JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Данная рукопись описывает подробный протокол использования высокочастотной ультразвуковой визуализации для измерения диаметра светила, скорости размножения импульса, неурядицы и радиальной нагрузки на модель мыши аневризмы брюшной аорты.

Аннотация

Аневризма брюшной аорты (ААА) определяется как локализованное расширение брюшной аорты, превышающей максимальный внутрилюминный диаметр (MILD) в 1,5 раза от первоначального размера. Клинические и экспериментальные исследования показали, что небольшие аневризмы могут разорваться, в то время как субпопуляция крупных аневризм может оставаться стабильной. Таким образом, в дополнение к измерению внутрилюмиального диаметра аорты, знание структурных признаков стенки судна может предоставить важную информацию для оценки стабильности ААА. Аорта ужесточение в последнее время стала надежным инструментом для определения ранних изменений в сосудистой стенки. Скорость размножения импульса (PPV) наряду с неурядицой и радиальным напряжением являются очень полезными ультразвуковыми методами, актуальными для оценки жесткости аорты. Основная цель этого протокола заключается в обеспечении комплексной техники для использования ультразвуковой системы визуализации для получения изображений и анализа структурных и функциональных свойств аорты, определяемых MILD, PPV, неурядицом и радиальным напряжением.

Введение

Аневризма брюшной аорты (ААА) представляет собой значительное сердечно-сосудистое заболевание, характеризующееся постоянным локализованным расширением аорты, превышающим первоначальный диаметр сосуда в 1,5 раза1. AAA входит в число 13 лучших причин смертности в США2. Прогрессирование ААА объясняется дегенерацией аортной стенки и эластина фрагментации, в конечном счете приводит к разрыву аорты. Эти изменения в аортальной стенке могут произойти без значительного увеличения максимального внутрилюмиального диаметра (MILD), что свидетельствует о том, что только MILD недостаточно для прогнозирования тяжести заболевания3. Поэтому необходимо определить дополнительные факторы для выявления первоначальных изменений в стенке аорты, которые могут направлять варианты раннего лечения. Общая цель этого протокола заключается в предоставлении практического руководства для оценки функциональных свойств аорты с использованием ультразвуковой визуализации, характеризующейся измерениями скорости распространения импульса (PPV), неурядицом и радиальным напряжением.

Хорошо охарактеризованная экспериментальная модель для изучения ААА, впервые описанная Догерти и коллегами, включает в себя подкожный вливание ангиотензина II (AngII) с помощью осмотических насосов в Apoe-/- мышей4. Точное измерение MILD с помощью ультразвуковой визуализации сыграло важную роль в характеристике ААА в этой модели мыши5. Хотя гистологические изменения в ходе разработки ААА были тщательно изучены, изменения в функциональных свойствах стенки судна, такие как жесткость аорты, не были хорошо охарактеризованы. Этот протокол подчеркивает использование высокочастотного ультразвука в сочетании с сложными анализами в качестве мощных инструментов для изучения временной прогрессии ААА. В частности, эти подходы позволяют оценить функциональные свойства стенки сосуда, измеряемые PPV, неурядчивость и радиальный штамм.

Недавние клинические исследования в человеческих субъектов с AAA, а также в мурин эластазы индуцированной модели AAA, предложить положительную корреляцию между аортальной жесткости и аортыдиаметр6,7. PPV, индикатор жесткости аорты, принимается как отличное измерение для количественной оценки изменений в жесткости в стенке судна6,8. PPV рассчитывается путем измерения времени транзита импульсной формы волны на двух участках вдоль сосуды, обеспечивая тем самым региональную оценку жесткости аорты. Недавно мы показали, что повышенная жесткость аорты, измеряемая PPV, и на клеточном уровне, как определяется с помощью атомной микроскопии силы, положительно коррелирует с развитием аневризмы9. Кроме того, литература предполагает, что жесткость аорты может предшествовать аневризмальной дилатации и, таким образом, может предоставить полезную информацию о региональных внутренних свойств стенки судна во время развития AAA10. Аналогичным образом, неурядицом и деформацией являются инструменты количественной оценки для измерения более ранних изменений артериальной пригодности. Здоровые артерии являются гибкими и эластичными, в то время как с повышенной жесткостью и меньшей эластичностью, неусектовость и напряжение уменьшается. Здесь мы предоставляем практическое руководство и пошаговым протоколом для использования высокочастотной ультразвуковой системы для измерения MILD, PPV, неурядицимы и радиального штамма у мышей. Протокол предусматривает технические подходы, которые должны использоваться в сочетании с базовой информацией, представленной руководствами для конкретных инструментов ультразвуковой визуализации и сопроводительного видео-урока. Важно отметить, что в наших руках описанный протокол визуализации предоставляет воспроизводимые и точные данные, которые представляются ценными при изучении разработки и прогрессирования экспериментальной ААА.

Для дальнейшего демонстрации полезности ультразвуковой визуализации, мы приведем пример изображений и измерений, взятых из наших собственных исследований, направленных на использование фармакологических подходов для предотвращения экспериментальных AAA11. В частности, выемка сигнализации было предложено принять участие в различных аспектах развития сосудов и воспаление12. Используя генные гаплоинстовые и фармакологические подходы, мы ранее показали, что ингибирование Notch снижает развитие ААА у мышей, предотвращая проникновение макрофагов в месте сосудистой травмы13,14,15. В настоящей статье, используя фармакологический подход для ингибирования Notch мы сосредотачиваем на связи между аорты жесткости и факторами, относящимися к AAA. Эти исследования показывают, что ингибирование Notch снижает скованность аорты, что является мерой прогрессии ААА11.

протокол

Протокол для обработки мышей и ультразвуковой визуализации был одобрен Университетом Штата Миссури институционального ухода за животными и использования комитета (животный протокол номер 8799) и был проведен в соответствии с AAALAC International.

1. Установка оборудования и подготовка мышей

  1. Установка оборудования
    1. Включите ультразвуковой прибор, ультразвуковой гель теплее и грелку.
    2. Откройте ультразвуковую программу и введите название исследования и описательную информацию для каждой мыши.
    3. Выберите приложение в качестве общей визуализации.
    4. Выберите подходящий преобразователь для визуализации брюшной полости(рисунок 1B, C). В этом эксперименте используется преобразователь MS400.
    5. Убедитесь, что уровень анестезии изофруран и кислород являются адекватными для каждой экспериментальной сессии.
    6. Очистите ультразвуковую платформу визуализации животных.
  2. Подготовка мыши
    1. Поместите клетку мыши на верхней части грелки (36,5 до 38,5 градусов по Цельсию).
    2. Аккуратно держите мышь за хвостовой базой и поместите в наполненную кислородом изофлюранскую камеру.
    3. Направьте изофлюран и поток кислорода в индукционную камеру.
    4. Включите испаритель изофлурана и установите уровень изофлуран до 1-2% вольт/вольт. Включите давление кислородного бака до 1-2 л/мин.
    5. После 2 мин, подтвердить адекватную глубину анестезии при отсутствии отрезок рефлексы при щипать подножку мыши.
    6. Затем выключите ветку индукционной камеры питания и включите ветку, направленную на конус носа анестезии.
    7. Перенесите мышь из индукционной камеры на стадию ультразвуковой визуализации и положите конус анестезии над носом животного.
    8. Наклоните платформу изображения животных около 10 "в правом нижнем углу для оптимального сканирования (Рисунок 1B).
    9. Положите одну каплю стерильного офтальмологическиго раствора в оба глаза мышей, чтобы предотвратить сушки под наркозом.
    10. Расположите мышь в положении лежа с носом, вставленным в конус анестезии.
    11. Нанесите электродгель на все четыре лапы с помощью ватного тампона и ленты лапы меди приводит на животных изображений платформы для электрокардиограммы чтения(Рисунок 1C).
    12. Используйте клиперы для бритья волос на сайте изображения, а затем применить крем для удаления оставшегося меха. Оставьте менее чем на 1 мин.
    13. Аккуратно стричь крем и волосы влажным бумажным полотенцем.
    14. Мониторинг дыхания и убедитесь, что частота сердечных приступов поддерживается между 450-550 ударов / мин. Если ниже этого уровня, уменьшить поток изофлуран и ждать, пока частота сердечных сокращений восстанавливается.
    15. Нанесите прегретый ультразвуковой гель (37 градусов по Цельсию) на подготовленное место кожи и прикрепите преобразующий к его держателю и опустите вниз, пока он не коснется геля(рисунок 1C).

2. Ультразвуковая визуализация брюшной аорты

  1. Расположите преобразователь горизонтально (т.е. перпендикулярно средней линии мыши).
  2. Гладкая ультразвуковой гель и удалить пузырьки с помощью древесной палочки ватного тампона.
  3. Опустите преобразователь и поместите на 0,5 - 1 см ниже диафрагмы после прикосновения к гелю. Теперь начните наблюдать за изображениями.
  4. Визуализируйте брюшную аорту в виде короткой оси(рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: B-режим является по умолчанию и наиболее эффективным режимом, чтобы анатомически найти аорту и положение преобразователя. Брюшная аорта определяется наличием пульсирующего потока с использованием цветовых доплеровских режимов и сил доплеровских режимов в короткой оси (т.е. окружного поперечного сечения аорты). Отрегулируйте микроманипуляторы на животной сцене и преобразователь, чтобы довести сечение аорты к центру изображения.
  5. Аккуратно поверните преобразователь по часовой стрелке и медленно отрегулируйте ручку микроманипулятора x-оси, чтобы визуализировать аорту в виде длинной оси (продольной секции аорты).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во многих случаях желудочно-кишечные газы могут мешать изображению, или аорта может быть не в оптимальном ракурсе, чтобы обеспечить четкое длинное представление оси. Отрегулируйте угол преобразователя медленно и горизонтально до получения приемлемого вида длинной оси. Если проблемы сохраняются, поднимите преобразователь, проверьте пузырьки воздуха под преобразователем, слегка отрегулируйте угол наклона стадии животного, повторно нанесите гели и повторите все шаги снова.
  6. Установите зону фокусировки и глубину в области аорты, используя фокусную зону и переключатели фокуса глубины соответственно. Отрегулируйте время получения компенсации ползунок вручную, чтобы затемнить просвет аорты для достижения оптимального контраста стены аорты.
  7. Отрегулируйте манипулятор y-оси, чтобы визуализировать точки ветвления верхней мезентерии и правой почечной артерии. Используйте правую почечную артерию в качестве ориентира для захвата изображения супранельной аорты(рисунок 2А).
  8. Запись по крайней мере 100 кадров B-режима изображения на suprarenal аорты.
  9. Нажмите cinestore, чтобы сохранить B-режим изображения.
  10. Нажмите кнопку M-режима на клавиатуре прибора, чтобы включить запись M-режима. Roll шарик курсора для того чтобы принести желтую линию индикатора к нормальным разделам аорты с ясным изображением стены сосуда, или к разделам где максимальный диаметр аневризмы наблюдается.
  11. Нажмите на SV/gate переключатель и настроить шарик курсора, чтобы убедиться, что стенки судна включены в кронштейн измерения. Пресс-обновление для записи M-режим измерений и нажмите cinestore для захвата (Рисунок 2A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный диаметр аневризмы не может быть в той же плоскости изображения, как оптимальный вид длинной оси аорты. Отрегулируйте ручку манипулятора x-оси слегка для каждого измерения M-режима, чтобы гарантировать, что MILD каждого раздела захвачен.
  12. Чтобы получить изображения эквалдеризации Киогерц (EKV), нажмите кнопку B-режима, чтобы вернуться к записи В-режима.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если изображения не являются острыми, отрегулируйте манипулятор x-оси для достижения самого резкого изображения верхней стены просвета над длиной секции (т.е. 6 мм).
  13. Нажмите кнопку Физиология Настройки на клавиатуре и выберите Дыхание Gating. Отрегулируйте gating Delay и Window вручную для записи данных только во время более плоских частей волны дыхания. Разделы записи будут показаны в виде цветных блоков на отслеживании волны дыхания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без регулировки дыхания gating, Изображения EKV будут размыты из-за нормального движения животного во время дыхания.
  14. Нажмите кнопку EKV, чтобы включить режим EKV. В соответствующем меню выберите Стандартное разрешение и частоту кадров 3000 или выше. Выберите приступить к записи изображений EKV. Пресс cinestore, чтобы сохранить изображения. Используйте изображение режима EKV для получения измерений скорости размножения импульса (PPV), неурядицы и радиального напряжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись EKV может потерпеть неудачу, если есть ненормальные колебания дыхания, животное стремится слишком быстро, или настройки частоты кадров слишком высоки. В этом случае установите частоту кадров ниже и ждите, пока дыхание животного стабилизируется. Установка частоты кадров на 3000, как правило, подходит для мышей и крыс.

3. Пост-изображения шаги

  1. Аккуратно протрите ультразвуковой гель из брюшной области мыши бумажным полотенцем, увлажненном теплой водой.
  2. Поместите мышь обратно в свою домашнюю клетку на грелку.
  3. Выключите изолюранскую машину, очистите платформу для визуализации животных и преобразуйте влажные салфетки.
  4. Перенос данных изображения, собранных во время ультразвукового сканирования, на жесткий диск.
  5. Выключите ультразвуковой инструмент.
  6. После того, как мышь оправится от наркоза и начеку, снимите грелку и верните клетку в стойку для дома для животных.

4. Анализ изображений брюшной аорты

  1. Анализ изображений M-режима для измерения MILD
    1. Откройте ультразвуковую программу и введите название исследования и описательную информацию для каждой мыши.
    2. Откройте ультразвуковые данные в программном обеспечении для анализа и откройте изображение M-режима и приостановите сердцебиение.
    3. Нажмите на измерения.
    4. Выберите сосудистый пакет из вариантов выпадения. Нажмите на глубину и нарисуйте линию через просвет аорты, простирающийся от внутренней стены к стене(рисунок 2C,D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для согласованности, измерения должны быть приняты на систолической фазе сердечного цикла, когда аорта максимально расширена. Нарисуйте три линии через три различных сердцебиения, чтобы получить точные и средние измерения MILD. В AAA, измерения принимаются на максимальное расширение аорты. Также желательно, чтобы быстро животных 4-6 ч до сбора изображений, чтобы избежать вмешательства от подвижности кишечника и обеспечить четкость изображения.
  2. Анализ скорости размножения импульса (PPV)
    1. Откройте изображение EKV и приостановите сердцебиение.
    2. Откройте новое окно программного обеспечения для анализа (например, Vevo Vac), нажав на значок имени.
    3. Нажмите на опцию PPV (стрелка на рисунке 3D). Небольшое окно будет дальше появляться с изображением аорты.
    4. Нарисуйте прямоугольную коробку, нажав на верхнюю стенку сосуда и перетащив указатель примерно на 4 мм, покрывающие обе стены супранельной аорты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите длину коробки последовательной (4 мм) для всех изображений. Пользователь может настроить прямоугольную коробку, вращаясь, чтобы выровнять коробку и выбрав линию, затем перетащив в новое положение на анализируемом сосуде, чтобы получить наиболее подходящий и ясный перегиб импульсной волны. Вертикальные линии данных из прямоугольника будут отображаться и идентифицированы как левые (верхнее изображение) и правые (нижнее изображение) на рентабельности инвестиций. Для лучшей визуализации перегиба импульсной волны иногда полезно рисовать только на верхней стене, как показано на рисунке 3. Программное обеспечение будет автоматически вычислять PPV (м/с). Тем не менее, это всегда лучше вручную настроить фиолетовые линии, чтобы установить точную точку перегиба на импульсных волн и PPV будет меняться соответственно.
    5. Наконец, выберите команду Accept для сохранения значений PPV. Экспортировать данные и данные в диск хранения данных.
  3. Анализ на неурядность и радиальный штамм
    1. Откройте изображение EKV и приостановите сердцебиение.
    2. Нажмите на значок программного обеспечения. Программное обеспечение откроет новое окно.
    3. Нажмите на новый след рентабельности инвестиций и нарисуйте прямоугольную коробку на обеих стенках сосуда. Программное обеспечение будет автоматически отслеживать верхнюю и нижнюю стенки судна. Пользователь может настроить след, чтобы выровнять на стене, нажав на зеленые точки(Рисунок 4A,B).
    4. Теперь примите след. Программное обеспечение будет вычислять неурядицом (1/Mpa) в выбранной рентабельности инвестиций.
    5. Для измерения радиального штамма выберите подходящий вариант деформации из баров меню в левом верхнем верхнем. Откроются изображения для радиального штамма и касательного деформации.
    6. Получение значения для радиального штамма (%) перемещая курсор на пик кривой. Экспорт данных в виде изображений или в формате видео(рисунок 4A,B).

Результаты

Представитель M-режим изображения нормальной и аневризмальной брюшной аорты от мышей показаны на рисунке 2А и Рисунок 2B, соответственно. Супрарная брюшная аорта определяется по ее расположению рядом с правой почечной артерией и превос...

Обсуждение

Ультразвуковая визуализация обеспечивает мощную технику для определения функциональных свойств аорты путем измерения PPV, неурядицы и радиального напряжения. Эти измерения особенно поучительны для изучения моделей мыши AAA и in vivo подход позволяет для сбора продольных данных, что потен?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана R01HL124155 (CPH) и финансирование мниматизмом научно-исследовательского института при Университете Миссури в CPH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Angiotensin IISigmaA9525
Apoe-/- miceThe Jackon labfigure-materials-136
ClippersWAHL1854
Cotton swabQ-tips
DAPTSigmaD5942
Depilatory creamNairLL9038
Electrode creamSigma17-05
Gel warmerThermasonic (Parker)82-03 (LED)
Heating padStrykerT/pump professional
IsofluraneVetOneFluriso TM
Isoflurane vaporizerVisualsonicsVS4244
Lubricating ophthalmic ointmentLacri-lube
Osmotic pumpsAlzetModel 2004
Oxygen tankAir gas
TranducerVisualsonicsMS-400 or MS550D
Ultrasonic gelParkerAquasonic clear
Ultrasound Imaging SystemVisualsonicsVevo 2100
Vevo Vasc SoftwareVisualsonics

Ссылки

  1. Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
  3. Xu, J., Shi, G. -. P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
  4. Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
  5. Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
  6. Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
  7. van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
  8. Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
  9. Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
  10. Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
  11. Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
  12. Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
  13. Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
  14. Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
  15. Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
  16. Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
  17. Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
  18. Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
  19. Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
  20. Luo, F., Zhou, X. -. L., Li, J. -. J., Hui, R. -. T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены