Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Resumo

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Resumo

Pirofosfatases ligadas à membrana (mPPases) são enzimas diméricas que ocorrem em bactérias, arqueais, plantas e parasitas protistas. Estas proteínas acovardam o pirofosfato em duas moléculas de ortofosfato, que é acoplado com próton e / ou íon de sódio bombeamento através da membrana. Como não existem proteínas homólogas em animais e humanos, os mPPases são bons candidatos na concepção de potenciais alvos de drogas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a tela para inibidores de mPase utilizando a reação azul molibdênio em um sistema de placa de 96 poços. Usamos mPase da bactéria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como uma enzima modelo. Este protocolo é simples e barato, produzindo um resultado consistente e robusto. Leva apenas cerca de uma hora para concluir o protocolo de ensaio de atividade desde o início do ensaio até a medição de absorção. Uma vez que a cor azul produzida neste ensaio é estável por um longo período de tempo, ensaio (s) subseqüente pode ser realizado imediatamente após o lote anterior, e a absorção pode ser medida mais tarde para todos os lotes de uma só vez. A desvantagem deste protocolo é que ele é feito manualmente e, portanto, pode ser desgastante, bem como exigir boas habilidades de pipetting e tempo de manutenção. Além disso, a solução arsenite-citrate usada neste ensaio contém arsenita de sódio, que é tóxica e deve ser tratada com as precauções necessárias.

Introdução

Aproximadamente 25% do total de proteínas celulares são proteínas da membrana e cerca de 60% delas são alvos de drogas^1,2. Um dos alvos potenciais da droga³, pirofosfofases ligados à membrana (mPPases), são enzimas diméricas que bombeiam próton e/ou íon de sódio através da membrana por hidróforadede de pirofosfato em dois ortopofosfatos⁴. mPPases podem ser encontrados em vários organismos^5, como bactérias, archaea, plantas e parasitas protistas, com exceção de seres humanos e animais⁴. Em parasitas protistas, por exemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases são essenciais para a virulência parasita⁶ e nocaute desta expressão nos parasitas levam à incapacidade de manter pH intracelular após a exposição ao pH básico externo⁷. Devido à sua importância e falta de proteína homóloga presente nos vertebrados, os mPPases podem ser considerados como alvos potenciais de medicamentos para doenças protistais^3.

A triagem in vitro dos inibidores de mPase neste trabalho é baseada em um sistema modelo TmPPase. TmPPase é um bombeamento de íons de sódio e mPase dependente de íons de potássio de T. maritima e tem sua atividade ideal em 71 °C⁸. Os benefícios desta enzima são, por exemplo, a sua facilidade na produção e purificação, boa estabilidade térmica e alta atividade específica. TmPPase mostra alta semelhança, além da conservação completa da posição, bem como a identidade de todos os resíduos catalíticos para os mPPases protista^3,9 e para a estrutura resolvida de Vigna radiata¹⁰ mPPase. As estruturas disponíveis de TmPPase em diferentes conformações também são úteis para experimentos de design de drogas baseados em estrutura (como triagem virtual e design de novo).

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem de inibidores de TmPPase em um formato de placa de 96 poços (Figura 1). O protocolo é baseado no método colorimétrico da reação azul molibdênio, que foi desenvolvida pela primeira vez por Fiske e Subbarow¹¹. Este método envolve a formação de ácido 12-fosphomolídico de ortopofosfato e molibdênio condições ácidas, que é então reduzida para dar a espécie de fosphomolybdenum de cor azul característica¹².

Protocolo

1. Preparação de proteínas

NOTA: A expressão e purificação de TmPPase foi descrita em outros lugares¹³.

1. Prepare 10 mL da solução tampão de reativação contendo 20 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), e 0.05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Prepare 10 mL da mistura de reação contendo 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl_2,333 mM KCl, e 67 mM NaCl.
   NOTA: Mg²⁺ é necessário para chelate o pirofosfato como o substrato de mPase, K⁺ é necessário para aumentar a atividade enzimática como TmPPase é um mPase dependente de potássio, e Na⁺ é necessário para a atividade enzimática durante a translocação de íons de sódio por TmPPase.
3. Prepare 30 mg/mL lipossomos para reativação enzimática.
   1. Adicione 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT a 0.3 g de L-α-phosphatidylcholine de soja para 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT.
   2. Coloque o lipossoma no gelo, e sonicate com intervalo de pulso de 1 segundo por 1 minuto, faça uma pausa por 1 minuto, e repita até que a solução se torne amarelo transparente.
   3. Aliquot os lipossomos, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C até usado.
4. Reativar a enzima.
   1. Misture 40 μL da solução de lipossomos com 22,5 μL de 20% DDM.
   2. Aqueça a mistura em 55 °C por 15 min e deixe esfriar a temperatura ambiente.
   3. Adicione 36,5 μL da solução tampão de reativação, misture e adicione 1 μL de proteína concentrada (13 mg/mL) para fazer uma concentração total de 0,13 mg/mL.
      NOTA: A proteína é geralmente congelada em alíquotas de 10 μL após a purificação e descongelada no gelo antes do uso.
5. Tome 20 μL da enzima reativada e adicione a 1.480 μL da mistura de reação, em seguida, misture suavemente.
   NOTA: A adição da enzima reativada à mistura de reação deve ser realizada pouco antes de ser usada.

2. Preparação composta

1. Dissolva os compostos em dimetil sulfoxida (DMSO) para fazer soluções de estoque de 25 a 100 mM em 50-200 μL, com base na disponibilidade dos compostos.
   NOTA: Todos os compostos usados aqui(Figura 2A)foram publicados anteriormente⁹. Se a solubilidade composta for baixa, a concentração de estoque pode ser ajustada em conformidade.
2. Prepare três concentrações diferentes de cada composto na água.
   NOTA: As concentrações finais na mistura de reação serão 1, 5 e 50 micromolar ou 1, 5 e 20 micromolar para compostos solúveis e com moderação solúveis, respectivamente.
   1. Diluir a solução de estoque com água para 1 mL em microtubos para dar 2 μM, 10 μM e 100 μM para compostos solúveis, ou alternativamente 2 μM, 10 μM e 40 μM para compostos parparingly solúveis.
   2. Vortex a solução composta instantaneamente após a diluição da solução de estoque para a mistura adequada.
3. Verifique se há agregação composta usando um nefrômetro.
   NOTA: Este foi estudado como triplicados em três concentrações (1 μM, 5 μM e 20 μM) e normalizado ao espaço em branco em uma placa de 96 poços.
   1. Dispense 75 μL da mistura da reação em cada poço usando uma pipeta multichannel.
   2. Adicione 75 μL de cada composto (para o espaço em branco, use 75 μL de água em vez disso) e misture por pipetting cima e para baixo 5 ×.
   3. Medir cada poço em 300 V usando um nephelometer microplate.

3. Reagentes para a preparação do ensaio

1. Prepare a solução arsenite-citrate.
   1. Pese 5 g de arsenita de sódio e 5 g de dihydrate de citrato trissódico.
      CUIDADO: O arsenite do sódio é tóxico, assim use o equipamento protetor apropriado e segure com cuidado especial. Como precaução, não segure antes que todas as precauções de segurança necessárias tenham sido lidas e compreendidas. Segure apenas em um capô de fumaça, a fim de não inalar poeira / vapores do composto ou sua solução (s). Se inalado, mova-se para o ar fresco e obtenha atendimento médico. Use óculos de segurança químicos adequados, luvas de proteção e roupas para evitar a ingestão e contato olho/pele. Se engolido, ligue imediatamente para um centro de intoxicação ou médico/médico. Se ele fica na pele ou no olho (s), lave com muita água e obter atenção médica.
   2. Dissolva-se em 100 mL de água.
   3. Adicione 5 mL de ácido acético glacial, misture e adicione água a 250 mL.
   4. Armazenar à temperatura ambiente protegido da luz.
      NOTA: A solução é estável por mais de um ano.
2. Prepare a solução A e a solução B.
   1. Para solução A, adicione 10 mL de gelo frio 0,5 M HCl para 0,3 g de ácido ascórbico. Dissolva o ácido ascórbico por vórtice.
   2. Para solução B, adicione 1 mL de água gelada a 70 mg de tetrahidrato e vórtice de amônio heptamolybdate para dissolver.
      NOTA: Armazenar ambas as soluções no gelo até o uso. Para a consistência do resultado do ensaio, ambas as soluções podem ser armazenadas no gelo por um máximo de uma semana.
3. Prepare o padrão de fosfato (P_i)com a concentração de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM para calibração.
   1. Adicione 0 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL de 5 mM Na₂HPO₄ desidratar a quatro microtubos contendo 370 μL da mistura de reação.
   2. Cubra até 1 mL com água.

4. Ensaio de atividade para uma placa de 96 poços

NOTA: Veja a Figura 1 para o fluxo de trabalho esquemático do ensaio.

1. Adicione 1 mL de solução B a 10 mL de solução A, misture vórtice e guarde a solução no gelo.
   NOTA: Esta solução deve ser transparente e amarela. Mantenha a solução A + B no gelo por pelo menos 30 minutos antes do uso. No entanto, use a solução dentro de 3 h, pois vai mal depois de armazenamento a longo prazo.
2. Adicione 40 μL de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM P_i padrão para as tiras de tubo em triplicado usando uma pipeta multicanal.
   NOTA: A mistura de reação sem P_i adicionado será usado como um espaço em branco.
3. Adicione 25 μL de solução composta para as tiras de tubo usando uma pipeta multicanal.
   NOTA: Cada composto tem três concentrações diferentes em triplicado, o que é suficiente para a estimativa inicial da concentração inibil máxima (IC_50). Para uma determinação ic₅₀ mais precisa, oito concentrações compostas diferentes podem ser usadas. Para a enzima desinibida, a solução composta é substituída por quantidade igual de água. Como controles positivos foram utilizados 2,5 μM, 25 μM e 250 μM de imidodifosfato (IDP).
4. Adicione 15 μL de mistura de solução mPPase para as tiras de tubo (exceto para os tubos contendo P_i padrão) usando uma pipeta multicanal.
5. Selar as tiras do tubo com uma folha de vedação adesiva. Corte a folha de vedação para separar cada tira de tubo.
6. Pré-incubar as amostras para 5 min a 71 °C. Coloque as amostras no bloco de aquecimento com intervalo de 20 s entre cada tira, a fim de minimizar o consumo de tempo durante as etapas subsequentes.
7. Para cada tira, abra a vedação adesiva. Adicione 10 μL de 2 mM pirofosfato de sódio dibasic usando uma pipeta multicanal e misture por pipetting cima e para baixo para 5 ×. Selar a tira de tubo novamente usando a mesma vedação.
   NOTA: Esta etapa pode inicialmente ser difícil de realizar em 20 s; no entanto, ele vai se tornar mais fácil depois de alguns ensaios.
8. Incubar a 71 °C por 5 min.
9. Coloque as amostras no aparelho de resfriamento com intervalo de 20 s entre cada tira. Deixe esfriar por 10 min, mas centrífuga cada tira brevemente após 5 min de resfriamento, para decantar gotas de água a folha de vedação, em seguida, colocá-lo de volta para o aparelho de resfriamento e remover o vedação.
   NOTA: O aparelho de refrigeração pode simplesmente ser feito colocando uma placa PCR de 96 poços em uma placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm × 15 mm) cheia de água e congelada por pelo menos 1 h. O aparelho deve ser retirado do congelador cerca de 5 minutos antes do início do ensaio. Não tire o aparelho de resfriamento logo antes do resfriamento da amostra, pois congelará a mistura de reação e dificultará o desenvolvimento da cor.
10. Após 10 min de resfriamento, adicione 60 μL de solução A + B, misture por pipetting para cima e para baixo para 5 × e manter as tiras de tubo no aparelho de refrigeração por 10 min.
11. Adicione 90 μL da solução arsenite-citrato e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para produzir uma cor azul estável.
    CUIDADO: Devido à sua toxicidade todas as soluções que contenham arsenita de sódio devem ser tratadas com cuidado extra em todos os tempos. Assim, a adição de solução arsenite-citrato deve ser feita em um capô de fumaça.
12. Dispense 180 μL de cada mistura de reação em uma clara microplaca de poliestireno de 96 poços.
13. Medir a absorção de cada poço em 860 nm usando um espectrômetro microplaca.

5. Análise de resultados

1. Média dos triplicados de cada amostra e dos_{pp P i.} Em seguida, subtraia com o espaço em branco para eliminar o sinal de fundo.
2. Faça uma curva de calibração traçando a absorção (A₈₆₀₎valores contra a quantidade de P_i padrão (nmol) e realizar uma regressão linear para obter a função de linha de tendência usando a seguinte fórmula:
   
3. Calcule a quantidade de fosfato (nmol) liberada da reação enzimática com base na fórmula de regressão linear acima.
4. Calcule a atividade específica usando a seguinte fórmula:
   
   onde nP_i é a quantidade de fosfato liberado da reação (nmol), t é o tempo de reação (min), e m_TmPPase é a quantidade do TmPPase puro usado no ensaio (mg).
5. Calcule a atividade percentual para cada concentração inibidora usando a seguinte fórmula:
   
   onde SA_iisa atividade específica de uma amostra com inibidor e SA_un é a atividade específica da amostra desinibida.
6. Calcule o logIC₅₀ (estimativa) e IC₅₀ (estimativa) com um ajuste de regressão não linear da curva de dose-resposta de quatro parâmetros usando a seguinte fórmula:
   
   onde X é registro de concentração (μM), Y é atividade (%), Top e Bottom são planaltos na mesma unidade que Y (100% e 0%, respectivamente), logIC₅₀ tem as mesmas unidades de registro como X, e HillSlope = fator de inclinação ou encosta, que é unitless.
   NOTA: Software(Tabela de Materiais)é usado para a montagem. Use a concentração de 0,01 μM (em vez de 0,00 μM) para a amostra sem inibidor, pois o logarithm de zero não é definido.

Resultados

Neste protocolo, oito compostos (1-8) foram testados(Figura 2A)juntamente com o BID, inibidor comum de pirofosfatases, como controle positivo. Cada composto foi testado em três concentrações diferentes (1 μM, 5 μM e 20 μM) em triplicado. O fluxo de trabalho da triagem é representado na Figura 1,a partir da amostra e preparação do reagente até a medida de absorção em 860 nm.

Ao final deste protocolo, após a adição da sol...

Discussão

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem simples de inibidores para pirofosfatase ligada à membrana de T. maritima em um formato de placa de 96 poços baseado em Vidilaseris et al.¹⁴. Este protocolo é barato e baseado em ácido 12-fosphomolybdic, que é formado a partir de ortopofosfato e molibdênio em condições ácidas e reduzido a espécies de fosphomolybdenum com uma cor azul distinta¹². Este método é preferido em relação a outros protocolos, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG