שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

Summary

תרמופורזה מיקרומטרית מקבלת קבועי כריכה במהירות בעלות חומר נמוכה. תרמופורזה מיקרו-קשקשית ללא תווית או תווית זמינה מסחרית; עם זאת, תווית תרמופורזה חינם אינו מסוגל מגוון של מדידות אינטראקציה שניתן לבצע באמצעות תוויות פלואורסצנטיות. אנו מספקים פרוטוקול למדידות תרמופורזה מתויגות.

Abstract

היכולת לקבוע את הזיקה המחייבת של שומנים לחלבונים היא חלק חיוני בהבנת אינטראקציות חלבון-שומנים בסחר בממברנות, העברת אותות ושיפוץ ציטוסקיל. כלים קלאסיים למדידת אינטראקציות כאלה כוללים תהודה פלסמון פני השטח (SPR) וקלורימטריה איזותרמית טיטרציה (ITC). בעוד כלים רבי עוצמה, גישות אלה יש מכשולים. ITC דורש כמויות גדולות של חלבון מטוהר, כמו גם שומנים, אשר יכול להיות יקר וקשה לייצר. יתר על כן, ITC, כמו גם SPR הם זמן רב מאוד, אשר יכול להוסיף באופן משמעותי את העלות של ביצוע ניסויים אלה. דרך אחת לעקוף הגבלות אלה היא להשתמש בטכניקה החדשה יחסית של תרמופורזה מיקרומטרית (MST). MST הוא מהיר וחסכוני באמצעות כמויות קטנות של מדגם כדי להשיג עקומת רוויה עבור אירוע איגוד נתון. קיימים כעת שני סוגים של מערכות MST זמינים. סוג אחד של MST דורש תיוג עם פלואורופור בספקטרום הכחול או האדום. המערכת השנייה מסתמכת על הפלואורסצנטיות הפנימית של חומצות אמינו ארומטיות בטווח UV. שתי המערכות מזהות את תנועת המולקולות בתגובה לאינדוקציה מקומית של חום מלייזר אינפרא אדום. לכל גישה יש את היתרונות והחסרונות שלה. MST ללא תוויות יכול להשתמש בחלבונים מקומיים לא מתויגים; עם זאת, ניתוחים רבים, כולל תרופות, פלואורסצ'ה בטווח UV, אשר יכול להפריע לקביעה של ערכי KD מדויקים. לשם השוואה, MST שכותרתו מאפשר מגוון גדול יותר של אינטראקציות הניתנות למדידה של זוג המשתמשות בבדיקות המסומנות בפלואורסצנטיות המצורפות לליגנדים עם ספיגות מדידות בטווח הנראה לעין לעומת UV, מה שמגביל את הפוטנציאל להפרעה לאותות מניתוחים.

Introduction

תרמופורזה מיקרומטרית היא טכניקה חדשה יחסית בקביעת קבועי ניתוק (KD) כמו גם קבועי עיכוב (_IC50) בין ליגנדים רלוונטיים מבחינה ביוכימית. הקמעונאית המסחרית המובילה עבור MST (למשל, NanoTemper) מציעה שתי טכנולוגיות MST פופולריות: 1) תווית MST חינם הדורש תג פלואורסצנטי, ו 2) מתויג תרמופורזה באמצעות פלואורסצנטיות אינהרנטית של חלבונים התלויים במספר שאריות ארומטיות הקיימות בכל ^חלבון1. חיסרון של תרמופורזה ללא תווית הוא שברוב המקרים, זה לא מאפשר מדידה של אינטראקציות חלבון-חלבון. עם זאת, ייתכן שניתן יהיה להנדס חלבונים ללא חומצות אמינו ארומטיות כגון טריפטופן לשימוש בתווית תרמופורזה ^חינם2.

MST מודד את תנועת החלקיקים בתגובה לאינדוקציה של שדות טמפרטורה מיקרוסקופיים ביוזמת לייזר אינפרא אדום בטכנולוגיות הזמינות ^כיום1. MST יכול לשמש למדידת אינטראקציות חלבון-חלבון, אינטראקציות חלבון-שומנים, מולקולה קטנה חלבון, ניסויי תחרות, ואפילו אינטראקציות בין מולקולות קטנות כל עוד אפשר לייצר הפרדת אותות מספיק. בנוסף, MST מאפשר מדידה של אינטראקציות מבוססות חלבון ממברנה המוטמעות בליפוזומים או ננו-דיסקים. תרמופורזה מתויגת מנצלת את השימוש בתגים המסומנים בפלואורסצנטיות ומאפשרים הפרדה כימית מבוקרת של אות בין ליגנד לניתוח. ערכי KD ניתן להשיג באמצעות תרמופורזה לאינטראקציות הכרוכות חלבון מחייב בריכוזים ננומולריים נמוכים, אשר ברוב המקרים הוא ריכוז נמוך בהרבה של חלבון ממה שנדרש עבור קלורימטריה איזותרמית (ITC)³. בנוסף, ל- MST אין דרישות אגירה קפדניות כנדרש לתהודה פלסמון פני השטח (SPR)⁴ ותרמופורזה מתויגת יכולה לשמש אפילו למדידת קבועים מחייבים של חלבונים בעלי עניין מפתרונות חלבון שאינם מטוהרים ^{במלואם5} עם תגי פלואורסצנט שהוכנסו ^גנטית6. חיסרון של MST הוא כי פרמטרים קינטיים לא ניתן להשיג בקלות עבור MST כמו ^SPR2.

מדידות תרמופורזה תלויות בהבדל הטמפרטורה המקומי של פתרון. חום זה יכול להיווצר מלייזר אינפרא אדום. להתקן MST יש גלאי פלואורסצנטי בשילוב עם קרן אינפרא אדום (IR) והוא יכול לקלוט שינויים בפלואורסצנטיות משינויי ריכוז מקומיים של מולקולות הפלואורסצנטיות בנקודה שבה לייזר האינפרא-אדום ממוקד. התקן MST משתמש בלייזר ממוקד IR המחובר ישירות לגלאי פלואורסצנטי הממוקד באותה נקודה שבה נוצר החום בתמיסה. זה מאפשר זיהוי חזק של שינויים בטמפרטורה המתאימים דלדול של מולקולות בנקודת החום שנוצר על ידי לייזר IR. פלואורסצנטיות נמדדת בדרך כלל פוחתת קרוב יותר ללייזר האינפרא-אדום בתגובה לעליית הטמפרטורה. ההבדלים הנמדדים כתוצאה מכך יכולים לנבוע מגורמים מרובים כולל אנטרופיה של מטען, גודל או פתירה. הבדלים אלה נמדדים כשינויים בפלואורסצנטיות בתגובה לאינדוקציה של חום או תנועה של מולקולות מחלקים חמים וקרים יותר של הנימים.

בעת טעינת נימי עם פתרון נתון, חשוב להשאיר אוויר משני קצותיו של נימי ולא לטעון את נימי מלא לחלוטין. הנימים המסחריים מחזיקים כ 10 μL של פתרון. אפשר להשיג מדידות מדויקות עם 5 μL של פתרון כל עוד הפתרון הוא מניפולציה למרכז הנימים, אין בועות אוויר (פוטנציאל degas לפני טעינת נימי), ואחד הוא זהיר טעינת המתלה כדי לא לדחוף את הפתרון ממרכז נימי, שבו לייזר אינפרא אדום ממוקד. אם הלייזר לא בא במגע מלא עם הפתרון, התוצאה תהיה ככל הנראה אחת משלוש יציאות שאינן שמישות עבור ריכוז זה: 1) זיהוי פלואורסצנטיות ללא או נמוך, 2) זיהוי פלואורסצנטי גבוה יותר (פוטנציאלי עם שיא משונן), או 3) זיהוי פלואורסצנטיות בתוך ערכים אחרים מן titration נתון, אבל עם שיא משונן ולא מבוסס.

עבור thermophoresis שכותרתו זה אופטימלי יש אות פלואורסצנטי מעל 200 ומתחת 2000 יחידות פלואורסצנטיות7. התקן MST משתמש במגוון של עוצמות LED מ- 0 עד 100, שניתן לבחור כדי להשיג אות מעל 200 או מתחת ל- 2000. לחלופין, ניתן להשתמש בריכוזים שונים של ליגנד המסומן כדי לשנות את אות הפלואורסצנטיות לרמה אופטימלית. חשוב להריץ סריקת כובע עם מדידת MST נתונה כהפניה בעת ניתוח נתונים, כמו סריקת כובע גרוע יכול לעתים קרובות לגרום לנקודה שעשויה מאוחר יותר להיקבע להיות חריג. כל ריצה צריכה להימשך כ -30 דקות אם מודדים כוח MST יחיד עם סריקת כובע. ההתקנים המסחריים מאפשרים שינויים בכוח MST. בגרסאות תוכנה ישנות יותר ניתן להגדיר זאת מ- 0 עד 100; ובגרסאות מאוחרות יותר ניתן לבחור MST נמוך, בינוני או גבוה. כדי להשיג עקבות חזקים, ייתכן שחוקר יצטרך לנסות כל אחד מאלה ולהחליט איזו הגדרת MST גורמת לנתונים החזקים ביותר עבור אינטראקציה נתונה.

Protocol

1. הכנת חומרים

1. הכן תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS): 137 מ"מ NaCl, 2.5 mM KCl, 10 מ"מ _NaH2PO4, ו 2 mM _KH2PO4, pH 7.41.
2. הכן NTA-אטו 647 N צבע. לדלל את המניה NTA-Atto 647 N צבע ל 100 ננומטר מפתרון 100% DMSO לתוך PBS ללא Tween.
3. Express Vam7-His8 – חלבון כחלבון היתוך ב- E. coli ולטהר באמצעות Ni-NTA וכרוטמוגרפיה של אי הכללת ^גודל8.
4. Titrate את הניתוח במאגר PBS. אם הניתוח נמצא במאגר אחר, MST המסומן בתווית אינו רגיש במיוחד להבדלי מאגר קלים ממולקולות כגון DMSO, אלא אם כן התוכן של מאגר ניתוח אינטראקציה עם חלבון שכותרתו.

2. הכנת התקן MST

1. הפעל את מתג ההפעלה בגב ההתקן.
2. פתח את תוכנת הבקרה וודא שהמחשב הנישא פועל במצב מחובר ובמצב מחובר במחשב המחובר להתקן.
3. הזן הגדרות פלואורסצנטיות ו- MST עבור ניסוי זה. הגדר את MST לפני ל - 3 s, MST על 30 s, ושחזור פלואורסצנטיות (Fluo.) לאחר 1 s. לפני מודד פלואורסצנטיות ראשונית ואינו דורש זמנים ארוכים; MST הוא משך הזמן בפועל עבור שיווי משקל להיות הגיע לאחר אינדוקציה חום.
4. טבלת נימים: עבור כל צינור נימי, הזן את שם המטרה (ליגנד), את שם הליגנד (ניתוח), את ריכוז המטרה, ואת ריכוז טיטרציה הגבוה ביותר ולהשתמש יחס טיטרציה מילוי אוטומטי. לדוגמה, הזן 50 ננומטר עבור ריכוז היעד של Vam7-His8, Vam7-His8 עבור שם היעד, (1,2-dioctanoyl phosphatidic חומצה) Di-C8 PA עבור שם ליגנד, ואת הריכוז הגבוה ביותר ליגנד בחירת 1:1 וגרירה למטה לחריצי מילוי אוטומטי 2-16.
5. הפעל סריקת Cap כדי לבחור את נורית ה- LED המתאימה (20% LED (קבועה מראש)) בהתבסס על האות של חלבון היעד ולהתאים בין 200 ל- 2000 יחידות פלואורסצנטיות עבור MST עם תווית. סריקות כיפה אמורות להציג פסגות אחידות בצורת פעמון מעוגלות.
6. בחר מגוון של כוחות MST והזן ערכים עבור כל אחד מהם כדי לבדוק את התאמת האיגוד החזקה ביותר ולחץ על Start Cap Scan + מדידה, תוך סריקת ערכים שונים כדי לקבוע את תנאי ההפעלה הטובים ביותר עבור אינטראקציה נתונה הנבדקת.
7. קבע את עוצמת ה- MST עם התאמה מיטבית באמצעות תוכנת הניתוח וקביעת התצורה המוגדרת מראש לתרמופורזה עם קפיצה. הניתוח מתאים לפי רוב הפרדת הפלואורסצנטיות בין הריכוז הנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר בהשוואה לעוצמת MST בהתאמה הטובה ביותר ובחר את כוח ה- MST לניסויים משוכפלים.
8. קבע אם הלבנת תמונות התרחשה בין ההפעלה הראשונה לשנייה על-ידי מעבר לתוכנת הניתוח והעברת הניתוח למצב מומחה. לאחר מכן, בחר פלואורסצנטיות במקום תרמופורזה לניתוח. בחר מצב מומחה ולאחר מכן הלבנת תמונות.

3. הכנת דגימות עבור MST שכותרתו

1. הביאו את פתרון Vam7-His8 לריכוז של 200 ננומטר ב-PBS ללא Tween.
2. הביאו את צבע NTA-Atto 647 ל-100 ננומטר ב-PBS ללא Tween.
3. מערבבים את הצבע Vam7-His8 ו- NTA-Atto 647 ביחס נפחי של 1:1 ומאפשרים לשבת בטמפרטורת החדר המכוסה מהאור במשך 30 דקות. לקבוע את הריכוז המתאים של חלבון היעד כמו בסעיף 2.5 (ראה תוספת על ניצול של KD של צבע Ni-NTA כפי שהודגם בסרטון).
4. תערובת צנטריפוגות של צבע NTA-Atto 647 N וחלבון במשך 10 דקות בחדר חשוך באמצעות צנטריפוגה על השולחן בכ 8,161 x גרם.
5. יש לאחסן את התערובת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחר הניסוי או על קרח במהלך הניסוי לשימוש חוזר תוך מספר שעות במידת הצורך, על מנת למנוע מהחלבון להתפרק.
6. השתמש מאתר ריכוז NT כדי לקבוע את טווח הריכוז הדרוש עבור טיטרציה.
7. הביאו את Di-C8 PA לריכוז מרבי מתאים במים.
8. Titrate הניתוח באמצעות דילול סדרתי 1:1 במאגר PBS עבור 16 ריכוזים בהתבסס על השלב הקודם. שלא כמו SPR, תרמופורזה אינה רגישה להבדלי חוצץ.

4. MST של דגימות

1. הפעל את ההתקן ואת המחשב הנייד המצורף.
2. לחץ על החץ למעלה בחזית המכונה והחלק את מתלה הנימים החוצה.
3. טען נימים בארון המתלים עם הריכוז הגבוה ביותר במיקום 1.
4. בתוכנת הבקרה, בחר את הערוץ האדום המתאים ל- NTA-Atto 647 N.
5. הזן פרטי ריכוז, מיקום ושם עבור כל נימי בטבלת הנימים.
6. הפעל סריקה נימית על-ידי לחיצה על Start Cap Scan ב- 20% LED (קבוע מראש) והתאם בהתאם בין 200 ל- 2000 יחידות פלואורסצנטיות באמצעות הגדרות עוצמת LED או ריכוז של ליגנד (חלבון מסומן).
7. בחר טווח של עוצמת MST.
8. הפעלת סריקת אותיות רישיות + מדידת MST.
9. נתח באמצעות תוכנת הניתוח.

5. ניתוח נתוני MST

הערה: תוכנת הניתוח המסופקת על ידי Nanotemper היא קניינית ומבוצעת באמצעות M.O. Affinity Analysis. ישנן דרכים שונות למדוד זיקות מחייבות המבוססות על פלואורסצנטיות או תרמופורזה. גרסאות חדשות יותר של תוכנה זו מוגדרות מראש להערכה אוטומטית של נתונים באמצעות תרמופורזה והן מוגדרות מראש לשימוש בתרמופורזה כאשר Tjump מנצלת את שתי המדידות. לחלופין, ניתן לבחור או Tjump לבד או תרמופורזה לבד. בנוסף, תוכנת הניתוח מאפשרת מדידות קירבה משוערות באמצעות פלואורסצנטיות ראשונית. ניתן לגשת להגדרות אלה במצב מומחה בלבד.

1. הגדר את אסטרטגיית ההערכה בתוכנת הניתוח למומחה על-ידי לחיצה על התיבה עבור הברק לצד ערכת נתונים במסך בחירת נתונים. תוכנת הניתוח מוגדרת מראש לניתוח MST; עם זאת, חוקר יכול לבחור צור ניתוח חדש ולבחור ניתוח פלואורסצנטיות ראשוני על מנת להעריך זיקות מחייבות המבוססות על פלואורסצנטיות ראשונית. מצב מומחה זמין גם עבור פלואורסצנטיות ראשונית. בניתוח המתואר להלן, תרמופורזה ו Tjump שימש כדי לקבוע את KD של הציג של Vam7-His8 עם המצע הטבעי שלה, חומצה פוספטידית השומנים.

תוצאות

זהו פלט לדוגמה באמצעות ניתוח הזיקה. MST שכותרתו שימש כדי לקבוע את הקבוע המחייב של Vam7-His8 כדי dioctanoyl מסיס (DiC8) PA של אחד המצעים הטבעיים ^שלה9. איור 1 מציג את העקבות התרמופורטיים מניסוי אחד של 1:1 Titration של DiC8 PA החל מ-500 מיקרומטר מול 50 ננומטר של Vam7-His8. פלואורסצנטיות ראשונית (ז?...

Discussion

הקביעה של Vam7-His8binding ל- DiC8-PA סיפקה KD מצויד חזק לאינטראקציה הנתונה, שהיא זיקה מעט נמוכה יותר מאשר KD הנמדד של Vam7-His8 לליפוזומים של הרשות הפלסטינית (שלא פורסם). הבדל זה הוא ככל הנראה בשל היעדר ממברנה, אשר בדרך כלל גורם זיקה נמוכה יותר עבור אינטראקציות מחייבות שומנים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments