Utilisation de la thermophorèse à micro-échelle pour mesurer les interactions protéine-lipide

Résumé

La thermophorèse à micro-échelle permet d’obtenir rapidement des constantes de liaison à faible coût matériel. La thermophorèse micro-échelle étiquetée ou sans étiquette est disponible dans le commerce; cependant, la thermophorèse sans étiquette n’est pas capable de la diversité des mesures d’interaction qui peuvent être effectuées à l’aide d’étiquettes fluorescentes. Nous fournissons un protocole pour les mesures de thermophorèse marquées.

Résumé

La capacité de déterminer l’affinité de liaison des lipides aux protéines est un élément essentiel de la compréhension des interactions protéine-lipide dans le trafic membranaire, la transduction du signal et le remodelage cytosquelettique. Les outils classiques pour mesurer de telles interactions comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Bien qu’elles soient des outils puissants, ces approches présentent des revers. L’ITC nécessite de grandes quantités de protéines purifiées ainsi que des lipides, ce qui peut être coûteux et difficile à produire. De plus, l’ITC ainsi que le SPR prennent beaucoup de temps, ce qui pourrait augmenter considérablement le coût de la réalisation de ces expériences. Une façon de contourner ces restrictions est d’utiliser la technique relativement nouvelle de la thermophorèse à micro-échelle (MST). MST est rapide et rentable en utilisant de petites quantités d’échantillon pour obtenir une courbe de saturation pour un événement de liaison donné. Il existe actuellement deux types de systèmes MST disponibles. Un type de TMS nécessite un étiquetage avec un fluorophore dans le spectre bleu ou rouge. Le second système repose sur la fluorescence intrinsèque des acides aminés aromatiques dans la gamme UV. Les deux systèmes détectent le mouvement des molécules en réponse à l’induction localisée de la chaleur d’un laser infrarouge. Chaque approche a ses avantages et ses inconvénients. MST sans étiquette peut utiliser des protéines natives non marquées; cependant, de nombreux analytes, y compris les produits pharmaceutiques, fluorescent dans la gamme UV, ce qui peut interférer avec la détermination de valeurs KD précises. En comparaison, le MST marqué permet une plus grande diversité d’interactions mesurables par paires en utilisant des sondes marquées par fluorescence attachées à des ligands avec des absorbances mesurables dans la gamme visible par opposition aux UV, limitant le potentiel d’interférence des signaux des analytes.

Introduction

La thermophorèse à micro-échelle est une technique relativement nouvelle pour déterminer les constantes de dissociation (KD) ainsi que les constantes d’inhibition (_IC50) entre les ligands biochimiquement pertinents. Le principal détaillant commercial de MST (par exemple, NanoTemper) propose deux technologies MST populaires : 1) MST sans étiquette nécessitant une étiquette fluorescente, et 2) thermophorèse marquée utilisant la fluorescence inhérente des protéines en fonction du nombre de résidus aromatiques présents dans chaque ^protéine1. Un inconvénient de la thermophorèse sans étiquette est que, dans la plupart des cas, elle ne permet pas de mesurer les interactions protéine-protéine. Cependant, il peut être possible de concevoir des protéines sans acides aminés aromatiques tels que le tryptophane pour une utilisation dans la thermophorèse sans ^étiquette2.

MST mesure le mouvement des particules en réponse à l’induction de champs de température microscopiques initiés par un laser infrarouge dans les technologies actuellement ^disponibles1. MST peut être utilisé pour mesurer les interactions protéine-protéine, les interactions protéine-lipide, la protéine-petite molécule, les expériences de compétition et même les interactions entre petites molécules tant que l’on peut produire suffisamment de séparation du signal. De plus, MST permet de mesurer les interactions membrane-protéine intégrées dans les liposomes ou les nanodisques. La thermophorèse marquée tire parti de l’utilisation d’étiquettes marquées par fluorescence permettant une séparation chimiquement contrôlable du signal entre le ligand et l’analyte. Les valeurs de KD peuvent être obtenues par thermophorèse pour les interactions impliquant la liaison aux protéines à de faibles concentrations nanomolaires, ce qui dans la plupart des cas est une concentration de protéines beaucoup plus faible que ce qui est nécessaire pour la calorimétrie isotherme (ITC)³. De plus, MST n’a pas d’exigences strictes en matière de tampon comme requis pour la résonance plasmonique de surface (SPR)⁴ et la thermophorèse marquée peut même être utilisée pour mesurer les constantes de liaison des protéines d’intérêt à partir de solutions protéiques non entièrement purifiées5 avec des étiquettes fluorescentes génétiquement ^insérées6. Un inconvénient de MST est que les paramètres cinétiques ne peuvent pas être obtenus facilement pour MST comme dans ^SPR2.

Les mesures de thermophorèse dépendent de la différence de température locale d’une solution. Cette chaleur peut être générée à partir d’un laser infrarouge. Le dispositif MST dispose d’un détecteur de fluorescence couplé à un faisceau infrarouge (IR) et peut détecter les changements de fluorescence à partir des changements de concentration locaux des molécules fluorescentes au point où le laser IR est ciblé. Le dispositif MST utilise un laser ciblé IR couplé directement à un détecteur de fluorescence focalisé au même point que la chaleur générée dans la solution. Cela permet une détection robuste des changements de température correspondant à l’épuisement des molécules au point de chaleur généré par le laser IR. La fluorescence mesurée diminue généralement plus près du laser IR en réponse à l’augmentation de la température. Les différences mesurées en conséquence peuvent être dues à plusieurs facteurs, notamment la charge, la taille ou l’entropie de solvatation. Ces différences sont mesurées comme des changements de fluorescence en réponse à l’induction de chaleur ou au mouvement de molécules des parties chaudes vers les parties plus froides du capillaire.

Lors du chargement d’un capillaire avec une solution donnée, il est important de laisser de l’air à chaque extrémité du capillaire et de ne pas charger complètement le capillaire. Le capillaire commercial contient environ 10 μL de solution. On peut obtenir des mesures précises avec 5 μL de solution tant que la solution est manipulée au centre du capillaire, qu’il n’y a pas de bulles d’air (potentiellement dégazées avant le chargement capillaire), et qu’on charge soigneusement le rack pour ne pas bousculer la solution du centre du capillaire, où le laser infrarouge est ciblé. Si le laser n’entre pas complètement en contact avec la solution, le résultat sera très probablement l’une des trois sorties inutilisables pour cette concentration: 1) détection de fluorescence nulle ou faible, 2) détection de fluorescence plus élevée (potentiellement avec pic déchiqueté), ou 3) détection de fluorescence dans d’autres valeurs à partir d’un titrage donné, mais avec un pic déchiqueté et non arrondi.

Pour la thermophorèse marquée, il est optimal d’avoir un signal de fluorescence supérieur à 200 et inférieur à 2000 unités de ^{fluorescence7}. L’appareil MST utilise une gamme d’intensités LED de 0 à 100, qui peuvent être sélectionnées pour obtenir un signal supérieur à 200 ou inférieur à 2000. Alternativement, on peut utiliser différentes concentrations du ligand marqué pour modifier le signal de fluorescence à un niveau optimal. Il est important d’exécuter un scan de capuchon avec une mesure MST donnée comme référence lors de l’analyse des données, car un mauvais scan de capuchon peut souvent entraîner un point qui peut être déterminé plus tard comme une valeur aberrante. Chaque exécution devrait prendre environ 30 minutes si vous mesurez une seule puissance MST avec un scan de capuchon. Les appareils commerciaux permettent des changements dans la puissance MST. Dans les anciennes versions du logiciel, cela pouvait être réglé de 0 à 100; et dans les versions ultérieures, on peut sélectionner un MST faible, moyen ou élevé. Pour obtenir des traces robustes, un chercheur peut avoir besoin d’essayer chacun d’entre eux et de décider quel paramètre MST donne les données les plus robustes pour une interaction donnée.

Protocole

1. Préparation des matériaux

1. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 137 mM naCl, 2,5 mM KCl, 10 mM _NaH2PO4 et 2 mM _KH2PO4, pH 7,41.
2. Préparez le colorant NTA-Atto 647 N. Diluer le colorant NTA-Atto 647 N à 100 nM d’une solution de DMSO à 100% dans du PBS sans interpolation.
3. Express Vam7-His8 – Protéine en tant que protéine de fusion dans E. coli et purifier à l’aide de Ni-NTA et de chromatographie d’exclusion de ^taille8.
4. Titrez l’analyte dans le tampon PBS. Si l’analyte se trouve dans un tampon différent, le MST marqué n’est pas particulièrement sensible aux différences de tampon mineures par rapport à des molécules telles que le DMSO, à moins que le contenu du tampon de l’analyte n’interagisse avec la protéine marquée.

2. Préparation du dispositif MST

1. Allumez l’interrupteur d’alimentation à l’arrière de l’appareil.
2. Ouvrez le logiciel de contrôle et assurez-vous que l’ordinateur portable est allumé et connecté sur l’ordinateur connecté à l’appareil.
3. Entrez les paramètres de fluorescence et de MST pour cette expérience. Réglez MST Before sur 3 s, MST sur 30 s et Fluorescence recovery (Fluo.) après 1 s. Avant mesure la fluorescence initiale et ne nécessite pas de longs temps; MST est la durée réelle d’équilibre à atteindre après l’induction de la chaleur.
4. Tableau des capillaires : Pour chaque tube capillaire, entrez le nom de la cible (ligand), le nom du ligand (analyte), la concentration de la cible et la concentration de titrage la plus élevée et utilisez le rapport de titrage automatique. Par exemple, entrez 50 nM pour la concentration cible de Vam7-His8, Vam7-His8 pour le nom de la cible, (acide phosphatidique 1,2-dioctanoïque) Di-C8 PA pour le nom du ligand, et la concentration la plus élevée le ligand sélectionnant 1:1 et faisant glisser vers le bas jusqu’aux emplacements de remplissage automatique 2-16.
5. Exécutez un Cap Scan pour sélectionner la LED appropriée (LED à 20 % (préréglage)) en fonction du signal de la protéine cible et ajustez entre 200 et 2000 unités de fluorescence pour le MST marqué. Les scans de capuchon doivent montrer des pics arrondis uniformes en forme de cloche.
6. Sélectionnez une plage de puissances MST et entrez des valeurs pour chacune d’elles afin de tester l’ajustement de liaison le plus robuste et appuyez sur Start Cap Scan + Measurement, en scannant différentes valeurs pour déterminer les meilleures conditions de fonctionnement pour une interaction donnée testée.
7. Déterminez la puissance MST avec le meilleur ajustement à l’aide du logiciel d’analyse et du préréglage pour la thermophorèse avec Tjump. Analysez les ajustements en fonction de la plupart des séparations de fluorescence entre la concentration la plus faible et la plus élevée par rapport à la puissance MST avec le meilleur ajustement et sélectionnez la puissance MST pour les essais répliqués.
8. Déterminez si le photoblanchiment s’est produit entre la première et la deuxième exécution en accédant au logiciel d’analyse et en passant l’analyse en mode expert. Ensuite, sélectionnez la fluorescence au lieu de la thermophorèse pour l’analyse. Sélectionnez le mode expert, puis le photoblanchiment.

3. Préparation des échantillons pour le MST étiqueté

1. Amener la solution Vam7-His8 à une concentration de 200 nM dans PBS sans interpolation.
2. Porter le colorant NTA-Atto 647 à 100 nM en PBS sans interpolation.
3. Mélanger le colorant Vam7-His8 et NTA-Atto 647 à un rapport volumétrique de 1:1 et laisser reposer à température ambiante à couvert de lumière pendant 30 min. Déterminer la concentration appropriée de protéine cible comme indiqué à la rubrique 2.5 (voir supplément sur l’utilisation de KD du colorant Ni-NTA comme illustré dans la vidéo).
4. Mélange centrifuge de colorant NTA-Atto 647 N et de protéines pendant 10 min dans une pièce sombre à l’aide d’une centrifugeuse de table à environ 8 161 x g.
5. Conserver le mélange à 4 °C après l’expérience ou sur de la glace pendant l’expérience pour le réutiliser en quelques heures si nécessaire afin d’empêcher la dénaturation des protéines.
6. Utilisez le détecteur de concentration NT pour déterminer la plage de concentration nécessaire au titrage.
7. Amener di-C8 PA à une concentration maximale appropriée dans l’eau.
8. Titrer l’analyte à l’aide d’une dilution en série de 1:1 dans un tampon PBS pour 16 concentrations en fonction de l’étape précédente. Contrairement à la SPR, la thermophorèse n’est pas aussi sensible aux différences de tampon.

4. TMS des échantillons

1. Allumez l’appareil et l’ordinateur portable connecté.
2. Appuyez sur la flèche vers le haut à l’avant de la machine et faites glisser le rack capillaire vers l’extérieur.
3. Charger les capillaires dans le rack avec la concentration la plus élevée à la position 1.
4. Dans le logiciel de contrôle, sélectionnez le canal rouge correspondant à NTA-Atto 647 N.
5. Entrez les informations de concentration, de position et de nom pour chaque capillaire dans le tableau des capillaires.
6. Exécutez un balayage capillaire en appuyant sur Démarrer le scan du capuchon à 20% de LED (préréglé) et ajustez en fonction de 200 à 2000 unités de fluorescence en utilisant les paramètres d’intensité de la LED ou la concentration de ligand (protéine étiquetée).
7. Sélectionnez une plage de puissance MST.
8. Démarrez Cap Scan + MST Measurement.
9. Analysez à l’aide du logiciel d’analyse.

5. Analyse des données MST

REMARQUE: Le logiciel d’analyse fourni par Nanotemper est propriétaire et est effectué à l’aide de M.O. Affinity Analysis. Il existe différentes façons de mesurer les affinités de liaison en fonction de la fluorescence ou de la thermophorèse. Les versions plus récentes de ce logiciel sont préréglées pour évaluer automatiquement les données à l’aide de la thermophorèse et sont préréglées pour utiliser la thermophorèse avec Tjump en tirant parti des deux mesures. Alternativement, on peut sélectionner soit Tjump seul ou Thermophorèse seul. De plus, le logiciel d’analyse permet d’estimer les mesures d’affinité à l’aide de la fluorescence initiale. Ces paramètres ne sont accessibles qu’en mode expert.

1. Définissez la stratégie d’évaluation dans le logiciel d’analyse sur expert en cliquant sur la case correspondant à l’éclair à côté d’un ensemble de données dans l’écran Sélection des données. Le logiciel d’analyse est préréglé pour analyser à mST Analysis; cependant, un chercheur peut sélectionner Créer une nouvelle analyse et sélectionner Analyse de fluorescence initiale afin d’estimer les affinités de liaison en fonction de la fluorescence initiale. Le mode Expert est également disponible pour la fluorescence initiale. Dans l’analyse décrite ci-dessous, la thermophorèse et le Tjump ont été utilisés pour déterminer la KD de la présentation de Vam7-His8 avec son substrat naturel, l’acide phosphatidique lipidique.

Résultats

Il s’agit d’un exemple de sortie utilisant l’analyse d’affinité. Le MST marqué a été utilisé pour déterminer la constante de liaison du Vam7-His8 au dioctanoyle soluble (DiC8) PA de l’un de ses substrats ^naturels9. La figure 1 présente les traces thermophorétiques d’un essai d’un titrage 1:1 de DiC8 PA à partir de 500 μM contre 50 nM de Vam7-His8. La fluorescence initiale (temps avant l’allumage du laser infrarouge), Tjump (temps initialement...

Discussion

La détermination de Vam7-His8binding à DiC8-PA a fourni un _KD ajusté robuste pour l’interaction donnée, qui est légèrement inférieure à la KD mesurée de Vam7-His8 aux liposomes PA (non publié). Cette différence est très probablement due à l’absence de membrane, ce qui entraîne généralement une affinité plus faible pour les interactions de liaison lipidique spécifiques à la membrane et démontre donc le rôle de l’échafaudage membranaire d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments