Mesure de la vitesse de propagation des impulsions, de la disxsibilité et de la souche dans un modèle abdominal de souris d’anévrisme aortique

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de l’imagerie par ultrasons à haute fréquence pour mesurer le diamètre de la luminale, la vitesse de propagation des impulsions, la distensibilité et la souche radiale sur un modèle murin d’anévrisme aortique abdominal.

Résumé

Un anévrisme aortique abdominal (AAA) est défini comme une dilatation localisée de l’aorte abdominale qui dépasse le diamètre intraluminal maximal (MILD) de 1,5 fois de sa taille d’origine. Des études cliniques et expérimentales ont montré que les petits anévrismes peuvent se rompre, tandis qu’une sous-population de grands anévrismes peut rester stable. Ainsi, en plus de la mesure du diamètre intraluminal de l’aorte, la connaissance des traits structurels de la paroi du navire peut fournir des informations importantes pour évaluer la stabilité de l’AAA. Le raidissement aortique a récemment émergé comme un outil fiable pour déterminer les changements précoces dans la paroi vasculaire. La vitesse de propagation des impulsions (VPP) ainsi que la distensibilité et la souche radiale sont des méthodes très utiles basées sur l’échographie pertinentes pour évaluer la rigidité aortique. L’objectif principal de ce protocole est de fournir une technique complète pour l’utilisation du système d’imagerie par ultrasons pour acquérir des images et analyser les propriétés structurelles et fonctionnelles de l’aorte telles que déterminées par MILD, PPV, distensibility et souche radiale.

Introduction

Un anévrisme aortique abdominal (AAA) représente une maladie cardio-vasculaire significative caractérisée par une dilatation localisée permanente de l’aorte dépassant le diamètre original de vaisseau de 1,5 fois¹. AAA se classe parmi les 13 principales causes de mortalité aux États-Unis². La progression de AAA est attribuée à la dégénérescence de la paroi aortique et à la fragmentation d’élastine, menant finalement à la rupture aortique. Ces changements dans la paroi aortique peuvent se produire sans une augmentation significative du diamètre intraluminal maximal (MILD), suggérant ainsi que MILD seul n’est pas suffisant pour prévoir la sévérité de la maladie³. Par conséquent, d’autres facteurs doivent être identifiés pour détecter les changements initiaux dans la paroi aortique, ce qui peut guider les options de traitement précoce. L’objectif global de ce protocole est de fournir un guide pratique pour évaluer les propriétés fonctionnelles aortiques à l’aide de l’imagerie par ultrasons caractérisée par des mesures de la vitesse de propagation des impulsions (VPP), de la distensibilité et de la souche radiale.

Un modèle expérimental bien caractérisé pour étudier AAA, décrit pour la première fois par Daugherty et ses collègues, implique l’infusion sous-cutanée d’angiotensine II (AngII) par l’intermédiaire de pompes osmotiques dans Apoe^-/- souris⁴. La mesure précise de MILD utilisant l’imagerie par ultrasons a joué un rôle déterminant dans la caractérisation de l’AAA dans ce modèle de souris⁵. Bien que les changements histologiques au cours du développement de l’AAA aient été largement étudiés, les changements dans les propriétés fonctionnelles de la paroi du navire, comme la rigidité aortique, n’ont pas été bien caractérisés. Ce protocole met l’accent sur l’utilisation de l’échographie à haute fréquence en combinaison avec les analyses sophistiquées comme outils puissants pour étudier la progression temporelle de l’AAA. Plus précisément, ces approches nous permettent d’évaluer les propriétés fonctionnelles de la paroi du navire mesurées par le VPP, la distensibilité et la souche radiale.

Des études cliniques récentes chez des sujets humains atteints d’AAA, ainsi que dans le modèle AAA induit par l’élastase murine, suggèrent une corrélation positive entre la rigidité aortique et le diamètre aortique^6,7. Le VPP, un indicateur de rigidité aortique, est accepté comme une excellente mesure pour quantifier les changements de rigidité dans la paroi du navire^6,8. Le VPP est calculé en mesurant le temps de transit de la forme d’onde pulsée à deux endroits le long de la vascularisation, fournissant ainsi une évaluation régionale de la rigidité aortique. Nous avons récemment démontré que la rigidité aortique accrue telle que mesurée par PPV, et au niveau cellulaire tel que déterminé utilisant la microscopie de force atomique, corrèle positivement avec le développement d’anévrisme⁹. En outre, la littérature suggère que la rigidité aortique peut précéder la dilatation anévrismale et peut donc fournir des informations utiles sur les propriétés intrinsèques régionales de la paroi du navire pendant le développement de AAA¹⁰. De même, la distensibilité et les mesures de la souche sont les outils de quantification pour mesurer les changements antérieurs de la condition artérielle. Les artères saines sont souples et élastiques, tandis qu’avec une rigidité accrue et moins d’élasticité, la distensibilité et la tension diminuent. Ici, nous fournissons un guide pratique et un protocole étape par étape pour l’utilisation d’un système d’échographie à haute fréquence pour mesurer le MILD, le VPP, la distensibilité et la souche radiale chez la souris. Le protocole fournit des approches techniques qui devraient être utilisées en conjonction avec les informations de base fournies par les manuels pour des instruments d’imagerie par ultrasons spécifiques et le tutoriel vidéo qui l’accompagne. Fait important, dans nos mains, le protocole d’imagerie décrit fournit des données reproductibles et précises qui semblent précieuses dans l’étude du développement et de la progression de l’AAA expérimental.

Pour démontrer davantage l’utilité de l’imagerie par ultrasons, nous fournissons des exemples d’images et de mesures tirées de nos propres études visant à utiliser des approches pharmacologiques pour prévenir l’AAA¹¹. Plus précisément, la signalisation d’encoche a été proposée pour être impliquée dans de multiples aspects du développement vasculaire et de l’inflammation^12. En utilisant l’haploinsufficience génique et les approches pharmacologiques, nous avons déjà démontré que l’inhibition de Notch réduit le développement de l’AAA chez la souris en empêchant l’infiltration de macrophages sur le site des lésions vasculaires^13,14,15. Pour l’article actuel, en utilisant l’approche pharmacologique pour l’inhibition de Notch nous nous concentrons sur la relation entre la rigidité aortique et les facteurs relatifs à AAA. Ces études illustrent que l’inhibition de Notch réduit la rigidité aortique, qui est une mesure de la progression AAA¹¹.

Protocole

Le protocole de manipulation des souris et de l’imagerie par ultrasons a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri (numéro de protocole animal 8799) et a été mené selon AAALAC International.

1. Configuration et préparation de l’équipement des souris

1. Configuration de l’équipement
   1. Allumez l’instrument à ultrasons, le réchauffeur de gel à ultrasons et le coussin chauffant.
   2. Ouvrez le programme d’échographie et entrez le nom de l’étude et l’information descriptive pour chaque souris.
   3. Sélectionnez l’application comme General Imaging.
   4. Choisissez le transducteur approprié pour l’imagerie abdominale (Figure 1B,C). Dans cette expérience, le transducteur MS400 est utilisé.
   5. Assurez-vous que les niveaux d’isoflurane et d’oxygène de l’anesthésie sont adéquats pour chaque séance expérimentale.
   6. Nettoyer la plate-forme d’imagerie animale par ultrasons.
2. Préparation de la souris
   1. Placer la cage de souris sur un coussin chauffant (36,5 à 38,5 oC).
   2. Tenez doucement la souris par sa base de queue et placez-la dans la chambre d’isoflurane remplie d’oxygène.
   3. Dirigez l’isoflurane et le flux d’oxygène vers la chambre d’induction.
   4. Allumez le vaporisateur d’isoflurane et fixez le niveau d’isoflurane à 1-2% vol/vol. Allumez la pression du réservoir d’oxygène à 1-2 L/min.
   5. Après 2 min, confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réflexes de sevrage lors du pincement de la bande de pied de la souris.
   6. Ensuite, éteignez la branche d’alimentation de la chambre d’induction et allumez la branche dirigée vers le cône nasal d’anesthésie.
   7. Transférer la souris de la chambre d’induction au stade d’imagerie par ultrasons et placer le cône d’anesthésie sur le nez de l’animal.
   8. Inclinez la plate-forme d’imagerie animale autour de 10 degrés vers le coin inférieur droit pour un balayage optimal (figure 1B).
   9. Mettez une goutte de solution ophtalmique stérile dans les deux yeux des souris pour empêcher le séchage sous anesthésie.
   10. Placez la souris en position de supine avec son nez inséré dans le cône d’anesthésie.
   11. Appliquer le gel d’électrode sur les quatre pattes à l’aide d’un coton-tige et ruban adhésif les pattes sur les fils de cuivre sur la plate-forme d’imagerie animale pour les lectures d’électrocardiogramme (Figure 1C).
   12. Utilisez des tondeuses pour raser les cheveux au site d’imagerie, puis appliquez de la crème dépilatoire pour enlever la fourrure restante. Laisser reposer moins de 1 min.
   13. Essuyez délicatement la crème et les cheveux à l’aide d’un essuie-tout humide.
   14. Surveillez la respiration et assurez-vous que la fréquence cardiaque est maintenue entre 450-550 battements/min. Si en dessous de ce niveau, réduire le flux d’isoflurane et attendre jusqu’à ce que la fréquence cardiaque se rétablisse.
   15. Appliquer le gel ultrasonique préchauffé (37 oC) sur le site de la peau préparée et attacher le transducteur à son support et abaisser jusqu’à ce qu’il touche le gel (Figure 1C).

2. Imagerie par ultrasons de l’aorte abdominale

1. Positionnez le transducteur horizontalement (c.-à-d. perpendiculaire à la ligne médiane de la souris).
2. Lisser le gel ultrasonique et enlever les bulles à l’aide du bâton de bois d’un coton-tige.
3. Baisser le transducteur et placer 0,5 à 1 cm sous le diaphragme après avoir touché le gel. Maintenant, commencez à observer les images.
4. Visualisez l’aorte abdominale dans la vue de l’axe court (Figure 1C).
   REMARQUE : Le mode B est le mode par défaut et le plus efficace pour localiser anatomiquement l’aorte et positionner le transducteur. L’aorte abdominale est identifiée par la présence d’écoulement pulsatile utilisant la couleur Doppler et les modes Doppler de puissance dans l’axe court (c.-à-d., la section transversale circonférence de l’aorte). Ajustez les micromanipulateurs sur la scène animale et le transducteur pour amener la section transversale de l’aorte au centre de l’image.
5. Faites pivoter doucement le transducteur dans le sens des aiguilles d’une montre et ajustez lentement le bouton de micromanipulateur à axe X pour visualiser l’aorte dans une vue longue axe (section longitudinale de l’aorte).
   REMARQUE : Dans de nombreux cas, les gaz gastro-intestinaux peuvent interférer avec l’image, ou l’aorte peut ne pas être à l’angle optimal pour permettre une vue claire de long axe. Ajustez l’angle du transducteur lentement et horizontalement jusqu’à ce qu’une vue d’axe longue acceptable soit obtenue. Si des problèmes persistent, élèvez le transducteur, vérifiez s’il y a des bulles d’air sous le transducteur, ajustez légèrement l’angle d’inclinaison de l’étape animale, réappliquez les gels et répétez toutes les étapes.
6. Définir la zone de mise au point et la profondeur à la région de l’aorte à l’aide des bascules Focus Zone et Focus Depth, respectivement. Ajustez le curseur de compensation de gain de temps manuellement pour assombrir le lumen de l’aorte pour réaliser un contraste optimal de la paroi d’aorte.
7. Ajustez le manipulateur d’axe de y pour visualiser les points de ramification du mésentérique supérieur et des artères rénales droites. Utilisez l’artère rénale droite comme point de repère pour capturer l’image de l’aorte suprarénale (Figure 2A).
8. Enregistrez au moins 100 images en mode B sur l’aorte suprarénale.
9. Appuyez sur cinestore pour enregistrer les images en mode B.
10. Appuyez sur le bouton mode M sur le clavier de l’instrument pour activer l’enregistrement en mode M. Rouler la boule de curseur pour amener la ligne d’indicateur jaune à une section d’aorte normale avec l’image claire de mur de navire, ou aux sections où le diamètre maximal de l’anévrisme est observé.
11. Appuyez sur la bascule SV/porte et ajustez la boule de curseur pour s’assurer que les parois du navire sont incluses dans le support de mesure. Mise à jour de presse pour enregistrer les mesures en mode M et appuyez sur cinestore pour capturer (Figure 2A,B).
    REMARQUE : Le diamètre maximal de l’anévrisme peut ne pas être dans le même plan d’imagerie que la vue optimale de long axe de l’aorte. Ajustez légèrement le bouton de manipulateur x-axe pour chaque mesure en mode M afin de vous assurer que le MILD de chaque section est capturé.
12. Pour obtenir des images de visualisation Kilohertz (EKV) fermées par ECG, appuyez sur le bouton b-mode pour revenir à l’enregistrement en mode B.
    REMARQUE: Si les images ne sont pas nettes, ajustez le manipulateur x-axe pour obtenir l’image la plus nette de la paroi supérieure du lumen sur une longueur de section (c.-à-d., 'gt; 6 mm).
13. Appuyez sur physio Paramètres bouton sur le clavier et sélectionnez Respiration Gating. Ajustez manuellement le délai de gating et la fenêtre pour enregistrer les données uniquement pendant les parties les plus plates de l’onde respiratoire. Les sections d’enregistrement seront affichées sous forme de blocs colorés sur le tracé de l’onde respiratoire.
    REMARQUE : Sans l’ajustement de la respiration, les images d’EKV seront brouillées en raison du mouvement normal de l’animal pendant la respiration.
14. Appuyez sur le bouton EKV pour activer le mode EKV. Dans le menu approprié, sélectionnez Résolution Standard et taux d’image 3000 ou plus. Sélectionnez procéder à l’enregistrement des images EKV. Appuyez sur cinestore pour enregistrer les images. Utilisez l’image en mode EKV pour obtenir des mesures de la vitesse de propagation des impulsions (VPP), de la distensibilité et de la souche radiale.
    REMARQUE : L’enregistrement de l’EKV peut échouer s’il y a des fluctuations anormales dans la respiration, que l’animal respire trop rapidement, ou que les réglages des taux d’images sont trop élevés. Dans ces cas, fixez le taux de trame plus bas et attendez que la respiration animale se stabilise. La fixation du taux d’armature à 3000 est généralement appropriée pour les souris et les rats.

3. Étapes post-imagerie

1. Essuyez délicatement le gel ultrasonique de la région abdominale de la souris avec une serviette en papier humidifiée avec de l’eau chaude.
2. Placez la souris dans sa cage d’accueil sur un coussin chauffant.
3. Éteignez la machine à isoflurane, nettoyez la plate-forme d’imagerie animale et transductez avec des lingettes humides.
4. Transférez les données d’image recueillies lors de l’échographie sur le disque dur.
5. Éteignez l’appareil à ultrasons.
6. Une fois que la souris se remet d’une anesthésie et qu’elle est alerte, retirez le coussin chauffant et retournez la cage au support de logement des animaux.

4. Analyse des images aortiques abdominales

1. Analyse des images en mode M pour mesurer MILD
   1. Ouvrez le programme d’échographie et entrez le nom de l’étude et l’information descriptive pour chaque souris.
   2. Ouvrez les données d’échographie dans le logiciel d’analyse et ouvrez l’image en mode M et mettez en pause le rythme cardiaque.
   3. Cliquez sur Mesures.
   4. Sélectionnez le paquet vasculaire parmi les options de déroulant. Cliquez sur La profondeur et tracez une ligne à travers le lumen aortique s’étendant d’un mur intérieur à l’autre (Figure 2C,D).
      REMARQUE : Pour la cohérence, les mesures doivent être prises à la phase systolique du cycle cardiaque lorsque l’aorte est maximalement étendue. Dessinez trois lignes à travers trois battements de cœur différents pour obtenir des mesures précises et moyennes de MILD. Dans AAA, les mesures sont prises à la dilatation maximale de l’aorte. Il est également conseillé de jeûner les animaux 4-6 h avant de recueillir des images pour éviter les interférences de la motilité intestinale et assurer la clarté de l’image.
2. Analyse de la vitesse de propagation des impulsions (VPP)
   1. Ouvrez l’image EKV et mettez en pause le rythme cardiaque.
   2. Ouvrez une nouvelle fenêtre sur le logiciel d’analyse (p. ex. Vevo Vac) en cliquant sur l’icône du nom.
   3. Cliquez sur l’option PPV (flèche dans la figure 3D). Une petite fenêtre apparaîtra plus loin avec l’image de l’aorte.
   4. Dessinez une boîte rectangulaire en cliquant sur le mur supérieur du navire et en faisant glisser le pointeur sur environ 4 mm couvrant les deux parois de l’aorte suprarénale.
      REMARQUE : Gardez la longueur de la boîte cohérente (4 mm) pour toutes les images. L’utilisateur peut ajuster la boîte rectangulaire en tournant pour aligner la boîte et en sélectionnant la ligne puis en faisant glisser vers une nouvelle position sur le navire analysé pour obtenir l’inflexion la plus appropriée et claire de l’onde pulsée. Les lignes verticales des données du rectangle seront affichées et identifiées comme étant la gauche (image du haut) et la droite (image du bas) sur le roi-retour. Pour une meilleure visualisation de l’inflexion de l’onde pulsée, il est parfois utile à la boîte de tirage que sur le mur supérieur comme le montre la figure 3. Le logiciel calculera automatiquement le PPV (m/s). Cependant, il est toujours préférable d’ajuster manuellement les lignes violettes pour définir le point d’inflexion exact sur les ondes d’impulsion et PPV va changer en conséquence.
   5. Enfin, sélectionnez la commande Accept pour enregistrer les valeurs PPV. Exportez les chiffres et les données vers le lecteur de stockage de données.
3. Analyse de la distensibilité et de la souche radiale
   1. Ouvrez l’image EKV et mettez en pause le rythme cardiaque.
   2. Cliquez sur l’icône logicielle. Le logiciel ouvrira une nouvelle fenêtre.
   3. Cliquez sur la trace nouveau retour sur investissement et dessiner une boîte rectangulaire sur les deux murs du navire. Le logiciel tracera automatiquement les parois supérieures et inférieures du navire. L’utilisateur peut ajuster la trace pour aligner sur le mur en cliquant sur les points verts (Figure 4A,B).
   4. Acceptez la trace. Le logiciel calculera la distensibilité (1/Mpa) dans le roi-retour sélectionné.
   5. Pour la mesure de la souche radiale, sélectionnez l’option de contrainte appropriée dans les barres de menu en haut à gauche. Les images de la souche radiale et de la souche tangentielle s’ouvriront.
   6. Obtenir la valeur de la souche radiale (%) en déplaçant le curseur sur le sommet de la courbe. Exporter les données sous forme d’images ou en format vidéo (Figure 4A,B).

Résultats

Les images représentatives en mode M de l’aorte abdominale normale et anévrismale des souris sont montrées dans la figure 2A et la figure 2B,respectivement. L’aorte abdominale suprarénale est identifiée par son emplacement à côté de l’artère rénale droite et de l’artère mésentérique supérieure (Figure 2A). Les images représentatives utilisées pour le calcul d...

Discussion

L’imagerie par ultrasons fournit une technique puissante pour déterminer les propriétés fonctionnelles de l’aorte grâce à des mesures de la VPP, la distensibilité et la souche radiale. Ces mesures sont particulièrement instructives pour l’étude des modèles murins de l’AAA et l’approche in vivo permet la collecte de données longitudinales qui sont potentiellement importantes pour comprendre le développement temporel de la pathologie aortique. Plus précisément, les mesures de la raideur aortique in v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics