Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Screening-Verfahren für membrangebundene Pyrophosphatase (aus Thermotoga maritima) Inhibitoren auf Basis der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattenformat vor.

Zusammenfassung

Membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases) sind dimere Enzyme, die in Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistischen Parasiten vorkommen. Diese Proteine spalten Pyrophosphat in zwei Orthophosphatmoleküle, die mit Proton und/oder Natriumionen gekoppelt sind, die über die Membran pumpen. Da bei Tieren und Menschen keine homologen Proteine vorkommen, sind mPPases gute Kandidaten bei der Gestaltung potenzieller Wirkstoffziele. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zum Abschirmen für mPPase-Inhibitoren unter Verwendung der Molybdän-Blaureaktion in einem 96-Well-Plattensystem vor. Wir verwenden mPPase aus dem thermophilen Bakterium Thermotoga maritima (TmPPase) als Modellenzym. Dieses Protokoll ist einfach und kostengünstig und führt zu einem konsistenten und robusten Ergebnis. Es dauert nur etwa eine Stunde, um das Aktivitätstestprotokoll vom Beginn des Assays bis zur Absorptionsmessung abzuschließen. Da die in diesem Test erzeugte blaue Farbe über einen längeren Zeitraum stabil ist, können nachfolgende Assays unmittelbar nach der vorherigen Charge durchgeführt werden, und die Absorption kann später für alle Chargen auf einmal gemessen werden. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass es manuell durchgeführt wird und somit anstrengend sein kann und gute Fähigkeiten der Pipetten und Zeiterfassung erfordern. Darüber hinaus enthält die in diesem Test verwendete Arsenit-Citrat-Lösung Natriumarsenit, das giftig ist und mit den notwendigen Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden sollte.

Einleitung

Ungefähr 25% der gesamten zellulären Proteine sind Membranproteine und etwa 60% von ihnen sind Arzneimittelziele^1,2. Eines der potentiellen Wirkstoffziele³, membrangebundene Pyrophosphatasen (mPPases), sind dimerische Enzyme, die Proton und/oder Natriumion durch Hydrolyse von Pyrophosphat in zwei Orthophosphate^{pumpen 4}. mPPases können in verschiedenen Organismen gefunden werden⁵ wie Bakterien, Archaeen, Pflanzen und protistische Parasiten, mit Ausnahme von Menschen und Tieren⁴. Bei protistischen Parasiten, z.B. Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii und Trypanosoma brucei, sind mPPases wesentlich für die Parasitenvirulenz⁶ und Knockout dieser Expression in den Parasiten führen zu einem Versagen bei der Aufrechterhaltung des intrazellulären pH bei Exposition gegenüber dem externen Grund-pH^7. Aufgrund ihrer Bedeutung und des Mangels an homologem Protein, das bei Wirbeltieren vorhanden ist, können mPPases als potenzielle Wirkstoffziele für protistale Erkrankungen betrachtet werden³.

Das In-vitro-Screening von mPPase-Inhibitoren in dieser Arbeit basiert auf einem TmPPase-Modellsystem. TmPPase ist ein Natriumionenpumpen und kaliumionenabhängige mPPase von T. maritima und hat seine optimale Aktivität bei 71 °C⁸. Vorteile dieses Enzyms sind zum Beispiel seine einfache Produktion und Reinigung, gute thermische Stabilität und hohe spezifische Aktivität. TmPPase weist sowohl eine hohe Ähnlichkeit neben der vollständigen Erhaltung der Position als auch die Identität aller katalytischen Rückstände zu den protistischen mPPases^3,9 und der gelösten Struktur von Vigna radiata¹⁰ mPPase auf. Die verfügbaren Strukturen von TmPPase in verschiedenen Konformationen sind auch für strukturbasierte Drogendesign-Experimente (als virtuelles Screening und de novo Design) nützlich.

Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zum Screening von TmPPase-Inhibitoren in einem 96-Well-Plattenformat (Abbildung 1). Das Protokoll basiert auf der kolorimetrischen Methode der Molybdänblaureaktion, die zuerst von Fiske und Subbarow¹¹entwickelt wurde. Bei dieser Methode wird 12-phosphomolybdische Säure aus Orthophosphat und Molybdat unter sauren Bedingungen entsteht, die dann reduziert wird, um charakteristische blau gefärbte Phosphomolybdänarten¹²zu geben.

Protokoll

1. Proteinzubereitung

HINWEIS: Der Ausdruck und die Reinigung von TmPPase wurde an anderer Stelle beschrieben¹³.

1. Bereiten Sie 10 ml der Reaktivierungspufferlösung vor,die 20 mM 2-(N-Morpholino)Ethansulfonsäure (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) Glycerin, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,05% Dodecylmaltosid (DDM) enthält.
2. Bereiten Sie 10 ml des Reaktionsgemisches mit 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl₂, 333 mM KCl und 67 mM M NaCl vor.
   HINWEIS: Mg²⁺ ist erforderlich, um das Pyrophosphat als Substrat von mPPase zu chelatieren, K⁺ ist erforderlich, um die Enzymaktivität zu erhöhen, da TmPPase eine kaliumabhängige mPPase ist und Na⁺ für die Enzymaktivität während der Natriumionentranslokation durch TmPPase benötigt wird.
3. Bereiten Sie 30 mg/ml Liposomen für die Enzymreaktivierung vor.
   1. 10 ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0 mit 1 mM DTT zu 0,3 g L-A-Phosphatidylcholin von Sojabohnen bis 10 ml 20 mM Tris-HCl pH 8.0 mit 1 mM DTT hinzufügen.
   2. Setzen Sie das Liposom auf Eis, und beschallen Sie mit 1 Sekunde Pulsintervall für 1 Minute, halten Sie für 1 Minute, und wiederholen Sie, bis die Lösung transparent gelb wird.
   3. Aliquot die Liposomen, gefrieren in flüssigem Stickstoff und lagern bei -80 °C, bis verwendet.
4. Reaktivieren Sie das Enzym.
   1. Mischen Sie 40 l der Liposomenlösung mit 22,5 l dDM.
   2. Das Gemisch 15 min bei 55 °C erhitzen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
   3. Fügen Sie 36,5 l der Reaktivierungspufferlösung hinzu, mischen Sie und fügen Sie 1 l konzentriertes Protein (13 mg/ml) hinzu, um eine Gesamtkonzentration von 0,13 mg/ml zu erzielen.
      HINWEIS: Protein wird in der Regel nach der Reinigung in 10 L Aliquots eingefroren und vor der Anwendung auf Eis aufgetaut.
5. Nehmen Sie 20 l des reaktivierten Enzyms und fügen Sie 1.480 l des Reaktionsgemisches hinzu, dann mischen Sie es vorsichtig.
   HINWEIS: Die Zugabe des reaktivierten Enzyms zum Reaktionsgemisch sollte kurz vor der Verwendung erfolgen.

2. Compound-Vorbereitung

1. Lösen Sie die Verbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO), um Lagerlösungen von 25 bis 100 mM in 50 bis 200 l zu bilden, basierend auf der Verfügbarkeit der Verbindungen.
   HINWEIS: Alle hier verwendeten Verbindungen (Abbildung 2A) wurden^bereits9 veröffentlicht. Ist die Verbundlöslichkeit niedrig, kann die Lagerkonzentration entsprechend angepasst werden.
2. Bereiten Sie drei verschiedene Konzentrationen jeder Verbindung in Wasser vor.
   HINWEIS: Die Endkonzentrationen im Reaktionsgemisch sind 1, 5 und 50 Mikromolar oder 1, 5 und 20 Mikromolar für lösliche bzw. sparsam lösliche Verbindungen.
   1. Verdünnen Sie die Stammlösung mit Wasser auf 1 ml in Mikroröhrchen, um für lösliche Verbindungen 2 M, 10 M und 100 M oder alternativ 2 m, 10 m und 40 m für sparsam lösliche Verbindungen zu erhalten.
   2. Wirbel die zusammengesetzte Lösung sofort nach Verdünnung der Stammlösung für die richtige Mischung.
3. Prüfen Sie die zusammengesetzte Aggregation mit einem Nephelometer.
   HINWEIS: Dies wurde als Triplicate in drei Konzentrationen (1 M, 5 m und 20 m) untersucht und in einer 96-Well-Platte auf den Rohling normalisiert.
   1. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 75 l des Reaktionsgemisches in jeden Brunnen.
   2. Fügen Sie 75 l jeder Verbindung hinzu (für den Rohling, verwenden Sie stattdessen 75 l Wasser) und mischen Sie sie, indem Sie 5 € nach oben und unten pfeifen.
   3. Messen Sie jeden Brunnen bei 300 V mit einem Mikroplatten-Nephelometer.

3. Reagenzien für die Assay-Zubereitung

1. Bereiten Sie die Arsenit-Citrat-Lösung vor.
   1. Wiegen Sie 5 g Natriumarsenit und 5 g Trinatriumcitratdihydrat.
      VORSICHT: Natriumarsenit ist giftig, daher verwenden Sie die richtige Schutzausrüstung und behandeln mit besonderer Sorgfalt. Behandeln Sie vorsorglich nicht, bevor alle notwendigen Sicherheitsvorkehrungen gelesen und verstanden wurden. Behandeln Sie nur in einer Dunstabzugshaube, um Staub/Dämpfe der Verbindung oder ihrer Lösung(n) nicht einzuatmen. Wenn eingeatmet, an die frische Luft bewegen und ärztliche Hilfe erhalten. Tragen Sie eine geeignete Schutzbrille, Schutzhandschuhe und Kleidung, um Einnahme und Augen-/Hautkontakt zu vermeiden. Wenn Sie geschluckt werden, rufen Sie sofort ein Giftzentrum oder Arzt/Arzt an. Wenn es auf die Haut oder in die Augen gelangt, mit viel Wasser waschen und ärztliche Hilfe erhalten.
   2. In 100 ml Wasser auflösen.
   3. 5 ml Eisessigsäure hinzufügen, mischen und 250 ml Wasser hinzufügen.
   4. Bei Raumtemperatur lichtgeschützt aufbewahren.
      HINWEIS: Die Lösung ist seit mehr als einem Jahr stabil.
2. Bereiten Sie Lösung A und Lösung B vor.
   1. Für Lösung A 10 ml eiskalte 0,5 M HCl auf 0,3 g Ascorbinsäure geben. Lösen Sie die Ascorbinsäure durch Wirbeln auf.
   2. Für Lösung B 1 ml eiskaltes Wasser zu 70 mg Ammoniumheptamolybdattetrahydrat und Wirbel hinzufügen, um sich aufzulösen.
      HINWEIS: Bewahren Sie beide Lösungen bis zur Verwendung auf Eis auf. Für die Konsistenz des Testergebnisses können beide Lösungen maximal eine Woche auf Eis gelagert werden.
3. Bereiten Sie den Phosphatstandard (P_i) mit einer Konzentration von 0 m, 62,5 m, 250 m und 500 m für die Kalibrierung vor.
   1. Fügen Sie vier Mikroröhrchen, die 370 l des Reaktionsgemisches enthalten, 0 L, 25 l, 50 l und 100 l mit 5 mM Na₂HPO₄ Dihydrat hinzugeben.
   2. Mit Wasser auf 1 ml aufladen.

4. Aktivitätstest für eine 96-Well-Platte

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für den schematischen Workflow des Assays.

1. 1 ml Lösung B auf 10 ml Lösung A geben, durch Wirbeln mischen und auf Eis lagern.
   HINWEIS: Diese Lösung sollte transparent und gelb sein. Lösung A + B vor der Anwendung mindestens 30 min auf Eis halten. Verwenden Sie die Lösung jedoch innerhalb von 3 h, da sie nach der Langzeitlagerung schlecht wird.
2. Fügen Sie die Röhrenstreifen in Dreifachausführung mit einer Mehrkanalpipette in Dreifachausführung zu den Rohrstreifen hinzu.
   HINWEIS: Die Reaktionsmischung ohne P_{i hinzugefügt} wird als Leerzeichen verwendet werden.
3. Fügen Sie den Rohrstreifen mit einer Mehrkanalpipette eine Verbundlösung mit 25 l. L hinzu.
   HINWEIS: Jede Verbindung hat drei verschiedene Konzentrationen in Triplicate, was für die anfängliche Schätzung der halbmaximalen hemmenden Konzentration (IC₅₀) ausreicht. Für eine genauere IC_{50-Bestimmung} können acht verschiedene Zusammengesetzte Konzentrationen verwendet werden. Für das hemmungslose Enzym wird die zusammengesetzte Lösung durch gleiche Menge Wasser ersetzt. Als Positivkontrollen wurden 2,5 M, 25 M und 250 M Natriumsalz (IDP) imidodiphosphat (IDP) verwendet.
4. Mit einer Mehrkanal-Pipette 15 l mPPase-Lösungsmischung in die Rohrstreifen (außer zu den Rohren, die P_i-Standard enthalten) hinzufügen.
5. Versiegeln Sie die Rohrstreifen mit einer Klebedichtungsfolie. Schneiden Sie die Dichtplatte, um jeden Rohrstreifen zu trennen.
6. Die Proben bei 71 °C vorinkubieren. Legen Sie die Proben auf den Heizblock mit 20 s Intervall zwischen den einzelnen Streifen, um den Zeitverbrauch während der nachfolgenden Schritte zu minimieren.
7. Öffnen Sie für jeden Streifen die Klebedichtung. Fügen Sie 10 l von 2 mM Natriumpyrophosphat dibasic mit einer Mehrkanalpipette hinzu und mischen Sie sie, indem Sie für 5 " nach oben und unten pfeifen. Versiegeln Sie den Rohrstreifen erneut mit der gleichen Dichtung.
   HINWEIS: Dieser Schritt könnte zunächst schwierig sein, in 20 s zu erreichen; jedoch wird es nach einigen Tests einfacher werden.
8. Bei 71 °C für 5 min inkubieren.
9. Legen Sie die Proben auf das Kühlgerät mit 20 s Intervall zwischen den einzelnen Streifen. Lassen Sie sie 10 min abkühlen, zentrieren Sie aber jeden Streifen kurz nach 5 min Abkühlung, um Wassertropfen unter der Dichtplatte zu dekantieren, dann wieder an das Kühlgerät zu legen und die Abdichtung zu entfernen.
   HINWEIS: Das Kühlgerät kann einfach hergestellt werden, indem man eine 96-Well-PCR-Platte auf eine mit Wasser gefüllte und mindestens 1 h gefrorene Polystyrol-Petrischale (Größe 150 mm x 15 mm) auflegt. Das Gerät sollte ca. 5 min vor Beginn des Testes aus dem Gefrierschrank herausgenommen werden. Nehmen Sie das Kühlgerät nicht direkt vor der Probenkühlung heraus, da es das Reaktionsgemisch einfrieren und die Farbentwicklung behindern wird.
10. Nach 10 min Abkühlung 60 l Lösung A + B hinzufügen, durch Pipettieren für 5" mischen und die Rohrleisten 10 min am Kühlgerät aufbewahren.
11. Fügen Sie 90 l der Arsenit-Citrat-Lösung hinzu und halten Sie sie mindestens 30 min bei Raumtemperatur, um eine stabile blaue Farbe zu erzeugen.
    VORSICHT: Aufgrund seiner Toxizität sollten alle Lösungen, die Natriumarsenit enthalten, jederzeit mit besonderer Sorgfalt behandelt werden. Daher sollte die Zugabe von Arsenit-Citrat-Lösung in einer Dunstabzugshaube erfolgen.
12. Geben Sie 180 l jedes Reaktionsgemisches in eine klare 96-Well-Polystyrol-Mikroplatte.
13. Messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei 860 nm mit einem Mikroplattenspektrophotometer.

5. Ergebnisanalyse

1. Durchschnittlich die Triplicates jeder Probe und die P i-Standards. Subtrahieren Sie dann mit dem Rohling, um das Hintergrundsignal zu eliminieren.
2. Erstellen Sie eine Kalibrierungskurve, indem Sie die Absorptionswerte (A₈₆₀) mit der Menge des P_i-Standards (nmol) aufstellen und eine lineare Regression durchführen, um die Trendlinienfunktion mit der folgenden Formel zu erhalten:
   
3. Berechnen Sie die Phosphatmenge (nmol), die aus der enzymatischen Reaktion freigesetzt wird, basierend auf der oben genannten linearen Regressionsformel.
4. Berechnen Sie die spezifische Aktivität mit der folgenden Formel:
   
   wobei nP_i die Menge an Phosphat ist, die aus der Reaktion (nmol), t die Reaktionszeit (min) und m_TmPPase die Menge des reinen TmPPase ist, die im Assay (mg) verwendet wird.
5. Berechnen Sie die prozentuale Aktivität für jede Inhibitorkonzentration nach folgender Formel:
   
   wenn SA_idiespezifische Aktivität einer Probe mit Inhibitor und SA_un ist die spezifische Aktivität der ungehemmten Probe.
6. Berechnen Sie die logIC₅₀ (Schätzung) und IC₅₀ (Schätzung) mit einer nichtlinearen Regressionsanpassung aus der Vier-Parameter-Dosis-Wirkungs-Kurve mit der folgenden Formel:
   
   wobei X das Konzentrationsprotokoll (M), Y aktivität (%) ist: Oben und Unten sind Plateaus in der gleichen Einheit wie Y (100% bzw. 0%),e), logIC₅₀ hat die gleichen Log-Einheiten wie X und HillSlope = Neigungsfaktor oder Hügelneigung, die einheitslos ist.
   HINWEIS: Software (Materialtabelle) wird für das Fitting verwendet. Verwenden Sie für die Probe ohne Inhibitor die Konzentration von 0,01 m (anstelle von 0,00 m), da der Logarithmus von Null nicht definiert ist.

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurden acht Verbindungen (1-8) zusammen mit IDP, einem häufigen Inhibitor von Pyrophosphatasen, als positiv zu kontrollieren getestet (Abbildung 2A). Jede Verbindung wurde in drei verschiedenen Konzentrationen (1 M, 5 m und 20 m) in DreifacherDikate getestet. Der Ablauf des Screenings ist in Abbildung 1dargestellt, beginnend mit der Proben- und Reagenzvorbereitung bis zur Absorptionsmessung bei 860 nm.

Am Ende die...

Diskussion

Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zum einfachen Screening von Inhibitoren auf membrangebundene Pyrophosphatase aus T. maritima in einem 96-Well-Plattenformat auf Basis von Vidilaseris et al.¹⁴. Dieses Protokoll ist kostengünstig und basiert auf 12-Phosphomolybdadsäure, die aus Orthophosphat und Molybdat unter sauren Bedingungen gebildet und auf Phosphomolybdän-Arten mit einer deutlichen blauen Farbe¹²reduziert wird. Diese Methode wird gegenüb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG