Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

Özet

Mikro ölçekli termoforez, düşük malzeme maliyetiyle bağlanma sabitlerini hızlı bir şekilde elde eder. Etiketli veya etiketsiz mikro ölçekli termoforez ticari olarak temin edilebilir; Bununla birlikte, etiketsiz termoforez, floresan etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilecek etkileşim ölçümlerinin çeşitliliğini sağlayamaz. Etiketli termoforez ölçümleri için bir protokol sağlıyoruz.

Özet

Lipitlerin proteinlere bağlanma afinitesini belirleme yeteneği, membran kaçakçılığı, sinyal iletimi ve sitoiskelet yeniden modellemesinde protein-lipid etkileşimlerini anlamanın önemli bir parçasıdır. Bu tür etkileşimleri ölçmek için klasik araçlar arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur. Güçlü araçlar olsa da, bu yaklaşımların aksilikleri vardır. ITC, büyük miktarlarda saflaştırılmış proteinin yanı sıra pahalı ve üretilmesi zor olabilen lipitler gerektirir. Ayrıca, ITC ve SPR çok zaman alıcıdır ve bu da bu deneyleri gerçekleştirmenin maliyetine önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu kısıtlamaları atlamanın bir yolu, nispeten yeni mikro ölçekli termoforez (MST) tekniğini kullanmaktır. MST, belirli bir bağlanma olayı için bir doygunluk eğrisi elde etmek için az miktarda numune kullanarak hızlı ve uygun maliyetlidir. Şu anda iki tür MST sistemi mevcuttur. Bir MST türü, mavi veya kırmızı spektrumda bir florofor ile etiketlemeyi gerektirir. İkinci sistem, UV aralığındaki aromatik amino asitlerin içsel floresansına dayanır. Her iki sistem de kızılötesi lazerden lokalize ısı indüksiyonuna yanıt olarak moleküllerin hareketini algılar. Her yaklaşımın avantajları ve dezavantajları vardır. Etiketsiz MST, etiketlenmemiş doğal proteinleri kullanabilir; Bununla birlikte, farmasötikler de dahil olmak üzere birçok analit, UV aralığında floresan yapar ve bu da doğru KD değerlerinin belirlenmesine müdahale edebilir. Buna karşılık, etiketli MST, UV'nin aksine görünür aralıkta ölçülebilir absorbanslara sahip ligandlara tutturulmuş floresan etiketli problar kullanılarak ölçülebilir çift yönlü etkileşimlerin daha fazla çeşitliliğine izin verir ve analitlerden gelen sinyallere müdahale etme potansiyelini sınırlar.

Giriş

Mikroölçekli termoforez, biyokimyasal olarak ilgili ligandlar arasındaki ayrışma sabitlerinin (KD) ve inhibisyon sabitlerinin (_IC50) belirlenmesinde nispeten yeni bir tekniktir. MST'nin önde gelen ticari perakendecisi (örneğin, NanoTemper) iki popüler MST teknolojisi sunmaktadır: 1) Floresan etiketi gerektiren etiketsiz MST ve 2) her proteinde bulunan aromatik kalıntıların sayısına bağlı olarak proteinlerin doğal floresansını kullanan etiketli ^termoforez1. Etiketsiz termoforezin bir dezavantajı, çoğu durumda, protein-protein etkileşimlerinin ölçülmesine izin vermemesidir. Bununla birlikte, etiketsiz ^{termoforezde2} kullanılmak üzere triptofan gibi aromatik amino asitler olmadan proteinlerin mühendisliği mümkün olabilir.

MST, şu anda mevcut teknolojilerde kızılötesi lazer tarafından başlatılan mikroskobik sıcaklık alanlarının indüksiyonuna yanıt olarak parçacıkların hareketini ^ölçer1. MST, protein-protein etkileşimlerini, protein-lipit etkileşimlerini, protein-küçük molekülü, rekabet deneylerini ve hatta yeterli sinyal ayrımı üretebildiği sürece küçük moleküller arasındaki etkileşimleri ölçmek için kullanılabilir. Ek olarak, MST, lipozomlara veya nanodisklere gömülü membran-protein bazlı etkileşimlerin ölçülmesine izin verir. Etiketli termoforez, ligand ve analit arasındaki sinyalin kimyasal olarak kontrol edilebilir bir şekilde ayrılmasını sağlayan floresan etiketli etiketlerin kullanılmasından yararlanır. KD değerleri, düşük nanomolar konsantrasyonlarda protein bağlanmasını içeren etkileşimler için termoforez kullanılarak elde edilebilir; bu, çoğu durumda izotermal kalorimetri (ITC) için gerekli olandan çok daha düşük bir protein ^{konsantrasyonudur3}. Ek olarak, MST'nin yüzey plazmon rezonansı (SPR)⁴ için gerekli olan katı tamponlama gereksinimleri yoktur ve etiketli termoforez, genetik olarak yerleştirilmiş floresan etiketleriyle6 tam olarak saflaştırılmamış protein ^{çözeltilerinden5} ilgili proteinlerin bağlanma sabitlerini ölçmek için bile kullanılabilir. MST'nin bir dezavantajı, kinetik parametrelerin ^SPR2'de olduğu gibi MST için kolayca elde edilememesidir.

Termoforez ölçümleri, bir çözeltinin yerel sıcaklık farkına bağlıdır. Bu ısı kızılötesi lazerden üretilebilir. MST cihazı, kızılötesi (IR) ışına bağlı bir floresan dedektörüne sahiptir ve IR lazerin hedeflendiği noktada floresan moleküllerinin yerel konsantrasyon değişikliklerinden floresandaki değişiklikleri alabilir. MST cihazı, doğrudan çözeltide ısının üretildiği aynı noktaya odaklanmış bir floresan dedektörüne bağlı IR hedefli bir lazer kullanır. Bu, IR lazer tarafından üretilen ısı noktasında moleküllerin tükenmesine karşılık gelen sıcaklıktaki değişikliklerin sağlam bir şekilde algılanmasını sağlar. Ölçülen floresan genellikle sıcaklık artışlarına yanıt olarak IR lazere daha yakın azalır. Sonuç olarak ölçülen farklılıklar, yük, boyut veya çözme entropisi gibi çoklu faktörlerden kaynaklanabilir. Bu farklılıklar, ısı indüksiyonuna veya moleküllerin kılcal damarın sıcaktan soğuk kısımlarına hareketine yanıt olarak floresandaki değişiklikler olarak ölçülür.

Bir kılcal damarı belirli bir çözelti ile yüklerken, kılcal damarın her iki ucunda hava bırakmak ve kılcal damarı tamamen doldurmamak önemlidir. Ticari kılcal damar yaklaşık 10 μL çözelti tutar. Çözelti kılcal damarın merkezine manipüle edildiği sürece, 5 μL çözelti ile doğru ölçümler elde edilebilir, hava kabarcıkları yoktur (kılcal damar yüklenmeden önce potansiyel olarak gazdan arındırılır) ve biri, çözeltiyi kızılötesi lazerin hedeflendiği kılcal damarın merkezinden itmemek için rafı yüklerken dikkatli olur. Lazer çözelti ile tam olarak temas etmezse, sonuç büyük olasılıkla bu konsantrasyon için üç kullanılamaz çıkıştan biri olacaktır: 1) hiç veya düşük floresan algılama, 2) daha yüksek floresan algılama (potansiyel olarak pürüzlü tepe noktasıyla) veya 3) verilen titrasyondan diğer değerler içinde floresan algılama, ancak pürüzlü ve yuvarlanmamış bir tepe noktasıyla.

Etiketli termoforez için, 200'ün üzerinde ve 2000 floresan ünitesinin altında bir floresan sinyaline sahip olmak en ^uygunudur7. MST cihazı, 200'ün üzerinde veya 2000'in altında bir sinyal elde etmek için seçilebilen 0 ila 100 arasında bir dizi LED yoğunluğu kullanır. Alternatif olarak, floresan sinyalini optimum seviyeye getirmek için etiketli ligandın farklı konsantrasyonları kullanılabilir. Verileri analiz ederken referans olarak belirli bir MST ölçümüne sahip bir kapak taraması çalıştırmak önemlidir, çünkü zayıf bir kapak taraması genellikle daha sonra aykırı değer olarak belirlenebilecek bir noktaya neden olabilir. Bir kapak taraması ile tek bir MST gücü ölçülürse her çalıştırma yaklaşık 30 dakika sürmelidir. Ticari cihazlar MST gücünde değişikliklere izin verir. Eski yazılım sürümlerinde bu, 0'dan 100'e kadar ayarlanabilir; ve sonraki sürümlerde düşük, orta veya yüksek MST seçilebilir. Sağlam izler elde etmek için, bir araştırmacının bunların her birini denemesi ve hangi MST ayarının belirli bir etkileşim için en sağlam verilerle sonuçlandığına karar vermesi gerekebilir.

Protokol

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın: 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 ve 2 mM _KH2PO4, pH _7,41.
2. NTA-Atto 647 N boyasını hazırlayın. Stok NTA-Atto 647 N boyasını %100 DMSO çözeltisinden 100 nM'ye kadar ara olmadan PBS'ye seyreltin.
3. Express Vam7-His8 – E. coli'de bir füzyon proteini olarak protein ve Ni-NTA ve boyut dışlama kromatografisi kullanarak saflaştırın8.
4. PBS arabelleğindeki analiteyi titre edin. Analit farklı bir tampondaysa, etiketli MST, analit tamponunun içeriği etiketli protein ile etkileşime girmedikçe, DMSO gibi moleküllerden küçük tampon farklılıklarına özellikle duyarlı değildir.

2. MST cihazının hazırlanması

1. Cihazın arkasındaki güç düğmesini açın.
2. Kontrol yazılımını açın ve dizüstü bilgisayarın açık ve cihaza bağlı bilgisayarda bağlı durumda olduğundan emin olun.
3. Bu deney için floresan ve MST ayarlarını girin. MST'yi 3 sn'ye, MST'yi 30 sn'ye ve 1 sn'den sonra Floresan geri kazanımını (Fluo.) ayarlayın. İlk floresan ölçümlerinden önce ve uzun süre gerektirmez; MST, ısı indüksiyonundan sonra dengeye ulaşılması gereken gerçek süredir.
4. Kılcal Damarlar Tablosu: Her kılcal boru için hedefin adını (ligand), ligandın adını (analit), hedefin konsantrasyonunu ve en yüksek titrasyon konsantrasyonunu girin ve otomatik doldurma titrasyon oranını kullanın. Örneğin, Vam7-His8'in hedef konsantrasyonu için 50 nM, hedef adı için Vam7-His8, ligand adı için (1,2-dioctanoyl fosfatidik asit) Di-C8 PA ve ligandın en yüksek konsantrasyonunu 1:1'i seçip 2-16 yuvalarına sürükleyerek girin.
5. Hedef proteinin sinyaline göre uygun LED'i (%20 LED (ön ayar)) seçmek için bir Cap Scan çalıştırın ve etiketli MST için 200 ila 2000 floresan birimi arasında ayarlama yapın. Kapak Taramaları düzgün yuvarlak çan şeklindeki tepeleri göstermelidir.
6. Bir dizi MST gücü seçin ve en sağlam bağlama uyumunu test etmek için her biri için değerler girin ve Test edilen belirli etkileşim için en iyi çalışma koşullarını belirlemek üzere farklı değerleri tarayarak Kapak Taramasını Başlat + Ölçüm'e basın.
7. Analiz yazılımını ve Tjump ile termoforez için ön ayarı kullanarak MST gücünü en uygun şekilde belirleyin. En düşük ve en yüksek konsantrasyon arasındaki çoğu floresan ayrımına göre, en uygun MST gücüne kıyasla uyumları analiz edin ve çoğaltma denemeleri için MST gücünü seçin.
8. Analiz yazılımına gidip analizi uzman moduna geçirerek birinci ve ikinci çalıştırma arasında fotobeyazlatmanın gerçekleşip gerçekleşmediğini belirleyin. Ardından, analiz için termoforez yerine floresan seçin. Uzman modunu ve ardından fotobeyazlatmayı seçin.

3. Etiketli MST için numunelerin hazırlanması

1. Vam7-His8 çözeltisini PBS'de Ara olmadan 200 nM konsantrasyona getirin.
2. NTA-Atto 647 boyasını Arasız PBS'de 100 nM'ye getirin.
3. Vam7-His8 ve NTA-Atto 647 boyasını 1:1 hacimsel oranda karıştırın ve 30 dakika boyunca ışıkla kaplı oda sıcaklığında oturmaya bırakın. Bölüm 2.5'te olduğu gibi hedef proteinin uygun konsantrasyonunu belirleyin (videoda gösterildiği gibi Ni-NTA boyasının KD'sinin kullanımına ilişkin eke bakınız ).
4. NTA-Atto 647 N boya ve protein karışımının karanlık bir odada 10 dakika boyunca yaklaşık 8.161 x g'de bir masa üstü santrifüj kullanılarak santrifüj edilmesi.
5. Deneyden sonra karışımı 4 ° C'de veya deney sırasında proteinin denatüre olmasını önlemek için gerekirse birkaç saat içinde tekrar kullanılmak üzere buz üzerinde saklayın.
6. Titrasyonla ilgili gereken konsantrasyon aralığını belirlemek için NT konsantrasyon bulucuyu kullanın.
7. Di-C8 PA'yı suda uygun maksimum konsantrasyona getirin.
8. PBS tamponunda 1:1 seri seyreltme kullanarak önceki adıma göre 16 konsantrasyon için analiti titre ettirin. SPR'den farklı olarak, termoforez tampon farklılıklarına karşı hassas değildir.

4. Örneklerin MST'si

1. Cihazı ve bağlı dizüstü bilgisayarı açın.
2. Makinenin önündeki yukarı oka basın ve kılcal rafı dışarı kaydırın.
3. Kılcal damarları rafa 1. konumda en yüksek konsantrasyonla yükleyin.
4. Kontrol yazılımında, NTA-Atto 647 N'ye karşılık gelen Kırmızı Kanalı seçin.
5. Kılcal Damarlar Tablosuna her kılcal damar için konsantrasyon, konum ve isim bilgilerini girin.
6. Start Cap Scan (% 20 LED'de (ön ayar) tuşuna basarak kılcal bir tarama yapın ve LED yoğunluk ayarlarını veya ligand konsantrasyonunu (etiketli protein) kullanarak 200 ila 2000 floresan ünitesine göre ayarlayın.
7. Bir MST gücü aralığı seçin.
8. Cap Scan + MST Ölçümü'nü başlatın.
9. Analiz yazılımını kullanarak analiz edin.

5. MST verilerinin analizi

NOT: Nanotemper tarafından sağlanan analiz yazılımı tescillidir ve M.O. Affinity Analysis kullanılarak gerçekleştirilir. Floresan veya termoforeze dayalı bağlanma afinitelerini ölçmenin farklı yolları vardır. Bu yazılımın daha yeni sürümleri, termoforez kullanarak verileri otomatik olarak değerlendirmek için önceden ayarlanmıştır ve her iki ölçümden de yararlanarak Tjump ile Termoforezi kullanmak üzere önceden ayarlanmıştır. Alternatif olarak, tek başına Tjump veya tek başına Termoforez seçilebilir. Ek olarak, analiz yazılımı ilk floresan kullanılarak tahmini afinite ölçümlerine izin verir. Bu ayarlara yalnızca uzman modunda erişilebilir.

1. Veri Seçimi ekranında bir veri kümesinin yanındaki şimşek kutusunu tıklatarak analiz yazılımındaki değerlendirme stratejisini uzmana ayarlayın. Analiz Yazılımı, MST Analizini analiz etmek için önceden ayarlanmıştır; Bununla birlikte, bir araştırmacı Yeni Analiz Oluştur'u seçebilir ve ilk floresana dayalı bağlanma afinitelerini tahmin etmek için İlk Floresan Analizi'ni seçebilir. İlk floresan için uzman modu da mevcuttur. Aşağıda açıklanan analizde, doğal substratı olan lipid fosfatidik asit ile Vam7-His8'in sunulan _KD'sini belirlemek için termoforez ve Tjump kullanılmıştır.

Sonuçlar

Bu, benzeşim analizini kullanan örnek bir çıktıdır. Etiketli MST, Vam7-His8'in doğal substratlarından birinin çözünür dioktanoyl (DiC8) PA'sına bağlanma sabitini belirlemek için ^{kullanıldı9}. Şekil 1, 50 nM Vam7-His8'e karşı 500 μM'den başlayan 1:1 DiC8 PA titrasyonunun bir denemesinden elde edilen termoforetik izleri sunmaktadır. İlk floresan (kızılötesi lazer açılmadan önceki zaman), Tjump (başlangıçta kızılötesi lazer açıldıkta...

Tartışmalar

Vam7-His8'in DiC8-PA'ya bağlanmasının belirlenmesi, verilen etkileşim için sağlam bir _KD sağladı; bu, Vam7-His8'in ölçülen KD'sinden PA lipozomlarına (yayınlanmamış) biraz daha düşük afinitedir. Bu fark büyük olasılıkla membran eksikliğinden kaynaklanmaktadır, bu da genellikle membrana özgü lipit bağlanma etkileşimleri için daha düşük afinite ile sonuçlanır ve bu nedenle lipozom membran iskelesinin bu etkileşime olan rolünü

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments