Misurazione della velocità di propagazione dell'impulso, distensiabilità e deformazione in un modello di topo abdominato di aneurisma aortico

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo dell'imaging a ultrasuoni ad alta frequenza per misurare il diametro luminale, la velocità di propagazione degli impulsi, la distensibilità e la tensione radiale su un modello murino di aneurisma aortico addominale.

Abstract

Un aneurisma aortico addominale (AAA) è definito come una dilatazione localizzata dell'aorta addominale che supera il diametro intraluminale massimo (MILD) di 1,5 volte della sua dimensione originale. Studi clinici e sperimentali hanno dimostrato che piccoli aneurismi possono rompersi, mentre una sottopopolazione di grandi aneurismi può rimanere stabile. Così, oltre alla misurazione del diametro intraluminale dell'aorta, la conoscenza dei tratti strutturali della parete del vaso può fornire informazioni importanti per valutare la stabilità dell'AAA. L'irrigidimento aortico è recentemente emerso come uno strumento affidabile per determinare i primi cambiamenti nella parete vascolare. La velocità di propagazione dell'impulso (PPV) insieme alla distensibilità e al ceppo radiale sono metodi a base di ultrasuoni altamente utili rilevanti per valutare la rigidità aortica. Lo scopo principale di questo protocollo è quello di fornire una tecnica completa per l'uso del sistema di imaging a ultrasuoni per acquisire immagini e analizzare le proprietà strutturali e funzionali dell'aorta come determinato da MILD, PPV, distensibilità e deformazione radiale.

Introduzione

Un aneurisma aortico addominale (AAA) rappresenta una significativa malattia cardiovascolare caratterizzata da una dilatazione localizzata permanente dell'aorta che supera il diametro originale del vaso di 1,5 volte¹. AAA è tra le prime 13 cause di mortalità negli Stati Uniti². La progressione dell'AAA è attribuita alla degenerazione della parete aortica e della frammentazione dell'elastina, portando infine alla rottura aortica. Questi cambiamenti nella parete aortica possono verificarsi senza un aumento significativo del diametro intraluminale massimo (MILD), suggerendo così che MILD da solo non è sufficiente per prevedere la gravità della malattia³. Pertanto, è necessario identificare ulteriori fattori per rilevare i cambiamenti iniziali nella parete aortica, che possono guidare le opzioni di trattamento precoce. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una guida pratica per valutare le proprietà funzionali aortiche utilizzando l'imaging aultraora come caratterizzato da misurazioni della velocità di propagazione degli impulsi (PPV), distendibilità e deformazione radiale.

Un modello sperimentale ben caratterizzato per studiare AAA, descritto per la prima volta da Daugherty e colleghi, comporta infusione sottocutanea di angiotensina II (AngII) tramite pompe osmotiche in Apoe^-/- topi⁴. La misurazione precisa di MILD mediante imaging a ultrasuoni è stata determinante nella caratterizzazione dell'AAA in questo modello murino⁵. Anche se i cambiamenti istologici durante lo sviluppo di AAA sono stati ampiamente studiati, i cambiamenti nelle proprietà funzionali della parete del vaso come la rigidità aortica non sono stati ben caratterizzati. Questo protocollo enfatizza l'uso degli ultrasuoni ad alta frequenza in combinazione con le sofisticate analisi come potenti strumenti per studiare la progressione temporale dell'AAA. In particolare, questi approcci ci permettono di valutare le proprietà funzionali della parete del vaso misurate da PPV, distensibilità e deformazione radiale.

Recenti studi clinici su soggetti umani con AAA, così come nel modello AAA indotta da murasi elastasi, suggeriscono una correlazione positiva tra rigidità aortica e diametro aortico^6,7. PPV, un indicatore di rigidità aortica, è accettato come un'ottima misura per quantificare i cambiamenti di rigidità nella parete del vaso^6,8. Il PPV viene calcolato misurando il tempo di transito della forma d'onda dell'impulso in due siti lungo la vascolatura, fornendo così una valutazione regionale della rigidità aortica. Recentemente abbiamo dimostrato che una maggiore rigidità aortica misurata dal PPV, e a livello cellulare come determinato utilizzando la microscopia a forza atomica, è positivamente correlata allo sviluppo dell'aneurisma⁹. Inoltre, la letteratura suggerisce che la rigidità aortica può precedere la dilatazione aneurismica e quindi può fornire informazioni utili sulle proprietà intrinseche regionali della parete del vaso durante lo sviluppo di AAA¹⁰. Allo stesso modo, le misure di distensibilità e deformazione sono gli strumenti di quantificazione per misurare i precedenti cambiamenti della forma fisica arteriosa. Le arterie sane sono flessibili ed elastiche, mentre con una maggiore rigidità e meno elasticità, la distensibilità e lo sforzo diminuiscono. Qui, forniamo una guida pratica e un protocollo passo dopo passo per l'uso di un sistema ad ultrasuoni ad alta frequenza per misurare MILD, PPV, distensibilità e deformazione radiale nei topi. Il protocollo fornisce approcci tecnici che dovrebbero essere utilizzati in combinazione con le informazioni di base fornite dai manuali per specifici strumenti di imaging ad ultrasuoni e il video tutorial di accompagnamento. È importante sottolineare che nelle nostre mani il protocollo di imaging descritto fornisce dati riproducibili e accurati che appaiono preziosi nello studio dello sviluppo e della progressione dell'AAA sperimentale.

Per dimostrare ulteriormente l'utilità dell'imaging a ultrasuoni, forniamo immagini di esempio e misurazioni prese dai nostri studi volti a utilizzare approcci farmacologici per prevenire l'AAA¹¹sperimentale. In particolare, la segnalazione della tacca è stata proposta per essere coinvolta in molteplici aspetti dello sviluppo vascolare e dell'infiammazione¹². Utilizzando aploinsufficienza genica e approcci farmacologici, abbiamo dimostrato in precedenza che l'inibizione di Notch riduce lo sviluppo di AAA nei topi prevenendo l'infiltrazione dei macrofagi nel sito della lesione vascolare^13,14,15. Per l'articolo corrente, utilizzando l'approccio farmacologico per l'inibizione di Notch ci concentriamo sulla relazione tra rigidità aortica e fattori relativi all'AAA. Questi studi dimostrano che l'inibizione di Notch riduce la rigidità aortica, che è una misura della progressione AAA¹¹.

Protocollo

Il protocollo per la manipolazione dei topi e l'imaging ad ultrasuoni è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Missouri (numero 8799) ed è stato condotto secondo AAALAC International.

1. Impostazione e preparazione dell'attrezzatura dei topi

1. Configurazione dell'attrezzatura
   1. Accendere lo strumento ad ultrasuoni, il riscaldatore ad ultrasuoni e il pad di riscaldamento.
   2. Aprire il programma di ultrasuoni e inserire il nome dello studio e le informazioni descrittive per ogni mouse.
   3. Selezionare l'applicazione come Imaging generale.
   4. Scegliere il trasduttore appropriato per l'imaging addominale (Figura 1B,C). In questo esperimento viene utilizzato il trasduttore MS400.
   5. Assicurarsi che i livelli di anestesia isoflurane e ossigeno siano adeguati per ogni sessione sperimentale.
   6. Pulire la piattaforma di imaging degli animali ad ultrasuoni.
2. Preparazione del mouse
   1. Posizionare la gabbia del topo sopra una piastra di riscaldamento (da 36,5 a 38,5 gradi centigradi).
   2. Tenere delicatamente il topo per la sua base di coda e posizionare nella camera di isoflurane riempita di ossigeno.
   3. Dirigere il flusso di isoflurane e ossigeno alla camera di induzione.
   4. Accendere il vaporizzatore isoflurano e impostare il livello di isoflurane a 1-2% vol/vol.
   5. Dopo 2 min, confermare l'adeguata profondità di anestesia per l'assenza di riflessi di ritiro dopo aver pizzicando il piede pad del mouse.
   6. Successivamente, spegnere il ramo di alimentazione camera di induzione e accendere il ramo diretto al cono naso anestesia.
   7. Trasferire il mouse dalla camera di induzione allo stadio di imaging ad ultrasuoni e posizionare il cono di anestesia sul naso dell'animale.
   8. Inclinare la piattaforma di imaging degli animali di circa 10 gradi nell'angolo in basso a destra per una scansione ottimale (Figura 1B).
   9. Mettere una goccia di soluzione oftalmica sterile in entrambi gli occhi dei topi per evitare l'essiccazione in anestesia.
   10. Posizionare il mouse in posizione supina con il naso inserito nel cono di anestesia.
   11. Applicare il gel elettrodo su tutte e quattro le zampe utilizzando un tampone di cotone e nastro adesivo le zampe ai cavi di rame sulla piattaforma di imaging animale per letture di elettrocardiogramma (Figura 1C).
   12. Utilizzare i clipper per radere i capelli nel sito di imaging e quindi applicare la crema depilatoria per rimuovere la pelliccia rimanente. Lasciare agire per meno di 1 min.
   13. Asciugare delicatamente la panna e i capelli con un tovagliolo di carta umido.
   14. Monitorare la respirazione e assicurarsi che la frequenza cardiaca sia mantenuta tra 450-550 battiti/min. Se al di sotto di questo livello, ridurre il flusso di isoflurane e attendere fino a quando la frequenza cardiaca recupera.
   15. Applicare il gel ultrasonico preriscaldato (37 gradi centigradi) al sito della pelle preparato e attaccare il trasduttore al suo supporto e abbassare fino a toccare il gel (Figura 1C).

2. Immagini ad ultrasuoni dell'aorta addominale

1. Posizionare il trasduttore orizzontalmente (cioè perpendicolare alla linea mediana del mouse).
2. Ammorbidire il gel ad ultrasuoni e rimuovere le bolle utilizzando il bastoncino di legno di un tampone di cotone.
3. Abbassare il trasduttore e posizionare 0,5 - 1 cm sotto il diaframma dopo aver toccato il gel. Ora inizia a osservare le immagini.
4. Visualizzare l'aorta addominale nella vista dell'asse corto (Figura 1C).
   NOTA: La modalità B è la modalità predefinita ed efficace per individuare anatomicamente l'aorta e posizionare il trasduttore. L'aorta addominale è identificata dalla presenza di flusso pulsatile utilizzando colore Doppler e modalità Doppler di potenza nell'asse corto (cioè, la sezione circumferenziale dell'aorta). Regolare i micromanipolatori sullo stadio animale e il trasduttore per portare la sezione trasversale dell'aorta al centro dell'immagine.
5. Ruotare delicatamente il trasduttore di 90 gradi in senso orario e regolare lentamente la manopola del micromanipolatore dell'asse x per visualizzare l'aorta in vista dell'asse lungo (sezione longitudinale dell'aorta).
   NOTA: In molti casi, i gas gastro-intestinali possono interferire con l'immagine o l'aorta potrebbe non essere all'angolo ottimale per consentire una chiara vista dell'asse lungo. Regolare l'angolo del trasduttore lentamente e orizzontalmente fino a ottenere una vista accettabile dell'asse lungo. Se i problemi persistono, elevare il trasduttore, verificare la presenza di bolle d'aria sotto il trasduttore, regolare leggermente l'angolo di inclinazione dello stadio animale, riapplicare i gel e ripetere tutti i passaggi.
6. Impostare la zona di messa a fuoco e la profondità nell'area dell'aorta utilizzando rispettivamente l'opzione Area di messa a fuoco e Profondità messa a fuoco. Regolare manualmente il cursore di compensazione guadagno di tempo per scurire il lume dell'aorta per ottenere un contrasto ottimale della parete dell'aorta.
7. Regolare il manipolatore dell'asse y per visualizzare i punti di ramificazione del mesenterico superiore e le arterie renali giuste. Utilizzare l'arteria renale giusta come punto di riferimento per catturare l'immagine dell'aorta suprarenale (Figura 2A).
8. Registra almeno 100 fotogrammi di immagini in modalità B sull'aorta suprarenale.
9. Premere cinestore per salvare le immagini in modalità B.
10. Premere il tasto M-mode sulla tastiera dello strumento per abilitare la registrazione in modalità M. Rotolare la sfera cursore per portare la linea dell'indicatore giallo a una normale sezione aorta con immagine chiara della parete del vaso, o nelle sezioni in cui si osserva il diametro massimo dell'aneurisma.
11. Premere l'interruttore SV/gate e regolare la sfera del cursore per assicurarsi che le pareti della nave siano incluse nella staffa di misurazione. Premere update per registrare le misure in modalità M e premere cinestore per acquisire (Figura 2A,B).
    NOTA: il diametro massimo dell'aneurisma potrebbe non trovarsi nello stesso piano di imaging della vista ottimale dell'asse lungo dell'aorta. Regolare leggermente la manopola del manipolatore dell'asse x per ogni misurazione in modalità M per assicurarsi che il MILD di ogni sezione venga catturato.
12. Per ottenere immagini ECG-gated Kilohertz Visualization (EKV), premere il pulsante B-mode per tornare alla registrazione in modalità B.
    NOTA: se le immagini non sono nitide, regolare il manipolatore dell'asse x per ottenere l'immagine più nitida della parete superiore del lume su una lunghezza di sezione (ad esempio, > 6 mm).
13. Premere il pulsante Physio Settings sulla tastiera e selezionare Respiration Gating. Regolare manualmente il ritardo di gating e la finestra per registrare i dati solo durante le parti più piatte dell'onda respiratoria. Le sezioni di registrazione saranno mostrate come blocchi colorati sul tracciamento dell'onda respiratoria.
    NOTA: Senza la regolazione della respirazione gating, le immagini EKV saranno sfocate a causa del normale movimento dell'animale durante la respirazione.
14. Premere il pulsante EKV per attivare la modalità EKV. Nel menu appropriato, selezionate Risoluzione standard e frequenza fotogrammi 3000 o superiore. Selezionare Procedi per registrare le immagini EKV. Premere cinestore per salvare le immagini. Utilizzare l'immagine in modalità EKV per ottenere misurazioni della velocità di propagazione dell'impulso (PPV), della distensibilità e della deformazione radiale.
    NOTA: la registrazione EKV potrebbe non riuscire se ci sono fluttuazioni anomale nella respirazione, gli animali stanno rispiondo troppo rapidamente o le impostazioni della frequenza fotogrammi sono troppo alte. In questi casi, impostare la frequenza fotogrammi più bassa e attendere che la respirazione animale si stabilizzi. L'impostazione della frequenza fotogrammi a 3000 è di solito appropriata sia per i topi che per i ratti.

3. Passaggi post-imaging

1. Pulire delicatamente il gel ultrasonico dalla zona addominale del mouse con un asciugamano di carta inumidito con acqua tiepida.
2. Posizionare nuovamente il mouse nella sua gabbia di casa su una piastra di riscaldamento.
3. Spegnere la macchina isoflurane, pulire la piattaforma di imaging animale e trasduttore con salviette umide.
4. Trasferire i dati dell'immagine raccolti durante la scansione a ultrasuoni sul disco rigido.
5. Spegnere lo strumento ad ultrasuoni.
6. Dopo che il mouse si riprende dall'anestesia ed è vigile, rimuovere il pad di riscaldamento e riportare la gabbia al rack di alloggiamento degli animali.

4. Analisi delle immagini aortiche addominali

1. Analisi delle immagini in modalità M per misurare MILD
   1. Aprire il programma di ultrasuoni e inserire il nome dello studio e le informazioni descrittive per ogni mouse.
   2. Aprire i dati a ultrasuoni nel software di analisi e aprire l'immagine in modalità M e mettere in pausa il battito cardiaco.
   3. Fare clic su Misure.
   4. Selezionare il pacchetto vascolare dalle opzioni a discesa. Fare clic su Profondità e tracciare una linea attraverso il lume aortico che si estende da parete interna a parete (Figura 2C,D).
      NOTA: Per coerenza, le misurazioni devono essere effettuate nella fase sistolica del ciclo cardiaco quando l'aorta viene ampliata al massimo. Disegna tre linee su tre diversi battiti cardiaci per ottenere misurazioni accurate e medie di MILD. In AAA, le misurazioni vengono effettuate al massimo dilatazione dell'aorta. Si consiglia inoltre di accelerare gli animali 4-6 h prima di raccogliere le immagini per evitare interferenze dalla motilità intestinale e garantire la chiarezza dell'immagine.
2. Analisi della velocità di propagazione degli impulsi (PPV)
   1. Aprire l'immagine EKV e mettere in pausa l'heartbeat.
   2. Aprire una nuova finestra sul software di analisi (ad esempio, Vevo Vac) facendo clic sull'icona del nome.
   3. Fare clic sull'opzione PPV (freccia in Figura 3D). Apparirà inoltre una piccola finestra con l'immagine dell'aorta.
   4. Disegnare un riquadro rettangolare facendo clic sulla parete superiore del recipiente e trascinando il puntatore per circa 4 mm coprendo entrambe le pareti dell'aorta suprarenal.
      NOTA: mantenere costante la lunghezza della scatola (4 mm) per tutte le immagini. L'utente può regolare il riquadro rettangolare ruotando per allineare la scatola e selezionando la linea e trascinando in una nuova posizione sul vaso analizzato per ottenere l'inflessione più appropriata e chiara dell'onda di impulso. Le linee verticali di dati del rettangolo verranno visualizzate e identificate come Sinistra (immagine in alto) e Destra (immagine in basso) sul ROI. Per una migliore visualizzazione dell'inflessione dell'onda d'impulso, a volte è utile per la casella di disegno solo sulla parete superiore, come illustrato nella Figura 3. Il software calcolerà automaticamente il PPV (m/s). Tuttavia, è sempre meglio regolare manualmente le linee viola per impostare il punto di inflessione esatto sulle onde d'impulso e PPV cambierà di conseguenza.
   5. Infine, selezionare il comando Accetta per salvare i valori PPV. Esportare le cifre e i dati nell'unità di archiviazione dati.
3. Analisi per la distensibilità e la deformazione radiale
   1. Aprire l'immagine EKV e mettere in pausa l'heartbeat.
   2. Fare clic sull'icona del software. Il software aprirà una nuova finestra.
   3. Fare clic sulla traccia nuovo ROI e disegnare un riquadro rettangolare sulle entrambe le pareti della nave. Il software traccia automaticamente le pareti superiore e inferiore della nave. L'utente può regolare la traccia per allinearla al muro facendo clic sui punti verdi (Figura 4A,B).
   4. Ora accetta la traccia. Il software calcolerà la distensibilità (1/Mpa) nel ROI selezionato.
   5. Per la misurazione della deformazione radiale, selezionare l'opzione di deformazione appropriata dalle barre dei menu in alto a sinistra. Si apriranno le immagini per la deformazione radiale e la deformazione tangenziale.
   6. Ottenere il valore per la deformazione radiale (%) spostando il cursore sul picco della curva. Esportare i dati come immagini o in formato video (Figura 4A,B).

Risultati

Le immagini rappresentative in modalità M dell'aorta addominale normale e aneurisma dei topi sono mostrate rispettivamente nella Figura 2A e nella Figura 2B. L'aorta addominale suprarenale è identificata dalla sua posizione accanto all'arteria renale destra e dall'arteria mesenterica superiore (Figura 2A). Le immagini rappresentative utilizzate per il calcolo del MILD, a tre diver...

Discussione

L'imaging ad ultrasuoni fornisce una potente tecnica per determinare le proprietà funzionali dell'aorta attraverso misurazioni di PPV, distensibilità e deformazione radiale. Queste misurazioni sono particolarmente istruttive per lo studio dei modelli murini di AAA e l'approccio in vivo consente la raccolta di dati longitudinali potenzialmente importanti per comprendere lo sviluppo temporale della patologia aortica. In particolare, le misurazioni della rigidità aortica in vivo sono determinate localmente nell'aorta add...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics