Использование микромасштабного термофореза для измерения белково-липидных взаимодействий

Резюме

Микромасштабный термофорез быстро получает константы связывания при низких материальных затратах. Микромасштабный термофорез без маркировки или этикетки коммерчески доступен; однако термофорез без меток не способен к разнообразию измерений взаимодействия, которые могут быть выполнены с использованием флуоресцентных этикеток. Мы предоставляем протокол для маркировки измерений термофореза.

Аннотация

Способность определять сродство связывания липидов с белками является неотъемлемой частью понимания белково-липидных взаимодействий в мембранном трафике, сигнальной трансдукции и цитоскелетном ремоделировании. Классические инструменты для измерения таких взаимодействий включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и изотермическую титрационную калориметрию (ITC). Несмотря на то, что эти подходы являются мощными инструментами, они имеют недостатки. ITC требует большого количества очищенного белка, а также липидов, которые могут быть дорогостоящими и трудными в производстве. Кроме того, ЦМТ, а также ОСП отнимают очень много времени, что может значительно увеличить стоимость проведения этих экспериментов. Одним из способов обойти эти ограничения является использование относительно новой техники микромасштабного термофореза (MST). MST является быстрым и экономически эффективным с использованием небольших количеств образца для получения кривой насыщения для данного события связывания. В настоящее время существует два типа систем MST. Один тип MST требует маркировки флуорофором в синем или красном спектре. Вторая система опирается на внутреннюю флуоресценцию ароматических аминокислот в УФ-диапазоне. Обе системы обнаруживают движение молекул в ответ на локализованную индукцию тепла от инфракрасного лазера. Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки. MST без меток может использовать непомеченные нативные белки; однако многие аналиты, включая фармацевтические препараты, флуоресцируют в УФ-диапазоне, что может мешать определению точных значений КД. Для сравнения, меченый MST обеспечивает большее разнообразие измеримых парных взаимодействий с использованием флуоресцентно меченых зондов, прикрепленных к лигандам с измеримыми поглощениями в видимом диапазоне, в отличие от ультрафиолета, ограничивая потенциал для мешающих сигналов от аналитов.

Введение

Микромасштабный термофорез является относительно новым методом определения констант диссоциации (KD), а также констант ингибирования (_IC50) между биохимически значимыми лигандами. Ведущий коммерческий ритейлер MST (например, NanoTemper) предлагает две популярные технологии MST: 1) MST без маркировки, требующей флуоресцентной метки, и 2) меченый термофорез с использованием присущей флуоресценции белков в зависимости от количества ароматических остатков, присутствующих в каждом ^белке1. Недостатком термофореза без меток является то, что в большинстве случаев он не позволяет измерить белково-белковые взаимодействия. Тем не менее, может быть возможно спроектировать белки без ароматических аминокислот, таких как триптофан, для использования в термофорезе без ^меток2.

MST измеряет движение частиц в ответ на индукцию микроскопических температурных полей, инициированных инфракрасным лазером в доступных в настоящее время ^{технологиях1}. MST может быть использован для измерения белково-белковых взаимодействий, белково-липидных взаимодействий, белково-малых молекул, экспериментов с конкуренцией и даже взаимодействий между малыми молекулами, если можно произвести достаточное разделение сигналов. Кроме того, MST позволяет измерять взаимодействия на основе мембранных белков, встроенные либо в липосомы, либо в нанодиски. Меченый термофорез использует преимущества использования флуоресцентно меченых меток, позволяющих химически контролируемое разделение сигнала между лигандом и анализируемым веществом. Значения KD могут быть получены с помощью термофореза для взаимодействий, включающих связывание белка при низких наномолярных концентрациях, что в большинстве случаев является гораздо более низкой концентрацией белка, чем то, что требуется для изотермической калориметрии (ITC)³. Кроме того, MST не имеет строгих требований к буферизации, как это требуется для поверхностного плазмонного резонанса (SPR)⁴, и меченый термофорез может даже использоваться для измерения констант связывания интересующих белков из неполно очищенных белковых ^{растворов5} с генетически вставленными флуоресцентными ^{метками6}. Недостатком MST является то, что кинетические параметры не могут быть легко получены для MST, как в ^SPR2.

Измерения термофореза зависят от локальной разницы температур раствора. Это тепло может генерироваться инфракрасным лазером. Устройство MST имеет флуоресцентный детектор, соединенный с инфракрасным (ИК) лучом, и может улавливать изменения флуоресценции от локальных изменений концентрации флуоресцентных молекул в точке, куда нацелен ИК-лазер. Устройство MST использует ИК-направленный лазер, связанный непосредственно с флуоресцентным детектором, сфокусированным в той же точке, в которой тепло генерируется в растворе. Это позволяет надежно обнаруживать изменения температуры, соответствующие истощению молекул в точке тепла, генерируемого ИК-лазером. Измеренная флуоресценция обычно уменьшается ближе к ИК-лазеру в ответ на повышение температуры. Различия, измеренные в результате, могут быть обусловлены несколькими факторами, включая заряд, размер или энтропию сольватации. Эти различия измеряются как изменения флуоресценции в ответ на индукцию тепла или движение молекул из горячих в более холодные части капилляра.

При загрузке капилляра данным раствором важно оставлять воздух на обоих концах капилляра и не нагружать капилляр полностью. Коммерческий капилляр содержит около 10 мкл раствора. Можно достичь точных измерений с 5 мкл раствора до тех пор, пока раствор манипулируется к центру капилляра, нет пузырьков воздуха (потенциально дегаз перед загрузкой капилляра), и кто-то осторожно загружает стойку, чтобы не толкать раствор из центра капилляра, куда нацелен инфракрасный лазер. Если лазер не вступает в полный контакт с раствором, результатом, скорее всего, будет один из трех непригодных для использования выходов для этой концентрации: 1) обнаружение отсутствия или низкой флуоресценции, 2) обнаружение более высокой флуоресценции (потенциально с зубчатым пиком) или 3) обнаружение флуоресценции в пределах других значений от заданного титрования, но с зубчатым и неокругленным пиком.

Для маркированного термофореза оптимально иметь флуоресцентный сигнал выше 200 и ниже 2000 единиц флуоресценции7. Устройство MST использует диапазон интенсивности светодиодов от 0 до 100, которые могут быть выбраны для достижения сигнала выше 200 или ниже 2000. Альтернативно, можно использовать различные концентрации меченого лиганда для модификации флуоресцентного сигнала до оптимального уровня. При анализе данных важно запускать сканирование колпачка с заданным измерением MST в качестве эталона, так как сканирование плохого колпачка часто может привести к точке, которая впоследствии может быть определена как выброс. Каждый запуск должен занимать около 30 минут при измерении одной мощности MST с помощью сканирования колпачка. Коммерческие устройства позволяют изменять мощность MST. В старых версиях программного обеспечения это может быть установлено от 0 до 100; а в более поздних версиях можно выбрать низкий, средний или высокий MST. Чтобы достичь надежных следов, исследователю может потребоваться попробовать каждый из них и решить, какая настройка MST приводит к наиболее надежным данным для данного взаимодействия.

протокол

1. Подготовка материалов

1. Приготовьте фосфатный буферный физиологический раствор (PBS): 137 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ _NaH2PO4 и 2 мМ _KH2PO4, рН 7,41.
2. Готовят краситель NTA-Atto 647 N. Разбавляйте раствор NTA-Atto 647 N до 100 нМ из 100% раствора ДМСО в PBS без анимации движения.
3. Экспресс Vam7-His8 – Белок в виде белка слияния в кишечной палочке и очистки с помощью Ni-NTA и размерно-эксклюзионной хроматографии8.
4. Титруйте анализируемый элемент в буфере PBS. Если анализируемый элемент находится в другом буфере, меченый MST не особенно чувствителен к незначительным различиям буфера от молекул, таких как DMSO, если только содержимое буфера аналита не взаимодействует с меченым белком.

2. Подготовка прибора MST

1. Включите выключатель питания на задней панели устройства.
2. Откройте управляющее программное обеспечение и убедитесь, что ноутбук включен и подключен к компьютеру, подключенному к устройству.
3. Введите параметры флуоресценции и MST для этого эксперимента. Установите значение MST Before на 3 с, MST на 30 с и восстановление флуоресценции (Fluo.) через 1 с. Перед измерениями начальная флуоресценция и не требует длительного времени; MST - это фактическое количество времени для достижения равновесия после индукции тепла.
4. Таблица капилляров: Для каждой капиллярной трубки введите название мишени (лиганда), название лиганда (анализируемого вещества), концентрацию мишени и самую высокую концентрацию титрования и используйте коэффициент титрования автозаполнения. Например, введите 50 нМ для целевой концентрации Vam7-His8, Vam7-His8 для целевого названия, (1,2-диоктаноилфосфатидная кислота) Di-C8 PA для названия лиганда, а самую высокую концентрацию лиганд выбирает 1:1 и перетаскивает вниз к автозаполнению щелей 2-16.
5. Запустите Сканирование колпачка , чтобы выбрать подходящий светодиод (20% светодиод (предустановленный)) на основе сигнала целевого белка и настроить от 200 до 2000 флуоресцентных блоков для меченого MST. Сканирование колпачков должно показывать однородные округлые колоколообразные пики.
6. Выберите диапазон мощностей MST и введите значения для каждого из них, чтобы проверить наиболее прочную посадку привязки, и нажмите Start Cap Scan + Measurement, сканируя различные значения, чтобы определить наилучшие условия работы для данного тестируемого взаимодействия.
7. Определите мощность MST с наилучшим соответствием с помощью программного обеспечения для анализа и предустановки для термофореза с помощью Tjump. Анализируйте соответствия в соответствии с большинством флуоресцентных разделений между самой низкой и самой высокой концентрацией по сравнению с мощностью MST с наилучшим соответствием и выберите мощность MST для повторных испытаний.
8. Определите, произошло ли фотоотбеливание между первым и вторым запуском, перейдя к программному обеспечению для анализа и переключив анализ в экспертный режим. Затем выберите флуоресценцию вместо термофореза для анализа. Выберите экспертный режим, а затем фотоотбеливание.

3. Подготовка образцов для маркированного MST

1. Доведите раствор Vam7-His8 до концентрации 200 нМ в PBS без анимации движения.
2. Доведите краситель NTA-Atto 647 до 100 нМ в PBS без анимации движения.
3. Смешайте краситель Vam7-His8 и NTA-Atto 647 в объемном соотношении 1:1 и дайте постоять при комнатной температуре, закрытой от света в течение 30 минут. Определить соответствующую концентрацию белка-мишени, как показано в разделе 2.5 (см. Дополнение об использовании КД красителя Ni-NTA, как показано на видео).
4. Центрифужная смесь красителя NTA-Atto 647 N и белка в течение 10 мин в темном помещении с использованием настольной центрифуги весом приблизительно 8,161 х г.
5. Храните смесь при 4 °C после эксперимента или на льду во время эксперимента для повторного использования в течение нескольких часов, если это необходимо, чтобы сохранить белок от денатурации.
6. Используйте искатель концентраций NT для определения диапазона концентраций, необходимых для титрования.
7. Доведите Di-C8 PA до соответствующей максимальной концентрации в воде.
8. Титруйте анализируемый материал, используя последовательное разбавление 1:1 в буфере PBS для 16 концентраций на основе предыдущей стадии. В отличие от SPR, термофорез не так чувствителен к буферным различиям.

4. MST образцов

1. Включите устройство и подключенный ноутбук.
2. Нажмите стрелку вверх на передней панели машины и выдвиньте капиллярную стойку.
3. Нагружайте капилляры в стойку с наибольшей концентрацией в положении 1.
4. В управляющем программном обеспечении выберите Красный канал, соответствующий NTA-Atto 647 N.
5. Введите информацию о концентрации, положении и названии каждого капилляра в Таблицу капилляров.
6. Запустите сканирование капилляров, нажав Start Cap Scan на 20% светодиода (предустановленный) и настройте в соответствии с 200-2000 флуоресцентными единицами, используя либо настройки интенсивности светодиодов, либо концентрацию лиганда (меченого белка).
7. Выберите диапазон мощности MST.
8. Запустите сканирование колпачка + измерение MST.
9. Анализ с помощью аналитического программного обеспечения.

5. Анализ данных MST

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для анализа, предоставляемое Nanotemper, является проприетарным и выполняется с использованием M.O. Affinity Analysis. Существуют различные способы измерения сродства связывания на основе флуоресценции или термофореза. Новые версии этого программного обеспечения предустановлены для автоматической оценки данных с помощью термофореза и предустановлены для использования термофореза с Tjump, использующим преимущества обоих измерений. В качестве альтернативы можно выбрать либо только Tjump, либо только термофорез. Кроме того, аналитическое программное обеспечение позволяет проводить оценочные измерения аффинности с использованием начальной флуоресценции. Доступ к этим настройкам можно получить только в экспертном режиме.

1. Установите стратегию оценки в аналитическом программном обеспечении expert, щелкнув поле молнии рядом с набором данных на экране Выбор данных. Программное обеспечение для анализа предустановлено для анализа в MST Analysis; однако исследователь может выбрать «Создать новый анализ» и выбрать «Начальный флуоресцентный анализ», чтобы оценить сродство связывания на основе начальной флуоресценции. Экспертный режим также доступен для начальной флуоресценции. В анализе, описанном ниже, термофорез и Tjump были использованы для определения KD представленного Vam7-His8 с его естественным субстратом, липидной фосфатидной кислотой.

Результаты

Это пример выходных данных с использованием аффинити-анализа. Меченый MST использовался для определения константы связывания Vam7-His8 с растворимым диоктаноилом (DiC8) PA одного из его природных ^{субстратов9}. На рисунке 1 представлены термофоретические следы одног...

Обсуждение

Определение привязки Vam7-His8 к DiC8-PA обеспечило надежный установленный KD для данного взаимодействия, который несколько ниже сродства, чем измеренный KD липосом Vam7-His8 к PA (неопубликованный). Это различие, скорее всего, связано с отсутствием мембраны, что обычно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cy5 Maleimide Mono-Reactive Dye	GE Healthcare	PA23031	For protein labeleing
Graphpad Prsim	Graphpad software
Monolith NT.115 Capillaries (1000 count)	Nanotemper	MO-K022	Capillaries for MST
Monolith NT.115 machine	Nanotemper		University equipment
NTA-Atto 647 N	Sigma	2175	label for His tags
Phosphatidylinositol 3-phosphate diC8 (PI(3)P diC8)	Echelon	P-3008	Lipid for binding experiments