביע על כ 4 מ"מ כיסוי שני הקירות של אב העורקים של יותרת.
      הערה: שמור על אורך התיבה עקבי (~ 4 מ"מ) עבור כל התמונות. המשתמש יכול להתאים את התיבה מלבני על ידי סיבוב כדי ליישר את התיבה ובחירת הקו ולאחר מכן גרירה למיקום חדש על כלי שנותחו כדי להשיג את הפיתול המתאים ביותר וברור של גל הדופק. הקווים האנכיים של הנתונים מהמלבן יוצגו ויזוהו כשמאל (התמונה העליונה) וימינה (התמונה התחתונה) ב-ROI. להדמיה טובה יותר של פיתול של גל הדופק, זה לפעמים שימושי תיבת לצייר רק על הקיר העליון כפי שמוצג באיור 3. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את ה-PPV (m/s). עם זאת, תמיד עדיף להתאים באופן ידני את הקווים הסגולים כדי להגדיר את נקודת פיתול מדויק על גלי הדופק ו-PPV ישתנה בהתאם.
   5. לבסוף, בחר בפקודה קבל כדי לשמור את ערכי ה-ppv. יצא את האיורים ואת הנתונים לכונן אחסון הנתונים.
3. ניתוח למטרות דיאנאליות ומאמץ רדיאלי
   1. פתח את תמונת ה-EKV והשהה את פעימות הלב.
   2. לחץ על סמל התוכנה. התוכנה תפתח חלון חדש.
   3. לחץ על מעקב חדש ROI ולצייר קופסה מלבנית על שני קירות של כלי. התוכנה תאתר באופן אוטומטי את הקירות העליונים והתחתונים של כלי הקיבול. המשתמש יכול לכוונן את המעקב כדי ליישר על הקיר על ידי לחיצה על נקודות ירוקות (איור 4א, ב).
   4. . עכשיו קבל את הסימן התוכנה יחשב את הסבירות (1/Mpa) ב-ROI שנבחר.
   5. למדידת הנבג הרדיאלי, בחרו באפשרות המתח המתאימה מפסי התפריט שמשמאל. התמונות עבור זן רדיאלי זן הטנגלי יפתח.
   6. השג את הערך עבור זן רדיאלי (%) על-ידי הזזת הסמן בשיא העקומה. יצא את הנתונים כתמונות או בתבנית וידאו (איור 4א, ב).

תוצאות

נציג M-מצב של האבי העורקים רגיל ואנאורילי הבטן מן העכברים מוצגים באיור 2A ו- איור 2B, בהתאמה. העורק הבטן הסופריאני מזוהה על ידי מיקומו ליד עורק הכליה הימני ואת ציר מצע העליון (איור 2א). תמונות מייצגות המשמשות לחישוב של...

Discussion

הדמיה אולטרסאונד מספק טכניקה רבת עוצמה לקביעת תכונות פונקציונלי של העורקים דרך מדידות של PPV, דיאנאואליות ומאמץ רדיאלי. מדידות אלה מאלף במיוחד עבור לימוד העכבר מודלים של AAA ו vivo גישה מאפשר אוסף של נתונים האורך, כי הוא עשוי להיות חשוב כדי להבין את ההתפתחות הטמפורלית של הפתולוגיה של אבי העורק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics