써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

요약

여기에서 우리는 96 웰 플레이트 포맷에서 몰리브덴 청색 반응에 기초한 막 결합 된 열광파타제 (Thermotoga maritima에서)억제제에 대한 스크리닝 방법을 제시한다.

초록

막 결합 된 열광파타제 (mPPases)는 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충에서 발생하는 디메라 효소입니다. 이 단백질은 양성자 및 /또는 나트륨 이온이 막을 가로 질러 펌핑과 결합된 두 개의 정형 외과 인산염 분자로 파이로 포스페이트를 갈라. 동물과 인간에서 상동성 단백질이 발생하지 않았기 때문에 mPPases는 잠재적인 약물 표적의 설계에 좋은 후보입니다. 여기서 우리는 96 웰 플레이트 시스템에서 몰리브덴 청색 반응을 활용하는 mPPase 억제제에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 우리는 모델 효소로 열성 박테리아 써모토가 마리티마 (TmPPase)에서 mPPase를 사용합니다. 이 프로토콜은 간단하고 저렴하여 일관되고 강력한 결과를 생성합니다. 분석의 시작부터 흡광도 측정까지 활성 분석 프로토콜을 완료하는 데 약 1시간 밖에 걸리지 않습니다. 이 분석에서 생성된 청색은 오랜 기간 동안 안정되기 때문에, 후속 분석은 이전 배치 직후에 수행될 수 있으며, 흡광도는 나중에 모든 배치에 대해 한 번에 측정될 수 있다. 이 프로토콜의 단점은 수동으로 수행되므로 파이펫팅 및 시간 유지의 좋은 기술을 필요로 할뿐만 아니라 소진 될 수 있다는 것입니다. 또한,이 분석법에 사용되는 비소 - 구연산염 용액은 독성이 있으며 필요한 예방 조치로 처리되어야하는 나트륨 비소염을 포함합니다.

서문

총 세포 단백질의 약 25%는 막 단백질이고 그 중 약 60%는 약물 표적^{1,2입니다.} 잠재적인 약물 표적 중 하나인^3,막 결합 된 열광파타스 (mPPases)는 양성자 및 / 또는 나트륨 이온을 두 개의 정형 외과 인산염으로 열분해하여 막을 가로 질러 펌핑하는^{효소입니다 4.} mPPases는 인간과^동물을제외하고 박테리아, 고고학, 식물 및 프로티스트 기생충과 같은 다양한 유기체^5에서 발견될 수 있습니다 4. 프로티스트 기생충에서, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸, 톡소플라즈마 곤디, 트리파노소마 브루시,mPPases는 기생충 에서 이러한 발현의 결손증⁶ 및 녹아웃에 필수적이며 외부 기본^pH7에노출시 세포내 pH를 유지하는 데 실패로 이어진다. 척추동물에 존재하는 상동 단백질의 중요성과 부족으로 인해 mPPases는 프로티스탈 질환에 대한 잠재적 인 약물 표적으로 간주 될 수 있습니다^3.

이 작품에서 mPPase 억제제의 시험관 내 스크리닝은 TmPPase 모델 시스템을 기반으로 합니다. TmPPase는 T. 마리티마에서 나트륨 이온 펌핑 및 칼륨 이온 의존 mPPase이며 71 °C^8에서최적의 활성을 갖는다. 이 효소의 장점은 예를 들어 생산 및 정제의 용이성, 좋은 열 안정성 및 높은 특정 활성입니다. TmPPase는 프로티스트 mPPases^3,9 및 비냐 라디에타¹⁰ mPPase의 해결 된 구조에 대한 모든 촉매 잔류물의 완전한 보존뿐만 아니라 위치의 완전한 보존뿐만 아니라 높은 유사성을 나타낸다. 다른 적합성에서 TmPPase의 사용 가능한 구조는 구조 기반 약물 설계 실험 (가상 스크리닝 및 de novo 설계)에도 유용합니다.

여기서 우리는 96 웰 플레이트 포맷으로 TmPPase 억제제의 스크리닝을 위한 상세한 프로토콜을 보고한다(도1). 이 프로토콜은 먼저 Fiske 및 Subbarow^11에의해 개발된 몰리브덴 청색 반응의 대색 방법을 기반으로 합니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 정형 외과 스포산염및 몰리브데이트에서 12-인산성 산의 형성을 수반하며, 이는 특징적인 청색 인화질 종^12종을주기 위해 감소된다.

프로토콜

1. 단백질 준비

참고: TmPPase의 발현 및 정제는 다른^{곳에서 13에}기술되었습니다.

1. 20 mM-(N-morpholino)에탄에설포닉산(MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) 글리세롤, 2 mM 디티오트레이톨(DTT) 및 0.05% 도데실 말토사이드(DDM)를 함유하는 재활성화 완충액의 10 mL을 준비한다.
2. 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl_2,333 mM KCl 및 67 mM NaCl을 포함하는 반응 혼합물의 10 mL을 준비한다.
   참고: Mg^2+는 mPPase의 기질로서 파이로포스페이트에 chelate하는 데 필요하며,^K+는 TmPPase가 칼륨 의존성 mPPase로서 효소 활성을 증가시키는 데 필요하며,^Na+는 TmPPase에 의한 나트륨 이온 전좌 동안효소 활성에 필요하다.
3. 효소 재활성화를 위해 30 mg/mL 리포솜을 준비하십시오.
   1. 10 mL의 20 mM 트리스-HCl pH 8.0을 1 mMDTT와 1 mM DTT를 추가하여 1mMM DTT를 사용하여 20 mM Tris-HCl pH 8.0의 10 mL에 대두에서 L-α-phosphatidylcholine0.3 g에 1mMDTT를 추가합니다.
   2. 리포솜을 얼음 위에 올려 놓고 1초 동안 1초의 펄스 간격으로 초음파 처리한 다음 1분 동안 일시 중지한 다음 용액이 투명하게 노랗게 될 때까지 반복합니다.
   3. 리포좀을 알리쿼트하고 액체 질소로 얼리고 사용 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
4. 효소를 다시 활성화합니다.
   1. 리포솜 용액 40 μL을 20% DDM의 22.5 μL과 혼합합니다.
   2. 혼합물을 55 °C에서 15 분 동안 가열하고 실온으로 식힙니다.
   3. 재활성화 완충액 36.5 μL을 넣고 혼합하고 농축 단백질 1 μL(13 mg/mL)을 추가하여 총 농도가 0.13 mg/mL입니다.
      참고: 단백질은 일반적으로 정제 후 10 μL aliquots로 동결되고 사용하기 전에 얼음에 해동됩니다.
5. 재활성화된 효소의 20 μL을 취하고 반응 혼합물의 1,480 μL에 추가한 다음 부드럽게 섞습니다.
   참고 : 반응 혼합물에 재 활성화 된 효소를 첨가하면 사용 직전에 수행해야합니다.

2. 화합물 준비

1. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 화합물을 용해하여 화합물의 가용성에 따라 50-200 μL에서 25-100 mM의 재고 용액을 만듭니다.
   참고: 여기에 사용된 모든화합물(그림 2A)은이전에^9. 화합물 용해도가 낮은 경우, 재고 농도는 그에 따라 조정될 수 있다.
2. 물에 각 화합물의 세 가지 다른 농도를 준비합니다.
   참고: 반응 혼합물의 최종 농도는 각각 1, 5 및 50 마이크로몰 또는 1, 5 및 20 마이크로몰로 수용성 및 아껴서 수용성 화합물에 대한 것입니다.
   1. 용해성 화합물에 대해 2 μM, 10 μM 및 100 μM을 제공하기 위해 마이크로튜브에서 물로 1 mL로 스톡 용액을 희석하거나, 아껴서 수용성 화합물에 대해 2 μM, 10 μM 및 40 μM을 제공합니다.
   2. 적절한 혼합을 위해 스톡 용액의 희석 후 즉시 화합물 용액을 소용돌이.
3. nephelometer를 사용하여 복합 집계를 확인합니다.
   참고: 이것은 3개의 농도(1 μM, 5 μM 및 20 μM)에서 삼중체로서 연구되었고, 96웰 플레이트에서 블랭크로 정규화하였다.
   1. 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰내로 반응 혼합물의 75 μL을 분배한다.
   2. 각 화합물의 75 μL을 추가하고 (빈 경우 75 μL의 물을 대신 사용하십시오) 위아래로 5 ×로 섞습니다.
   3. 마이크로 플레이트 nephelometer를 사용하여 300V에서 각 잘 측정합니다.

3. 분석 준비를위한 시약

1. 비소성 구연산염 용액을 준비합니다.
   1. 비소나트륨 5 g과 구연산 나트륨 디하이드레이트 5 g의 무게를 측정하십시오.
      주의: 비소 나트륨은 독성이 있으므로 적절한 보호 장비를 사용하고 특별한주의를 기울여 처리하십시오. 예방 조치로서 필요한 모든 안전 예방 조치를 읽고 이해하기 전에 는 처리하지 마십시오. 화합물 또는 용액의 먼지 /증기를 흡입하지 않도록 연기 후드에서만 취급하십시오. 흡입하면 신선한 공기로 이동하여 의사의 진료를 받으하십시오. 섭취와 눈/피부 접촉을 피하기 위해 적절한 화학 안전 고글, 보호 장갑 및 의류를 착용하십시오. 삼켰을 경우 즉시 독극물 센터 나 의사 / 의사에게 전화하십시오. 피부나 눈에 닿으면 충분한 물로 씻고 의사의 진료를 받으라.
   2. 100 mL의 물에 녹입니다.
   3. 5 mL의 빙하 아세트산을 넣고 섞은 다음 물을 250 mL에 추가합니다.
   4. 빛으로부터 보호된 실온에서 보관하십시오.
      참고 : 솔루션은 1 년 이상 안정적입니다.
2. 솔루션 A 및 솔루션 B를 준비합니다.
   1. 용액 A의 경우, 얼음 차가운 0.5 M HCl 10 mL을 아스코르브 산 0.3 g에 추가하십시오. 소용돌이에 의해 아스코르브 산을 용해.
   2. 용액 B의 경우, 녹을 수 있는 테트라하이드레이트와 소용돌이를 70 mg의 암모늄 헵타몰리브데이트에 얼음 차가운 물 1 mL을 추가합니다.
      참고: 두 가지 용액을 모두 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 분석 결과의 일관성을 위해 두 용액을 최대 1 주일 동안 얼음에 저장할 수 있습니다.
3. 캘리브레이션을 위해 0 μM, 62.5 μM, 250 μM 및 500 μM의 농도로 인산염(P_i)표준을 준비합니다.
   1. 반응 혼합물의 370 μL을 함유하는 4개의 마이크로튜브에 5 mM_{Na 2}HPO 4 의 0 μL, 25 μL, 및 100_μL을 첨가한다.
   2. 최대 1mL의 물로 물을 마시면 됩니다.

4. 96 웰 플레이트 1개에 대한 활동 분석

참고: 분석의 회로도 워크플로우에 대해서는 그림 1을 참조하십시오.

1. 용액 B 10 mL에 1 mL를 추가하고, 소용돌이에 섞어서 용액을 얼음에 저장하십시오.
   참고: 이 솔루션은 투명하고 노란색이어야 합니다. 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 얼음에 용액 A + B를 유지 합니다. 그러나 장기 보관 후 불량이 될 수 있으므로 3 시간 이내에 솔루션을 사용하십시오.
2. 멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립에 40 μM, 62.5 μM, 250 μM 및 500 μM P_i 표준을 추가합니다.
   참고 :_P가 첨가되지 않은 반응 혼합물은 공백으로 사용됩니다.
3. 멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립에 25 μL의 화합물 용액을 추가합니다.
   참고: 각 화합물은 반 최대 억제 농도 (IC_50)의초기 추정에 충분 한 삼중 항에 세 가지 다른 농도. 보다 정확한 IC₅₀ 측정을 위해 8가지 화합물 농도를 사용할 수 있습니다. 억제되지 않은 효소의 경우 화합물 용액은 동일한 양의 물로 대체됩니다. 양성 대조군으로서 2.5 μM, 25 μM, 및 250 μM의 이미다이드포스페이트(IDP) 나트륨 염을 사용하였다.
4. 멀티채널 파이펫을 사용하여 튜브 스트립(P_i 표준을 포함하는 튜브 제외)에 15 μL의 mPPase 용액 혼합물을 추가합니다.
5. 튜브 스트립을 접착제 밀봉 시트로 밀봉합니다. 각 튜브 스트립을 분리하기 위해 밀봉 시트를 잘라.
6. 71°C에서 5분 동안 샘플을 미리 배양하였다. 후속 단계 동안 소비 시간을 최소화하기 위해 각 스트립 사이에 20 s 간격으로 가열 블록에 샘플을 놓습니다.
7. 각 스트립에 대해 접착제 밀봉을 엽니다. 멀티채널 파이펫을 사용하여 2 mM 나트륨 파이로포스페이트 디베이직 10 μL을 추가하고 위아래로 5×로 파이펫팅하여 섞습니다. 동일한 밀봉을 사용하여 튜브 스트립을 다시 밀봉하십시오.
   참고: 이 단계는 처음에는 20초 안에 수행하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 그것은 몇 가지 asays 후 쉽게 될 것입니다.
8. 71°C에서 5분 동안 배양합니다.
9. 각 스트립 사이에 20s 간격으로 냉각 장치에 샘플을 놓습니다. 10 분 동안 식히지만 냉각 5 분 후에 각 스트립을 잠시 원심 분리하여 밀봉 시트 아래에 물을 떨어 뜨린 다음 냉각 장치에 다시 넣고 밀봉을 제거하십시오.
   참고 : 냉각 장치는 단순히 적어도 1 시간 동안 물로 채워진 폴리스티렌 페트리 접시 (크기 150mm × 15mm)에 96 웰 PCR 플레이트를 배치하여 만들 수 있습니다. 장치는 분석의 시작 전에 약 5 분 냉동고에서 꺼내야한다. 반응 혼합물을 동결시키고 색상 개발을 방해하기 때문에 시료 냉각 직전에 냉각 장치를 꺼내지 마십시오.
10. 10분 동안 냉각한 후 용액 A + B 60 μL을 추가하고, 5×로 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 튜브 스트립을 냉각 장치에 10분 동안 유지합니다.
11. 비소산 구연산액 90 μL을 첨가하고 실온에서 30분 이상 유지하여 안정적인 청색을 생성합니다.
    주의: 독성으로 인해 비소 나트륨을 함유 한 모든 솔루션은 항상 각별한주의를 기울여 처리해야합니다. 따라서, 비소성 구연산액의 첨가는 연기 후드에서 이루어져야한다.
12. 각 반응 혼합물의 180 μL을 투명한 96 웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에 분배한다.
13. 마이크로 플레이트 분광광도계를 사용하여 860 nm에서 각 우물의 흡광도를 측정합니다.

5. 결과 분석

1. 각 샘플및_Pi 표준의 평균 세 배입니다. 그런 다음 빈 으로 빼서 배경 신호를 제거합니다.
2. P_i 표준(nmol)의 양에 대해 흡광도(A₈₆₀₎값을 플로팅하여 보정 곡선을 만들고 선형 회귀를 수행하여 다음 공식을 사용하여 추세선 함수를 얻습니다.
   
3. 상기 선형 회귀 식에 기초하여 효소 반응으로부터 방출된 인산염 양(nmol)을 계산한다.
4. 다음 수식을 사용하여 특정 활동을 계산합니다.
   
   여기서 nP_i는 반응(nmol)으로부터 방출되는 인산염의 양이고, t는 반응 시간(min), 및 m_TmPPase는 분석(mg)에 사용되는 순수한 TmPPase의 양이다.
5. 다음 공식을 사용하여 각 억제제 농도에 대한 백분율 활성을 계산합니다.
   
   여기서 SA_i는억제제 및 SA_un을 가진 샘플의 특정 활성은 억제되지 않은 샘플의 특정 활성이다.
6. 다음 공식을 사용하여 4개의 파라미터 용량-응답 곡선에서 비선형 회귀 적합으로 logIC_50(추정) 및 IC 50(추정값)을 계산합니다.
   
   여기서 X는 농도로그(μM), Y는 활동(%) 이고, 상부와 하부는 Y(각각 100% 및 0%)와 동일한 단위의 고원이며, logIC_50은 X와 동일한 로그 단위를 가지며, HillSlope = 경사계수 또는 언덕 경사도는 단위가 없는 것입니다.
   참고 : 소프트웨어(재료 표)는피팅에 사용됩니다. 0의 로그렘이 정의되지 않았기 때문에 억제제없이 샘플에 대해 0.01 μM (대신 0.00 μM)의 농도를 사용하십시오.

결과

본 프로토콜에서, 8개의 화합물(1−8)을 양성 대조군으로서 열포염의 일반적인 억제제인 IDP와 함께 시험하였다(도2A). 각 화합물은 삼중항에서 3개의 상이한 농도(1 μM, 5 μM 및 20 μM)에서 시험하였다. 스크리닝의 워크플로우는 샘플 및 시약 준비부터 860 nm의 흡광도 측정까지 의 도 1에도시되어 있습니다.

이 프로토콜의 끝에서, 용액 A...

토론

여기에서 우리는 Vidilaseris 등^14에근거를 둔 96 개의 웰 플레이트 포맷에서 T. maritima에서 막 결합 된 열성 포에 대한 억제제의 간단한 스크리닝을위한 상세한 프로토콜을보고합니다. 이 프로토콜은 저렴하고 산성 조건하에서 정형 외과 및 몰리브데이트에서 형성되고 뚜렷한 청색^12를가진 인산염 종으로 감소되는 12-포스포모모리브딕 산을 기반으로 합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG