استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس التفاعلات بين البروتين والدهون

Summary

يحصل الرحلان الحراري المجهري على ثوابت ربط بسرعة بتكلفة مادية منخفضة. إما الرحلان الحراري المجهري المسمى أو الخالي من التسمية متاح تجاريا. ومع ذلك ، فإن الرحلان الحراري الخالي من الملصقات غير قادر على تنوع قياسات التفاعل التي يمكن إجراؤها باستخدام ملصقات الفلورسنت. نحن نقدم بروتوكولا لقياسات الرحلان الحراري الموسومة.

Abstract

تعد القدرة على تحديد التقارب المرتبط للدهون بالبروتينات جزءا أساسيا من فهم التفاعلات بين البروتين والدهون في الاتجار بالأغشية ونقل الإشارات وإعادة تشكيل الهيكل الخلوي. وتشمل الأدوات الكلاسيكية لقياس هذه التفاعلات رنين البلازمون السطحي (SPR) وقياس كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC). في حين أن هذه الأساليب قوية ، إلا أنها تنطوي على انتكاسات. يتطلب مركز التجارة الدولية كميات كبيرة من البروتين النقي وكذلك الدهون ، والتي يمكن أن تكون مكلفة ويصعب إنتاجها. وعلاوة على ذلك، فإن مركز التجارة الدولية وكذلك SPR يستهلكان وقتا طويلا جدا، مما قد يضيف بشكل كبير إلى تكلفة إجراء هذه التجارب. إحدى الطرق لتجاوز هذه القيود هي استخدام تقنية جديدة نسبيا للرحلان الحراري المجهري (MST). MST سريع وفعال من حيث التكلفة باستخدام كميات صغيرة من العينة للحصول على منحنى تشبع لحدث ربط معين. يوجد حاليا نوعان من أنظمة MST المتاحة. يتطلب نوع واحد من MST وضع العلامات باستخدام الفلوروفور في الطيف الأزرق أو الأحمر. يعتمد النظام الثاني على التألق الجوهري للأحماض الأمينية العطرية في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. يكتشف كلا النظامين حركة الجزيئات استجابة للتحريض الموضعي للحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. كل نهج له مزاياه وعيوبه. يمكن أن يستخدم MST الخالي من الملصقات بروتينات أصلية غير موسومة ؛ ومع ذلك ، فإن العديد من التحليلات ، بما في ذلك المستحضرات الصيدلانية ، الفلوريس في نطاق الأشعة فوق البنفسجية ، والتي يمكن أن تتداخل مع تحديد قيم KD الدقيقة. وبالمقارنة، يسمح MST المسمى بتنوع أكبر في التفاعلات الزوجية القابلة للقياس باستخدام مجسات تحمل علامات فلورسنت متصلة بالأربطة ذات الامتصاص القابل للقياس في النطاق المرئي بدلا من الأشعة فوق البنفسجية، مما يحد من إمكانية تداخل الإشارات من التحليلات.

Introduction

الرحلان الحراري المجهري هو تقنية جديدة نسبيا في تحديد ثوابت فك الارتباط (KD) وكذلك ثوابت التثبيط (_IC50) بين الأربطة ذات الصلة كيميائيا حيويا. تقدم شركة التجزئة التجارية الرائدة في مجال MST (على سبيل المثال ، NanoTemper) تقنيتين شائعتين من تقنيات MST: 1) MST خالية من الملصقات تتطلب علامة فلورسنت ، و 2) الرحلان الحراري المسمى باستخدام التألق المتأصل للبروتينات التي تعتمد على عدد المخلفات العطرية الموجودة في كل بروتين ¹. من عيوب الرحلان الحراري الخالي من الملصقات أنه في معظم الحالات ، لا يسمح بقياس تفاعلات البروتين والبروتين. ومع ذلك ، قد يكون من الممكن هندسة البروتينات بدون أحماض أمينية عطرية مثل التربتوفان لاستخدامها في الرحلان الحراري الخالي من الملصقات ².

يقيس MST حركة الجسيمات استجابة لتحريض حقول درجة الحرارة المجهرية التي بدأها ليزر الأشعة تحت الحمراء في التقنيات المتاحة ^حاليا1. يمكن استخدام MST لقياس التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والدهون ، وجزيء البروتين الصغير ، وتجارب المنافسة ، وحتى التفاعلات بين الجزيئات الصغيرة طالما يمكن للمرء أن ينتج ما يكفي من فصل الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح MST بقياس التفاعلات القائمة على البروتين الغشائي المضمنة في الجسيمات الشحمية أو الأقراص النانوية. يستفيد الرحلان الحراري المسمى من استخدام العلامات الموسومة بالفلورسنت مما يسمح بفصل الإشارة الذي يمكن التحكم فيه كيميائيا بين الرباط والتحليل. يمكن الحصول على قيم KD باستخدام الرحلان الحراري للتفاعلات التي تنطوي على ربط البروتين بتركيزات نانومولية منخفضة ، والتي تكون في معظم الحالات تركيزا أقل بكثير من البروتين مما هو مطلوب لقياس السعرات الحرارية المتساوية الحرارة (ITC)³. بالإضافة إلى ذلك ، ليس لدى MST متطلبات تخزين مؤقت صارمة كما هو مطلوب لرنين البلازمون السطحي (SPR)⁴ ويمكن حتى استخدام الرحلان الحراري المسمى لقياس ثوابت ربط البروتينات ذات الأهمية من محاليل البروتين غير النقية بالكامل ⁵ مع علامات الفلورسنت المدرجة وراثيا ⁶. عيب MST هو أنه لا يمكن الحصول على المعلمات الحركية بسهولة ل MST كما هو الحال في ^SPR2.

تعتمد قياسات الرحلان الحراري على اختلاف درجة الحرارة المحلية للمحلول. يمكن توليد هذه الحرارة من ليزر الأشعة تحت الحمراء. يحتوي جهاز MST على كاشف تألق مقترن بشعاع الأشعة تحت الحمراء (IR) ويمكنه التقاط التغيرات في التألق من تغيرات التركيز المحلي لجزيئات الفلورسنت عند النقطة التي يتم فيها استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. يستخدم جهاز MST ليزر مستهدف بالأشعة تحت الحمراء مقترنا مباشرة بكاشف التألق الذي يركز على نفس النقطة التي يتم فيها توليد الحرارة في المحلول. وهذا يسمح بالكشف القوي عن التغيرات في درجة الحرارة المقابلة لنضوب الجزيئات عند نقطة الحرارة الناتجة عن ليزر الأشعة تحت الحمراء. يتناقص التألق المقاس بشكل عام بالقرب من ليزر الأشعة تحت الحمراء استجابة لزيادة درجة الحرارة. يمكن أن تكون الاختلافات التي تم قياسها نتيجة لذلك بسبب عوامل متعددة بما في ذلك الشحنة أو الحجم أو إنتروبيا الحل. يتم قياس هذه الاختلافات على أنها تغيرات في التألق استجابة لتحريض الحرارة أو حركة الجزيئات من الأجزاء الساخنة إلى الباردة من الشعيرات الدموية.

عند تحميل الشعيرات الدموية بمحلول معين ، من المهم ترك الهواء في أي من طرفي الشعيرات الدموية وعدم تحميل الشعيرات الدموية بالكامل بالكامل. الشعيرات الدموية التجارية تحمل حوالي 10 ميكرولتر من المحلول. يمكن للمرء تحقيق قياسات دقيقة باستخدام 5 ميكرولتر من المحلول طالما يتم التلاعب بالمحلول إلى مركز الشعيرات الدموية ، ولا توجد فقاعات هواء (يحتمل أن تكون degas قبل تحميل الشعيرات الدموية) ، والمرء حريص على تحميل الرف لعدم تزاحم المحلول من مركز الشعيرات الدموية ، حيث يتم استهداف ليزر الأشعة تحت الحمراء. إذا لم يتلامس الليزر بشكل كامل مع المحلول ، فمن المرجح أن تكون النتيجة واحدة من ثلاثة مخرجات غير قابلة للاستخدام لهذا التركيز: 1) عدم وجود أو اكتشاف تألق منخفض ، 2) اكتشاف تألق أعلى (يحتمل أن يكون مع ذروة خشنة) ، أو 3) اكتشاف التألق ضمن قيم أخرى من المعايرة بالتحليل الحجمي ، ولكن مع ذروة خشنة وغير مستديرة.

بالنسبة للرحلان الحراري المسمى ، من الأفضل أن يكون لديك إشارة تألق أعلى من 200 وحدة تألق وأقل من 2000 وحدة ^تألق7. يستخدم جهاز MST مجموعة من كثافات LED من 0 إلى 100 ، والتي يمكن اختيارها لتحقيق إشارة أعلى من 200 أو أقل من 2000. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء استخدام تركيزات مختلفة من الليغاند المسمى لتعديل إشارة التألق إلى المستوى الأمثل. من المهم إجراء فحص للغطاء باستخدام قياس MST معين كمرجع عند تحليل البيانات ، حيث يمكن أن يؤدي فحص الغطاء الضعيف في كثير من الأحيان إلى نقطة قد يتم تحديدها لاحقا على أنها شاذة. يجب أن يستغرق كل تشغيل حوالي 30 دقيقة إذا تم قياس طاقة MST واحدة باستخدام فحص الغطاء. تسمح الأجهزة التجارية بإجراء تغييرات في طاقة MST. في إصدارات البرامج القديمة ، يمكن تعيين هذا من 0 إلى 100 ؛ وفي الإصدارات الأحدث ، يمكن للمرء تحديد MST منخفض أو متوسط أو مرتفع. لتحقيق آثار قوية ، قد يحتاج الباحث إلى تجربة كل من هذه وتحديد إعداد MST الذي ينتج عنه أقوى البيانات لتفاعل معين.

Protocol

1. إعداد المواد

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 mM NaCl ، 2.5 mM KCl ، 10 mM NaH2PO4 ، و 2 mM _{KH2PO4 ،} الرقم الهيدروجيني 7.41.
2. تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.
3. Express Vam7-His8 – البروتين كبروتين اندماج في الإشريكية القولونية وتنقيته باستخدام Ni-NTA وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ⁸.
4. معايرة التحليل في المخزن المؤقت PBS. إذا كان التحليل في مخزن مؤقت مختلف ، فإن MST المسمى ليس حساسا بشكل خاص للاختلافات الطفيفة في المخزن المؤقت من جزيئات مثل DMSO ، ما لم تتفاعل محتويات المخزن المؤقت التحليلي مع البروتين الموسوم.

2. إعداد جهاز MST

1. قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
2. افتح برنامج التحكم وتأكد من أن الكمبيوتر المحمول قيد التشغيل وفي حالة اتصال على الكمبيوتر المتصل بالجهاز.
3. أدخل إعدادات التألق وMST لهذه التجربة. اضبط MST قبل 3 ثوان ، MST على 30 ثانية ، واستعادة التألق (Fluo.) بعد 1 ثانية. قبل قياس التألق الأولي ولا يتطلب وقتا طويلا ؛ MST هو مقدار الوقت الفعلي للوصول إلى التوازن بعد الحث الحراري.
4. جدول الشعيرات الدموية: لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الهدف (الليغاند)، واسم الليكاند (التحليل)، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز معايرة بالتحليل الحجمي واستخدم نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي التلقائي. على سبيل المثال، أدخل 50 نانومتر للتركيز المستهدف ل Vam7-His8، Vam7-His8 للاسم المستهدف، (1,2-dioctanoyl phosphatidic acid) Di-C8 PA لاسم الليغاند، وأعلى تركيز لليجند الذي يحدد 1:1 ويسحب لأسفل إلى فتحات التعبئة التلقائية 2-16.
5. قم بتشغيل Cap Scan لتحديد LED المناسب (20٪ LED (الإعداد المسبق)) استنادا إلى إشارة البروتين المستهدف وضبط ما بين 200 و 2000 وحدة تألق ل MST الملصقة. يجب أن تظهر عمليات مسح الغطاء قمم مستديرة موحدة على شكل جرس.
6. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل منها لاختبار ملاءمة الربط الأكثر قوة واضغط على Start Cap Scan + Measurement ، ومسح قيم مختلفة لتحديد أفضل ظروف التشغيل لتفاعل معين يتم اختباره.
7. حدد طاقة MST بأفضل ملاءمة باستخدام برنامج التحليل والإعداد المسبق للرحلان الحراري باستخدام Tjump. قم بتحليل الملاءمة وفقا لمعظم الفصل الفلوري بين أدنى وأعلى تركيز مقارنة بقوة MST مع أفضل ملاءمة وحدد طاقة MST للتجارب المتماثلة.
8. حدد ما إذا كان التبييض الضوئي قد حدث بين التشغيل الأول والثاني من خلال الانتقال إلى برنامج التحليل وتحويل التحليل إلى وضع الخبراء. بعد ذلك ، حدد التألق بدلا من الرحلان الحراري للتحليل. حدد وضع الخبير ثم التبييض الضوئي.

3. إعداد عينات ل MST المسمى

1. أحضر محلول Vam7-His8 إلى تركيز 200 نانومتر في PBS بدون Tween.
2. اجلب صبغة NTA-Atto 647 إلى 100 نانومتر في PBS بدون Tween.
3. امزج صبغة Vam7-His8 و NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة المغطاة بالضوء لمدة 30 دقيقة. حدد التركيز المناسب للبروتين المستهدف كما هو موضح في القسم 2.5 (انظر الملحق الخاص باستخدام KD من صبغة Ni-NTA كما هو موضح في الفيديو).
4. خليط أجهزة الطرد المركزي من صبغة NTA-Atto 647 N والبروتين لمدة 10 دقائق في غرفة مظلمة باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة عند حوالي 8,161 × جم.
5. قم بتخزين الخليط على درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد التجربة أو على الجليد أثناء التجربة لإعادة استخدامه في غضون ساعات قليلة إذا لزم الأمر من أجل الحفاظ على البروتين من تغيير طبيعة البشرة.
6. استخدم مكتشف تركيز NT لتحديد نطاق التركيز اللازم للمعايرة بالتحليل الحجمي.
7. اجلب Di-C8 PA إلى الحد الأقصى المناسب من التركيز في الماء.
8. معايرة التحليل باستخدام تخفيف تسلسلي 1: 1 في المخزن المؤقت PBS ل 16 تركيزا استنادا إلى الخطوة السابقة. على عكس SPR ، فإن الرحلان الحراري ليس حساسا لاختلافات المخزن المؤقت.

4. MST من العينات

1. قم بتشغيل الجهاز والكمبيوتر المحمول المرفق.
2. اضغط على السهم لأعلى في الجزء الأمامي من الماكينة وحرك الرف الشعري للخارج.
3. قم بتحميل الشعيرات الدموية في الحامل بأعلى تركيز في الموضع 1.
4. في برنامج التحكم، حدد القناة الحمراء المقابلة ل NTA-Atto 647 N.
5. أدخل معلومات التركيز والموضع والاسم لكل شعيرات دموية في جدول الشعيرات الدموية.
6. قم بإجراء فحص شعري عن طريق الضغط على Start Cap Scan بنسبة 20٪ LED (الإعداد المسبق) وضبطه وفقا لما بين 200 و 2000 وحدة تألق باستخدام إعدادات كثافة LED أو تركيز ligand (البروتين المسمى ).
7. حدد نطاقا من طاقة MST.
8. بدء مسح الغطاء + قياس MST.
9. تحليل باستخدام برنامج التحليل.

5. تحليل بيانات MST

ملاحظة: برنامج التحليل الذي توفره Nanotemper هو ملكية خاصة ويتم إجراؤه باستخدام M.O. Affinity Analysis. هناك طرق مختلفة لقياس التقاربات الملزمة بناء على التألق أو الرحلان الحراري. يتم إعداد الإصدارات الأحدث من هذا البرنامج مسبقا لتقييم البيانات تلقائيا باستخدام الرحلان الحراري ويتم إعدادها مسبقا لاستخدام Thermophoresis مع الاستفادة من Tjump من كلا القياسين. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء اختيار إما Tjump وحده أو Thermophoresis وحده. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج التحليل بقياسات التقارب المقدرة باستخدام التألق الأولي. يمكن الوصول إلى هذه الإعدادات في وضع الخبراء فقط.

1. قم بتعيين استراتيجية التقييم في برنامج التحليل إلى خبير عن طريق النقر فوق المربع الخاص بصاعقة البرق بجوار مجموعة بيانات في شاشة اختيار البيانات. تم إعداد برنامج التحليل مسبقا للتحليل إلى تحليل MST ؛ ومع ذلك ، يمكن للباحث تحديد إنشاء تحليل جديد وتحديد تحليل التألق الأولي من أجل تقدير التقاربات الملزمة بناء على التألق الأولي. وضع الخبراء متاح أيضا للتألق الأولي. في التحليل الموضح أدناه ، تم استخدام الرحلان الحراري و Tjump لتحديد KD للعرض المقدم من Vam7-His8 مع ركيزته الطبيعية ، حمض الفوسفاتيديك الدهني.

النتائج

هذا هو إخراج عينة باستخدام تحليل التقارب. تم استخدام MST المسمى لتحديد ثابت ربط Vam7-His8 إلى ثنائي الأوكتانويل القابل للذوبان (DiC8) PA لإحدى ركائزه ^{الطبيعية9}. يعرض الشكل 1 الآثار الحرارية من تجربة واحدة لمعايرة 1: 1 من DiC8 PA بدءا من 500 ميكرومتر مقابل 50 نانومتر من Vam7-His8. يتم...

Discussion

وفر تحديد Vam7-His8binding إلى DiC8-PA KD مناسبا قويا للتفاعل المعطى ، وهو تقارب أقل قليلا من _KD المقاس من Vam7-His8 إلى الجسيمات الشحمية PA (غير المنشورة). ويرجع هذا الاختلاف على الأرجح إلى عدم وجود غشاء، مما يؤدي عموما إلى انخفاض التقارب مع تفاعلات ربط الدهون الخاصة بالغشاء، ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments