الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Summary

هنا نقدم طريقه الفرز لبيروفوسفاتاسي الغشائية (من Thermotoga maritima) مثبطات استنادا إلى رد فعل الموليبدينوم الأزرق في شكل لوحه بشكل جيد 96.

Abstract

الاغشيه البركانية المرتبطة بالغشاء (mPPases) هي انزيمات ديميريكه تحدث في البكتيريا والنباتات والطفيليات. هذه البروتينات يلتصق بيروفوسفات في اثنين من جزيئات مقوم العظام, الذي يقترن مع البروتون و/أو أيون الصوديوم ضخ عبر الغشاء. منذ لا تحدث البروتينات المتماثلة في الكائنات والبشر ، mPPases هي المرشحين جيده في تصميم أهداف المخدرات المحتملة. هنا نقدم بروتوكول مفصل لفحص مثبطات mPPase باستخدام تفاعل الأزرق الموليبدينوم في 96 نظام لوحه جيدا. نحن نستخدم mPPase من بكتيريا thermophilic Thermotoga ماريتيما (tmppase) كانزيم نموذج. هذا البروتوكول بسيطه وغير مكلفه ، وتنتج نتيجة متسقة وقويه. يستغرق الأمر حوالي ساعة واحده فقط لإكمال بروتوكول فحص النشاط من بداية الفحص حتى قياس الامتصاص. وبما ان اللون الأزرق المنتج في هذا الفحص مستقر لفتره طويلة من الزمن ، يمكن اجراء المقايسة اللاحقة مباشره بعد الدفعة السابقة ، ويمكن قياس الامتصاص في وقت لاحق لجميع الدفعات دفعه واحده. العيب في هذا البروتوكول هو ان يتم ذلك يدويا ، التالي يمكن ان تكون مرهقه ، فضلا عن تتطلب مهارات جيده من التنضيد وحفظ الوقت. وعلاوة علي ذلك ، فان محلول ارسينيت سيترات المستخدم في هذا الفحص يحتوي علي ارسينيت الصوديوم ، وهو سام وينبغي التعامل معه بالاحتياطات اللازمة.

Introduction

ما يقرب من 25 ٪ من مجموع البروتينات الخلوية هي البروتينات غشاء وحوالي 60 ٪ منهم المخدرات الأهداف^1،2. واحده من الأهداف المخدرات المحتملة³, الغشاء المتجهة بيروفوسفواسات (mppases), هي الانزيمات الديميريكه التي ضخ البروتون و/أو أيون الصوديوم عبر الغشاء عن طريق التحلل من بيروفوسفات في اثنين من تقويم العظام⁴. ويمكن العثور علي mPPases في الكائنات الحية المختلفة⁵ مثل البكتيريا ، والنباتات ، والطفيليات التقدمية ، باستثناء البشر والحيوانية⁴. في الطفيليات التقدمية ، علي سبيل المثال منجلي البلازما ، الغدد التناسلية الطفيلية والمكورات الفطرية، mppases ضرورية لطفيل الطفيليات⁶ والضربة القاضية لهذا التعبير في الطفيليات تؤدي إلى الفشل في الحفاظ علي درجه الحموضة داخل الخلايا عند التعرض لph الأساسي الخارجي⁷. نظرا لأهميتها وعدم وجود البروتين المتماثل الموجودة في الفقاريات ، ويمكن اعتبار mPPases كاهداف المخدرات المحتملة للامراض protistal³.

ويستند الفحص في المختبر من مثبطات mPPase في هذا العمل علي نظام نموذج TmPPase. TmPPase هو ضخ أيون الصوديوم وأيون البوتاسيوم تعتمد mPPase من t. maritima ولها النشاط الأمثل في 71 درجه مئوية⁸. فوائد هذا الانزيم هي علي سبيل المثال سهوله في الإنتاج والتنقية ، والاستقرار الحراري الجيد والنشاط النوعي العالي. ويظهر tmppase كلا من التشابه العالي بالاضافه إلى الحفظ الكامل للموقف ، فضلا عن هويه جميع البقايا الحفازه للبروست mppases^3،9 والي هيكل محلوله من فيجنا رادياتا¹⁰ mppases. الهياكل المتاحة من TmPPase في التشكيلات المختلفة هي أيضا مفيده لتجربه تصميم المخدرات علي أساس الهيكل (كما الفحص الظاهري وتصميم دي نوفو).

هنا نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول مفصل لفحص مثبطات TmPPase في شكل لوحه بشكل جيد 96 (الشكل 1). ويستند البروتوكول علي الأسلوب اللوني للتفاعل الأزرق الموليبدينوم ، الذي وضعت لأول مره من قبل فيش و Subbarow¹¹. يتضمن هذا أسلوب التشكيل من [12-فوسموولبديك] حامض من [ثونوفوسفات] و موليبدات تحت شروط حامضيه, اي يكون بعد ذلك قللت ان يعطي مميزه [بلو-لون] فوسفوموليبدينوم نوع¹².

Protocol

1. اعداد البروتين

ملاحظه: تم وصف التعبير وتنقيه TmPPase في مكان آخر¹³.

1. اعداد 10 مل من حل أعاده التنشيط العازلة التي تحتوي علي 20 مم 2-(ن-مورتولينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) pH 6.5 ، 3.5 ٪ (v/v) الجلسرين ، 2 مم ديثيوثريتول (dtt) ، و 0.05 ٪ دوديسيل مالتوسيدي (DDM).
2. اعداد 10 مل من خليط التفاعل التي تحتوي علي 200 مم تريس-Cl الأس الهيدروجيني 8.0 ، 8.0 mM MgCl₂، 333 Mm kcl ، و 67 Mm nacl.
   ملاحظه: Mg^{2 +} مطلوب لمخلب بيروفوسفات كما الركيزة من Mppase ،^{K +} مطلوب لزيادة نشاط الانزيم كما Tmppase هو mppase تعتمد البوتاسيوم ، وهناك حاجه إلى^{Na +} لنشاط الانزيم خلال نقل أيون الصوديوم من قبل tmppase.
3. اعداد 30 ملغ/مل الدهنية لأعاده تنشيط الانزيم.
   1. أضافه 10 مل من 20 مم تريس-HCl pH 8.0 مع 1 مم DTT إلى 0.3 غرام من L-α-فوسفاتيديلتشوليني من فول الصويا إلى 10 مل من 20 مم تريس-HCl pH 8.0 مع 1 مم DTT.
   2. وضع الشحمية علي الجليد ، والنسخ مع 1 الفاصل الزمني نبض ثانيه لمده 1 دقيقه ، وقفه لمده 1 دقيقه ، وكرر حتى يصبح الحل الأصفر الشفاف.
   3. Aliquot الدهنية ، وتجميد في النيتروجين السائل وتخزين في-80 درجه مئوية حتى تستخدم.
4. أعاده تنشيط الانزيم.
   1. مزيج 40 μL من محلول الشحمية مع 22.5 μL من 20 ٪ DDM.
   2. سخني الخليط عند 55 درجه مئوية لمده 15 دقيقه واتركيه يبرد إلى درجه حرارة الغرفة.
   3. أضافه 36.5 μL من حل المخزن المؤقت أعاده التنشيط ، مزيج ، وأضافه 1 μL من البروتين المركز (13 ملغ/مل) لجعل تركيز إجمالي من 0.13 ملغ/مل.
      ملاحظه: عاده ما يتم تجميد البروتين في 10 μL علي الارصفه بعد التنقية وأذابه علي الثلج قبل الاستخدام.
5. خذ 20 μL من الانزيم المعاد تنشيطه وأضف إلى 1,480 μL من خليط التفاعل ، ثم اخلط برفق.
   ملاحظه: يجب ان يتم أضافه الانزيم المعاد تنشيطه إلى خليط التفاعل قبل استخدامه مباشره.

2-التحضير المركب

1. حل المركبات في سولفوكيد ثنائي الميثيل (DMSO) لجعل حلول الأسهم من 25 − 100 ملم في 50 − 200 μL ، استنادا إلى توافر المركبات.
   ملاحظه: جميع المركبات المستخدمة هنا (الشكل 2ا) قد نشرت سابقا⁹. إذا كان الذوبان المركب منخفضا ، يمكن تعديل تركيز المخزون وفقا لذلك.
2. اعداد ثلاثه تركيزات مختلفه من كل مجمع في الماء.
   ملاحظه: ستكون التركيزات النهائية في خليط التفاعل 1 و 5 و 50 ميكرومولار أو 1 و 5 و 20 ميكرومولار للمركبات القابلة للذوبان والقابلة للذوبان لماما ، علي التوالي.
   1. تمييع حل الأسهم مع الماء إلى 1 مل في ميكروانبوبي لإعطاء 2 μM ، 10 μM و 100 μM للمركبات القابلة للذوبان ، أو بدلا من 2 μM ، 10 μM و 40 μM للمركبات القابلة للذوبان لماما.
   2. دوامه الحل المركب علي الفور بعد تخفيف الحل الأسهم لخلط السليم.
3. تحقق من وجود تجميع مركب باستخدام مقياس الكلية.
   ملاحظه: وقد درس هذا كما تريبليكاتيس في ثلاثه تركيزات (1 μm ، 5 μm و 20 μm) وتطبيعها إلى فارغه في لوحه 96 جيدا.
   1. الاستغناء عن 75 μL من خليط التفاعل في كل بئر باستخدام ماصه متعددة القناات.
   2. أضافه 75 μL من كل مركب (للفارغة ، استخدم 75 μL من الماء بدلا من ذلك) وتخلط بواسطة الأنابيب صعودا وهبوطا 5 ×.
   3. قياس كل بئر في 300 V باستخدام مقياس الكلية ميكروبلايت.

3. الكواشف لاعداد الفحص

1. اعداد الحل ارنيت سترات.
   1. تزن 5 غ من ارنيت الصوديوم و 5 غ من سترات ثلاثية الصوديوم ثنائي الهيدرات.
      تحذير: ارسينيت الصوديوم سامه ، التالي استخدام معدات الحماية المناسبة والتعامل مع الرعاية الخاصة. كاجراء احترازي ، لا تعالج قبل ان يتم قراءه جميع احتياطات السلامة اللازمة وفهمها. التعامل فقط في غطاء الدخان من أجل عدم استنشاق الغبار/أبخره من المجمع أو حلها (ق). إذا استنشقت ، انتقل إلى الهواء النقي والحصول علي الرعاية الطبية. ارتداء نظارات السلامة الكيميائية المناسبة ، وقفازات واقيه والملابس لتجنب ابتلاع والعين/الجلد الاتصال. إذا ابتلع ، اتصل فورا مركز السموم أو الطبيب/الطبيب. إذا كان يحصل علي الجلد أو في العين (ق) ، يغسل مع الكثير من الماء والحصول علي الرعاية الطبية.
   2. تذوب في 100 مل من الماء.
   3. أضافه 5 مل من حمض الخليك الجليدية ، ومزيج ، وأضافه الماء إلى 250 مل.
   4. يحفظ في درجه حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
      ملاحظه: الحل مستقر لأكثر من سنه.
2. اعداد الحل الف والحل باء.
   1. للحل A ، أضافه 10 مل من الثلج البارد 0.5 M HCl إلى 0.3 غرام من حمض الاسكوربيك. حل حمض الاسكوربيك عن طريق vortexing.
   2. للحل ب ، أضف 1 مل من الماء البارد المثلج إلى 70 ملغ من الأمونيوم الرباعي الهيدرات والدوامة لأذابه.
      ملاحظه: تخزين كلا الحلين علي الجليد حتى الاستخدام. لاتساق نتيجة الفحص ، يمكن تخزين كلا الحلين علي الجليد لمده أقصاها أسبوع واحد.
3. اعداد الفوسفات (P_i) القياسية مع تركيز 0 μm ، 62.5 μm ، 250 μm و 500 μm للمعايرة.
   1. أضافه 0 μl ، 25 μl ، 50 μl ، و 100 μl من 5 مم Na₂hpo₄ هيدرات إلى أربعه ميكروانابيب تحتوي علي 370 μl من خليط التفاعل.
   2. اعلي إلى 1 مل مع الماء.

4. فحص النشاط للوحه جيدا 1 96

ملاحظه: انظر الشكل 1 لسير العمل التخطيطي لمقايسة.

1. أضافه 1 مل من الحل B إلى 10 مل من الحل A ، مزيج من vortexing وتخزين الحل علي الجليد.
   ملاحظه: يجب ان يكون هذا الحل شفافة والأصفر. الحفاظ علي الحل الف + ب علي الجليد لمده 30 دقيقه علي الأقل قبل الاستخدام. ومع ذلك ، استخدم الحل في غضون 3 ساعات لأنها سوف تذهب سيئه بعد التخزين علي المدى الطويل.
2. أضافه 40 μL من 0 μM ، 62.5 μM ، 250 μM و 500 μM P_i القياسية إلى شرائط أنبوب في ثلاث نسخ باستخدام ماصه متعددة القناات.
   ملاحظه: سيتم استخدام خليط التفاعل مع_{لا P} المضافة كفارغه.
3. أضف 25 μL من المحلول المركب إلى شرائط الأنبوب باستخدام ماصه متعددة القناات.
   ملاحظه: كل مركب لديه ثلاثه تركيزات مختلفه في ثلاثي النسخ الذي يكفي للتقدير الاولي للتركيز المثبطة القصوى نصف (IC₅₀). لتحديد₅₀ IC أكثر دقه ، يمكن استخدام ثمانيه تركيزات مركبه مختلفه. يستعاض عن الانزيم غير المثبط بالمحلول المركب بكميه متساوية من الماء. واستخدمت الضوابط الايجابيه 2.5 μM ، 25 μM ، و 250 μM من الصوديوم ايميدديفوسفات (المشردين داخليا) الملح.
4. أضافه 15 μL من مزيج محلول mPPase إلى شرائط أنبوب (باستثناء الأنابيب التي تحتوي علي P_i القياسية) باستخدام ماصه متعددة القناات.
5. ختم شرائط أنبوب مع ورقه ختم لاصقه. قطع ورقه الختم لفصل كل شريط أنبوب.
6. قبل احتضان عينات لمده 5 دقائق في 71 درجه مئوية. وضع العينات علي كتله التدفئة مع الفاصل الزمني 20 s بين كل قطاع من أجل تقليل استهلاك الوقت خلال الخطوات اللاحقة.
7. لكل قطاع ، وفتح الختم لاصقه. أضافه 10 μl من 2 ملليمتر بيروفوسفات الصوديوم ثنائي فوسفات باستخدام ماصه متعددة القناات وتخلط بالأنابيب صعودا وهبوطا ل 5 ×. ختم شريط أنبوب مره أخرى باستخدام نفس الختم.
   ملاحظه: قد تكون هذه الخطوة في البداية من الصعب إنجاز في 20 ثانيه; ومع ذلك ، فانه سيصبح أسهل بعد بعض المقايسات.
8. احتضان في 71 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
9. وضع العينات علي جهاز التبريد مع الفاصل الزمني 20 s بين كل قطاع. السماح لهم بارد لمده 10 دقيقه ولكن الطرد المركزي كل قطاع لفتره وجيزة بعد 5 دقائق من التبريد ، لقطرات الماء صب تحت ورقه الختم ، ثم وضعها مره أخرى إلى جهاز التبريد وأزاله الختم.
   ملاحظه: يمكن ببساطه ان يتم جهاز التبريد عن طريق وضع لوحه PCR جيدا 96 علي طبق بيتري بتري (حجم 150 مم × 15 ملم) مليئه بالماء والمجمدة لمده 1 ساعة علي الأقل. يجب إخراج الجهاز من الفريزر حوالي 5 دقائق قبل بداية الفحص. لا تاخذ خارج جهاز التبريد الحق قبل التبريد عينه لأنها سوف تجمد خليط التفاعل وتعيق تطوير اللون.
10. بعد 10 دقيقه من التبريد ، أضافه 60 μL من الحل ا + ب ، ومزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا ل 5 × والحفاظ علي شرائط أنبوب علي جهاز التبريد لمده 10 دقيقه.
11. أضافه 90 μL من المحلول ارسينيت سيترات والحفاظ علي درجه حرارة الغرفة لمده لا تقل عن 30 دقيقه لإنتاج اللون الأزرق مستقره.
    تحذير: نظرا لسميه يجب التعامل مع جميع الحلول التي تحتوي علي ارنيت الصوديوم مع رعاية اضافيه في كل وقت. التالي ، ينبغي ان يتم أضافه محلول ارسينيت سترات في غطاء الدخان.
12. الاستغناء عن 180 μL من كل خليط التفاعل في واضحة 96 البوليسترين ميكروبلايت.
13. قياس الامتصاص من كل بئر في 860 nm باستخدام مقياس طيفي ميكروبلايت.

5-تحليل النتائج

1. متوسط الثلاثيات من كل عينه ومعايير P_i . ثم طرح مع فارغه للقضاء علي اشاره الخلفية.
2. جعل منحني المعايرة عن طريق رسم الامتصاص (A₈₆₀) القيم مقابل مقدار P_i القياسية (nmol) واجراء انحدار خطي للحصول علي داله خط الاتجاه باستخدام الصيغة التالية:
   
3. احسب كميه الفوسفات (nmol) التي تم إطلاقها من التفاعل الانزيمي استنادا إلى صيغه الانحدار الخطي أعلاه.
4. حساب النشاط المحدد باستخدام الصيغة التالية:
   
   حيث nP_انا هو كميه من الفوسفات المفرج عنه من رد الفعل (nmol) ، t هو وقت رد الفعل (دقيقه) ، و m_tmppase هو كميه من tmppase النقي المستخدمة في الفحص (مغ).
5. احسب نشاط النسبة المئوية لكل تركيز مثبط باستخدام الصيغة التالية:
   
   حيث sa_الأولsالنشاط محدده من عينه مع المثبط و sa_un هو النشاط المحدد للعينه غير ماهول.
6. حساب منطق₅₀ (تقدير) و IC₅₀ (تقدير) مع الانحدار غير الخطية تناسب من منحني الجرعة الاربعه المعلمة باستخدام الصيغة التالية:
   
   حيث X هو سجل التركيز (μM) ، Y هو النشاط (٪) ، اعلي وأسفل هي الهضاب في نفس الوحدة كما Y (100 ٪ و 0 ٪ ، علي التوالي) ، المنطق₅₀ لديه نفس وحدات السجل كما x ، و هيلميل = عامل الانحدار أو منحدر التل ، والذي هو unitless.
   ملاحظه: يتم استخدام البرنامج (جدول المواد) لتركيب. استخدام تركيز 0.01 μM (بدلا من 0.00 μM) للعينه دون مثبطات كما لم يتم تعريف لوغاريتم الصفر.

النتائج

وفي هذا البروتوكول ، تم اختبار ثماني مركبات (1 − 8) (الشكل 2 ا) مع المشردين داخليا ، وهو مثبط شائع للفوسفازات البركانية ، كعنصر تحكم إيجابي. تم اختبار كل مجمع في ثلاثه تركيزات مختلفه (1 μM ، 5 μM و 20 μM) في ثلاثي النسخ. ويصور سير العمل في الفحص في الشكل 1، بدءا من اعدا...

Discussion

هنا نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل لفحص بسيط من مثبطات لبيروفوسفاتاسي الغشاء المرتبطة من t. maritima في شكل لوحه جيدا 96 استنادا إلى Vidilaseris وآخرون¹⁴. هذا البروتوكول غير مكلفه واستنادا إلى حمض 12 فوسفوميوليبديك ، الذي يتكون من الفوسفات والموليبدات في ظل الظروف الحمضية وخفضت إلى فو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG