הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Summary

כאן אנו מציגים שיטת ההקרנה עבור פירופוספאז ממברנה הממברנה (מתוך מעכבי התרמוטוגה) על בסיס מוליבדן תגובה כחולה בפורמט 96 צלחת היטב.

Abstract

פירופוספטסיס ממברנה (mPPases) הם אנזימים dimeric המתרחשים בחיידקים, הארכאית, צמחים, וטפילים פרוטיסטים. חלבונים אלה קליב פירופוספט לשתי מולקולות אורתופהונאים, אשר בשילוב עם פרוטון ו/או נתרן שאיבה על פני קרום. מכיוון שאין חלבונים הומוולוגיים להופיע בבעלי חיים ובבני אדם, mPPases הם מועמדים טובים בעיצוב של מטרות סמים פוטנציאליים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למסך עבור מעכבי mPPase ניצול מוליבדן תגובה כחולה במערכת 96 צלחת היטב. אנו משתמשים mPPase מן החיידק תרמופילית תרמוטוגה מארימה (tmppase) כאנזים מודל. פרוטוקול זה הוא פשוט וזול, הפקת תוצאה עקבית ואיתנה. זה לוקח רק שעה אחת כדי להשלים את פרוטוקול התאמת הפעילות מתחילתו של הסדר עד המדידה ספיגת. כיוון שהצבע הכחול המיוצר בתוך מעשה זה יציב למשך פרק זמן ארוך, ניתן לבצע את הפעולות הבאות מיד לאחר האצווה הקודמת, וניתן למדוד את הספיגה מאוחר יותר עבור כל הקבוצות בו. החיסרון של פרוטוקול זה הוא שזה נעשה באופן ידני ולכן יכול להיות מתיש, כמו גם לדרוש כישורים טובים של ליטוף ושמירה זמן. יתר על כן, התמיסה ארגיט-ציטראט המשמשת בטיפול זה מכילה נתרן ארגיט, שהוא רעיל ויש לטפל בו באמצעי זהירות נחוצים.

Introduction

כ -25% של החלבונים הסלולריים הכולל הם חלבונים ממברנה ו 60% מהם הם מטרות התרופה^1,2. אחת ממטרות התרופה הפוטנציאלית³, ממברנה מאוגד פירופוספסים (mppases הם אנזימים dimeric המשאבה פרוטון ו/או נתרן יון על ידי הידרוליזה של פירופוספט לשני^{אורטופד 4}. mPPases ניתן למצוא אורגניזמים שונים⁵ כגון חיידקים, הארכונים, צמחים, וטפילים פרוטיסטים, למעט בני אדם ובעלי חיים⁴. ב טפילים פרוטיסטים, למשל פלמודיום falciparum, טוקסופלזמה gondii ו טריאנוסומה ברוסייאי, mppasesהם חיוניים עבור התקפה ואלימה הטפיל⁶ ו נוקאאוט של ביטוי זה טפילים להוביל לכישלון בשמירה על חומציות תאיים על חשיפה ל-ph הבסיסי החיצוני⁷. בשל חשיבותם וחוסר חלבון הומולוגי המצויים בחוליות, ניתן להתייחס ל-mPPases כמטרות התרופות הפוטנציאליות עבור מחלות הפרוסטל³.

הקרנת חוץ גופית של מעכבי mPPase בעבודה זו מבוססת על מערכת מודל TmPPase. Tmppase הוא שאיבה יון נתרן ומיון אשלגן תלוי mppase מ T. קיסריה ויש לו פעילות אופטימלית ב 71 ° צ'⁸. היתרונות של אנזים זה הם למשל הקלות שלה בייצור וטיהור, יציבות תרמית טובה ופעילות מסוימת גבוהה. Tmppase מראה גם דמיון גבוה בנוסף על שימור מוחלט של העמדה, כמו גם זהות של כל שאריות קטליטי כדי mpp,^{התלת ממדי 3,9} ולמבנה פתרו של ויגו radiata¹⁰ mppase. המבנים הזמינים של TmPPase בקונמציות שונות הן גם שימושיות עבור ניסוי מבוסס מבנה התרופה עיצוב (כמו הקרנה וירטואלית דה נובו עיצוב).

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט להקרנה של מעכבי TmPPase ב 96 בפורמט צלחת הבאר (איור 1). הפרוטוקול מבוסס על שיטת הצביעה של התגובה הכחולה מוליבדן, אשר פותחה לראשונה על ידי פיסק ו Subbarow¹¹. שיטה זו כוללת את היווצרות של 12-פוספוליפוליב חומצה בmolybdate באמצעות מצבים חומציים, אשר מופחת אז לתת מינים אופייני בצבע כחול phosphomolybdenum¹².

Protocol

1. הכנת חלבון

הערה: הביטוי והטיהור של TmPPase תוארו במקום אחר¹³.

1. הכינו 10 מ ל של פתרון מאגר ההפעלה מראש המכיל 20 מ"מ 2-(N-dodecyl olino) החומצה ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) גליצרול, 2 מ"מ dithioitol (dtt), ו 0.05% maltoside (ddm).
2. הכינו 10 מ ל של תערובת התגובה המכילה 200 mM טריס-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl₂, 333 MM kcl, ו-67 Mm הנאל.
   הערה: Mg^{2 +} נדרש כדי לאכול את הפירופוספט כמצע של Mppase, K⁺ נדרש כדי להגדיל את פעילות האנזים כמו Tmppase הוא mppase אשלגן תלוי, ו-Na⁺ נדרש עבור פעילות האנזים במהלך הטרנסלוקציה של הנתרן על ידי tmppase.
3. הכינו 30 מ"ג/מ ג ליפוזומים לצורך אנזים ההפעלה.
   1. להוסיף 10 מ"ל של 20 מילימטר טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT כדי 0.3 g של L-α-פוספוליכולין מ סויה ל 10 מ ל של 20 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 עם 1 מ"מ DTT.
   2. לשים את ליפומה על קרח, ו sonicate עם 1 מרווח הפעימה השנייה 1 דקה, הפסקה 1 דקה, ולחזור עד הפתרון הופך צהוב שקוף.
   3. הקפאת הליזומים, הקפא בחנקן נוזלי ואחסן ב-80 ° c עד שימוש.
4. . הפעל מחדש את האנזים
   1. מערבבים 40 μL של הפתרון ליפוזומים עם 22.5 μL של 20% DDM.
   2. מחממים את התערובת ב-55 ° c למשך 15 דקות ומאפשרים לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
   3. הוסף 36.5 μL של פתרון מאגר ההפעלה מראש, ערבב והוסף 1 μL של חלבון מרוכז (13 מ"ג/mL) כדי לבצע ריכוז מוחלט של 0.13 mg/mL.
      הערה: החלבון הוא קפוא בדרך כלל ב 10 μL ' ali, לאחר טיהור ולהפשיר על קרח לפני השימוש.
5. קח 20 μL של האנזים שהפעיל מופעל ולהוסיף ל 1,480 μL של תערובת התגובה, ואז לערבב בעדינות.
   הערה: יש לבצע את התוספת של האנזים שהוא מופעל לתערובת הריאקציה בדיוק לפני שימוש בו.

2. הכנה מורכבת

1. מפזר את תרכובות diמתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להפוך את הפתרונות מניות של 25 ל-100 מ"מ ב 50 ליטר μL, מבוסס על זמינות של תרכובות.
   הערה: כל התרכובות המשמשות כאן (איור 2א) פורסמו בעבר⁹. אם מסיסות מורכבים נמוך, ריכוז המניה ניתן לכוונן בהתאם.
2. הכן שלושה ריכוזים שונים. של כל תרכובת במים
   הערה: הריכוזים הסופיים בתערובת התגובה יהיו 1, 5, ו-50 micromolar או 1, 5, ו 20 micromolar עבור תרכובות מסיסים ומסיסים בהתאמה.
   1. לדלל את הפתרון במניה עם מים כדי 1 mL ב microtubes לתת 2 μM, 10 μM ו 100 μM עבור תרכובות מסיסים, או לחילופין 2 μM, 10 μM ו 40 μM עבור תרכובות מסיסים בחסכנות.
   2. מערבולת הפתרון המורכב מיד לאחר דילול הפתרון מניות עבור ערבוב נאות.
3. בדוק אם יש צבירה מורכבת באמצעות נפלומטר.
   הערה: זה נלמד כמו טריפליטים בשלושה ריכוזים (1 μM, 5 μM ו -20 μM) ו מנורמל לריק ב 96 צלחת היטב.
   1. לחלק 75 μL של תערובת התגובה לתוך כל טוב באמצעות הצנרת רב-ערוצי.
   2. הוסף 75 μL של כל תרכובת (עבור הריק, השתמש 75 μL של מים במקום) ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 ×.
   3. למדוד כל טוב ב 300 V באמצעות אימונולוגיה נפלומטר.

3. ריאגנטים להכנת שיטת ההכנה

1. הכינו את התמיסה הארגיט-ציטראט.
   1. שוקל 5 גר' נתרן ארגיט ו -5 גר' טרינתרן ציטראט.
      התראה: הנתרן ארגיט הוא רעיל, ובכך להשתמש בציוד הגנה נאותים ולטפל בטיפול מיוחד. כאמצעי זהירות, אל תטפל בפני כל אמצעי הזהירות הנחוצים של בטיחות שנקראו והובנו. לטפל רק בתוך מכסה המנוע על מנת לא לשאוף אבק/אדים של התרכובת או הפתרון (של). אם שאפו, עברו לאוויר צח והשיגו טיפול רפואי. ללבוש משקפי בטיחות כימיים מתאימים, כפפות מגן וביגוד כדי למנוע בליעה והעין/עור מגע. אם בלע, קרא מיד למרכז הרעלים או לרופא/רופא. אם הוא מקבל על העור או בעין (s), לשטוף עם הרבה מים ולקבל טיפול רפואי.
   2. מתמוסס לתוך 100 מ ל של מים.
   3. הוסף 5 מ ל של חומצה אצטית קרחוני, לערבב, ולהוסיף מים 250 mL.
   4. החנות בטמפרטורת החדר מוגנת מאור.
      הערה: הפתרון יציב למעלה משנה.
2. הכינו פתרון A ופתרון B.
   1. עבור פתרון A, להוסיף 10 מ ל קרח קר 0.5 M HCl כדי 0.3 g של חומצה אסקורבית. מפזר את החומצה האסקורבית על ידי וורטקסנג.
   2. עבור פתרון B, להוסיף 1 מ ל של מים קרים קרח כדי 70 מ"ג של אמוניום הפיטאמאוליבתאריך ומערבולת להתמוסס.
      הערה: אחסן את שני הפתרונות בקרח עד לשימוש. לגבי עקביות תוצאת הסדר, ניתן לאחסן את שני הפתרונות בקרח למשך שבוע מקסימום.
3. להכין את פוספט (P_i) תקן עם הריכוז של 0 μm, 62.5 μm, 250 μm ו 500 μm עבור כיול.
   1. הוסף 0 μL, 25 μL, 50 μL, ו 100 μL של 5 מ"מ₂hpo₄ דימיים עד ארבע מיקרוצינורות המכילים 370 μl של תערובת התגובה.
   2. למעלה עד 1 מ ל עם מים.

4. שיטת הפעילות עבור 1 96 צלחת הבאר

הערה: ראה איור 1 עבור זרימת העבודה הסכמטית של המנה.

1. הוסף 1 mL של פתרון B כדי 10 מ ל של פתרון A, לערבב על ידי vortexing ולאחסן את הפתרון על קרח.
   הערה: פתרון זה צריך להיות שקוף וצהוב. שמור פתרון A + B על הקרח לפחות 30 דקות לפני השימוש. עם זאת, להשתמש בפתרון בתוך 3 h כפי שהוא ילך רע לאחר אחסון לטווח ארוך.
2. הוסף 40 μL של 0 μM, 62.5 μM, 250 μM ו500 μM P_i רגיל לרצועות הצינורית בטריליפיטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
   הערה: תערובת התגובה עם P_אני הוסיף ישמש ריק.
3. הוסף 25 μL של פתרון מורכב לרצועות הצינור באמצעות מנקז רב-ערוצי.
   הערה: לכל תרכובת יש שלושה ריכוזים שונים בטריליפיאט, שמספיק להערכת הראשונית של הריכוז המקסימלי של חצי העכבות (IC₅₀). For₅₀ IC מדויק יותר הגדרה, שמונה ריכוזי מורכבות שונים ניתן להשתמש. עבור האנזים הבלתי מעוכב הפתרון המורכב מוחלף בכמות מים שווה. כמו שולטת חיובית 2.5 μM, 25 μM, ו 250 μM של שדדודיפוספט (IDP) מלח נתרן שימשו.
4. הוסף 15 μL של תערובת התמיסה mPPase לפסי הצינור (למעט החצוצרות המכילות את התקן P_i ) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
5. חותם את רצועות הצינורית באמצעות גיליון איטום מדבק. חותכים את גיליון האטימה כדי להפריד כל אחד ממפצל הצינורות.
6. לפני הדגירה הדגימות עבור 5 דקות ב 71 ° c. מניחים את הדגימות על בלוק החימום עם מרווח של 20 s בין כל רצועה כדי למזער את צריכת הזמן במהלך השלבים הבאים.
7. עבור כל רצועה, פתח את איטום דבק. הוסף 10 μL של 2 מ"מ נתרן פירופוספט dibasic באמצעות פיפטה רב-ערוצי ולערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 ×. אטום את רצועת הצינורית שוב באמצעות אותו איטום.
   הערה: שלב זה עשוי להיות קשה לביצוע במהלך 20 s; עם זאת, זה יהיה קל יותר לאחר כמה שאומר.
8. מודקון ב 71 ° c עבור 5 דקות.
9. מניחים את הדגימות על מנגנון הקירור עם מרווח של 20 s בין כל רצועה. תן להם להתקרר 10 דקות אבל צנטריפוגה כל רצועה בקצרה לאחר 5 דקות של קירור, כדי להוריד טיפות מים מתחת לסדין איטום, ואז לשים אותו בחזרה למנגנון הקירור ולהסיר את האיטום.
   הערה: מנגנון הקירור ניתן לעשות על ידי הצבת לוחית ה-PCR 96 היטב בקלקר צלחת פטרי (גודל 150 מ"מ × 15 מ"מ) מלא מים קפואים לפחות 1 h. יש להוציא את המנגנון מהמקפיא בערך 5 דקות לפני תחילת השיטת. אין להוציא את מנגנון הקירור ממש לפני קירור לדוגמה כפי שהוא להקפיא את תערובת התגובה ולעכב את התפתחות הצבע.
10. לאחר 10 דקות של קירור, להוסיף 60 μL של הפתרון A + B, לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה עבור 5 × ולשמור על פסי הצינור על מנגנון קירור עבור 10 דקות.
11. הוסף 90 μL של הפתרון הארמיט-ציטראט ושמור בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות כדי לייצר צבע כחול יציב.
    התראה: בשל הרעילות שלה כל הפתרונות המכילים נתרן ארגיט צריך להיות מטופל עם טיפול נוסף בכל עת. לפיכך, יש לבצע את הוספת התמיסה של ארגיט-ציטראט בתוך מכסה המנוע.
12. לוותר 180 μL של כל תערובת התגובה לתוך ברור 96 מיקרוצלחת פוליסטירן היטב.
13. למדוד את ספיגת כל טוב ב 860 ננומטר באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרופלטה.

5. ניתוח תוצאות

1. ממוצע הטריליליטים של כל אחת מהדוגמאות והסטנדרטים של P_i . לאחר מכן הפחת עם הריק כדי לבטל את אות הרקע.
2. בצע עקומת כיול על-ידי התוויית ערכי הספיגה (A₈₆₀) כנגד כמות התקן P_i (nmol) וביצוע רגרסיה ליניארית כדי להשיג את פונקציית קו המגמה באמצעות הנוסחה הבאה:
   
3. חישוב כמות הפוספט (nmol) ששוחרר מהתגובה האנזימטית המבוססת על נוסחת הרגרסיה הליניארית לעיל.
4. חשב את הפעילות הספציפית באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   כאשר nP_אני כמות של פוספט שוחרר מן התגובה (nmol), t הוא זמן התגובה (דקות), ו- m_tmppase הוא כמות tmppase טהור בשימוש בתוך השיטת (mg).
5. חשב את אחוז הפעילות עבור כל ריכוז מעכבי באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   כאשר sa_אניזההפעילות הספציפית של מדגם עם מעכב ו- SA_un היא הפעילות הספציפית של המדגם עצורים.
6. חשב את הלוגיקה₅₀ (הערכה) ו-IC₅₀ (הערכה) עם התאמה רגרסיה לא לינארית מעקומת מינון ארבע פרמטרים באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   כאשר X הוא הרישום של ריכוז (μM), Y היא פעילות (%), העליון והתחתון הם רמות באותה יחידה כמו Y (100% ו-0%, בהתאמה), לוגיקה₅₀ יש את אותו יחידות יומן כמו X, ו-הילדרון = גורם מדרון או מדרון הגבעה, שהוא unitless.
   הערה: תוכנה (רשימת חומרים) משמשת למדידה. השתמש בריכוז של 0.01 μM (במקום 0.00 μM) עבור המדגם ללא מעכב כאשר הלוגריתם של אפס אינו מוגדר.

תוצאות

בפרוטוקול זה, שמונה תרכובות (1-8) נבדקו (איור 2 א) יחד עם idp, מעכבי נפוץ של פירופוספטיות, כשליטה חיובית. כל תרכובת נבדקה בשלושה ריכוזים שונים (1 μM, 5 μM ו-20 μM) בטרילקאט. זרימת העבודה של ההקרנה מתוארת באיור 1, החל ממדגם והכנה מגיב עד למדידה הספיגה ב 860 ננומטר.

Discussion

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור הקרנה פשוטה של מעכבי עבור פירופוספאז של קרום מאוגד מ T. קיסריה בפורמט 96 צלחת היטב מבוסס על vidilaseris ואח '¹⁴. פרוטוקול זה הוא זול ובעל בסיס של 12-פוספומוליפוליב חומצה, אשר נוצרת מאורתופדיה וmolybdate בתנאים חומציים ומופחתת למינים phosphomolybdenum עם צ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive sealing sheet	Thermo Scientific	AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate	Merck	F1412481 636
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96Well Multidish	Thermo Scientific	130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Merck	1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120)	Nippon genetics	FG-028
Dodecyl maltoside (DDM)	Melford	B2010-100G
Ethanol	Merck	1009901001
Glacial acetic acid	Merck	1000631011
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin	Sigma	429415-100GM
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750)	Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm)	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
Potassium chloride	Merck	104936
Prism 6 software	GraphPad
QBT2 Heating block	Grant Instruments
Sodium meta-arsenite	Fisher Chemical	12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi)	Sigma	S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic	Fluka	71501-100G
Trisodium citrate dihydrate	Fluka	71404-1KG