Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تمثل الـ DNA FISH ثلاثية الأبعاد أداة لتصور اللوية الجينومية المتعددة داخل النوى المحفوظة ثلاثية الأبعاد، مع تحديد تفاعلاتها المتبادلة وتوطينها بشكل لا لبس فيه داخل الفضاء النووي على مستوى خلية واحدة. هنا ، يتم وصف بروتوكول خطوة بخطوة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية.

Abstract

والسؤال الرئيسي في بيولوجيا الخلايا هو تنظيم الجينوم داخل الفضاء النووي وكيف يمكن أن تؤثر بنية الكروماتين على عمليات مثل التعبير الجيني وهوية الخلية والتمايز. يمكن تقسيم العديد من النُهج التي تم تطويرها لدراسة العمارة ثلاثية الأبعاد للجينوم إلى فئتين متكاملتين: التقنيات القائمة على التقاط تشكيل الكروموسوم (C-technologies) والتصوير. في حين أن الأول يقوم على التقاط تشكيل الكروموسوم والتفاعلات الحمض النووي القريب في مجموعة من الخلايا الثابتة ، وهذا الأخير ، على أساس تهجين الحمض النووي في الموقع (FISH) على النوى 3D الحفاظ عليها ، يسمح التصور المعاصر لل loci متعددة على مستوى خلية واحدة (متعددة الألوان)، ودراسة تفاعلاتها وتوزيعها داخل نواة (3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك). تقنية ثلاثية الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان FISH لديها حد من تصور سوى عدد قليل من loci المحددة مسبقا، لا يسمح بإجراء تحليل شامل للبنية النووية. ومع ذلك ، نظرا لمتانة نتائجها ، 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في تركيبة مع المجهر 3D وإعادة بناء الصورة هو وسيلة ممكنة للتحقق من صحة النتائج القائمة على التكنولوجيا جيم ودراسة لا لبس فيها موقف وتنظيم loci محددة على مستوى خلية واحدة. هنا ، نقترح طريقة خطوة بخطوة من 3D متعدد الألوان DNA FISH مناسبة لمجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ومناقشة جميع الإجراءات العملية والخطوات الحاسمة ومفاهيم التصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل البيانات اللازمة للحصول على ثلاثية الألوان ناجحة وغنية بالمعلومات الحمض النووي الأسماك في سياقات بيولوجية مختلفة.

Introduction

تحتاج eukaryotes أعلى إلى تكثيف منهجي والتعاقد على كمية كبيرة من المعلومات الوراثية في الفضاء 3D دقيقة من نواة1،2،3،4. اليوم ، ونحن نعلم أن يتم ترتيب الجينوم مكانيا في المقصورات والمجالات المرتبطة طوبولوجية5 ، وأن مستويات متعددة من طي الحمض النووي تولد الاتصالات بين مناطق الجينوم المختلفة التي قد تنطوي على تكوين حلقة الكروماتين6،7. يمكن للحلقات الديناميكية ثلاثية الأبعاد من الكروماتين أن تؤثر على العديد من العمليات البيولوجية المختلفة مثل النسخ8،9، التمايز والتطوير10،11، إصلاح الحمض النووي12،13، في حين تشارك اضطراباته في أمراض مختلفة14،15،16 وعيوب النمو15،17،18.

وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة تنظيم الجينوم 3D. الكروموسوم الالتقاط التكنولوجيات القائمة على (C-التكنولوجيات، 3C، 4C، 5C، مرحبا-C والمشتقات) وقد وضعت لدراسة تنظيم الجينوم في الخلايا الثابتة3،4،19،20. وتستند هذه النُهج إلى القدرة على التقاط ترددات الاتصال بين موضع الجينوم في القرب المادي. C-التكنولوجيات، اعتمادا على تعقيدها، وقبض على منظمة الجينوم 3D العالمية والطوبولوجيا النووية من عدد الخلايا3،4،19،20. ومع ذلك ، فإن التفاعلات ثلاثية الأبعاد ديناميكية في الزمان والمكان ، ومتغيرة للغاية بين الخلايا الفردية التي تتكون من تفاعلات متعددة ، وهي غير متجانسة على نطاق واسع21،22.

تُعنى تقنية التهجين ثلاثي الأبعاد للحمض النووي متعدد الألوان في الموقع (FISH) بتصور موضع جينومي محدد على مستوى خلية واحدة، مما يتيح إجراء تحقيق مباشر في البنية النووية ثلاثية الأبعاد بطريقة مكملة لتقنيات C. وهو يمثل تكنولوجيا تستخدم حاليا للتحقق من صحة النتائج C بشكل لا لبس فيه. يستخدم الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH مسابر ذات علامة فلورية مكملة لموضع الجينوم للاهتمامات. استخدام الفلوروفوريات المختلفة ومعدات المجهر مناسبة تسمح التصور المعاصر لأهداف متعددة داخل الفضاء النووي23،24. في السنوات الأخيرة ، تم دمج FISH مع التقدم التكنولوجي في المجهر للحصول على تصور الهياكل ذات النطاق الدقيق بدقةعالية 25،26 أو مع نهج CRISPR-Cas لتصور الأحماض النووية في التصوير الحي27،28. على الرغم من اعتماد واسع النطاق، لا يزال نهج الحمض النووي متعدد الألوان متعدد الألوان يعتبر صعبًا في العديد من المختبرات لأنه يجب تكييف المواد البيولوجية المستخدمة.

هنا ، نقدم بروتوكولًا شاملًا لـ 3D MULTIColor DNA FISH (من إعداد الخلية / المسبار إلى تحليل البيانات) ينطبق على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، مما يتيح تصور loci الجينومية المتعددة والحفاظ على بنية 3D من النوى. من أجل دراسة العمارة النووية ، يجب الحفاظ على هيكل النوى ثلاثية الأبعاد. لهذا السبب ، على النقيض من البروتوكولات القائمة الأخرى29،30،31، نتجنب استخدام تدرج الكحول وتخزين القسائم في الكحول التي يمكن أن تؤثر على بنية الكروماتين32. يتم تكييف هذه الطريقة من الحفاظ على بروتوكولات الحمض النووي 3D FISH24،33 ليتم تطبيقها على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية ، سواء المعزولة في الجسم الحي السابق أو المستزرعة في المختبر. هناك معلمات permeabilization وإزالة البروتينة لمختلف مورفولوجيا النووية والخصائص الخلوية (على سبيل المثال، درجات مختلفة من الضغط النووي، وفرة الهيكل الخلوي)34. وغالباً ما توصف هذه المعلمات عموماً في بروتوكولات أخرى24،33، دون تقديم تمييز واضح للإجراء داخل أنواع الخلايا المختلفة. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير أداة محددة تسمى NuCLаD (محدد مواقع الاتصالات النووية في 3D)16، وتوفير مبادئ لتحليل البيانات من شأنها تحسين القرب ثلاثي الأبعاد بين أماكن مختلفة وتوزيعها الطوبولوجي النووي داخل الفضاء النووي بطريقة آلية.

Protocol

1. الحمض النووي إعداد التحقيق وإجراءات وضع العلامات مع ترجمة نك

  1. تنقية وتنظيف الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (BACs)، plasmids أو منتجات PCR مع مجموعات محددة(جدول المواد)،إعادة تعليق في ddH2O، والتحقق من قبل electrophoresis على هلام agarose والقياس الكمي.
  2. إجراء ترجمة نك على 1.5−2 ميكروغرام من الحمض النووي من الخطوة 1.1 في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر عن طريق خلط جميع الكواشف في أنبوب الحمض النووي المنخفض 0.5 مل وفقاً للجدول 1.
    ملاحظة: يمكن للتحقيقات المسماة مباشرة تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. مجموعات لإنتاج تحقيقات وصفت بشكل غير مباشر ومباشر مع مختلف الفلوروكرومات اليكسا عن طريق ترجمة نك متوفرة تجاريا.
  3. احتضان مزيج ترجمة الـ nick في خلاط حراري عند 16 درجة مئوية لفترة حسب طول مادة الحمض النووي الأولية: 45 دقيقة لمنتجات PCR (مجموعة من منتجات PCR من 2000 نقطة أساس لكل منها) وما يصل إلى 4 ساعة لـ BAC DNA وplasmids.
  4. تحقق من حجم المسابير المنتجة في الخطوة 1.3 عن طريق الكهربية على هلام agarose 2.2٪.
    ملاحظة: حجم المسبار الأمثل هو < 200 bp(الشكل 1A).
    1. إذا لم يتم هضم الحمض النووي بما فيه الكفاية، أضف 5 يو من بوليميراز الحمض النووي الأول و0.05 U من DNase I إلى التفاعل واحتضان 1-2 ساعة عند 16 درجة مئوية ثم إعادة التحقق. وقف رد الفعل مع 0.5 MM EDTA (التركيز النهائي). مخزن المسابير في -20 درجة مئوية.
  5. لكل تجربة الحمض النووي الأسماك، تعجل الكميات التالية من المسابير اعتمادا على المواد DNA بدءا من التي يتم إنتاج المجسات: 200 نانوغرام من منتجات PCR ترجمة نك، 100 نانوغرام من BACs ترجمة نك، أو 300 نانوغرام من بلازميد مترجمة. أضف ddH2O حتى 150 ميكرولتر، و20 ميكروغرام من الحمض النووي لمنوى السلمون غير الموسومة، و3.5 ميكروغرام من الحمض النووي Cot-1 الخاص بالأنواع، و3 مجلدات من EtOH بنسبة 100٪، و1/10 حجم 3 M خلات الصوديوم 5.2. راسب عند -80 درجة مئوية لساعة واحدة.
  6. الطرد المركزي في السرعة القصوى ل1 ساعة في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant. غسل بيليه مرتين مع 70٪ EtOH.
  7. إعادة تعليق بيليه في 2 μL من 100٪ formamide درجة الحموضة 7.0، يهز في 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (يمكن أن يستغرق ما يصل إلى بضع ساعات) ومن ثم إضافة حجم متساو من 4x المالحة الصوديوم سترات (SSC)/20% كبريتات دإكستران.
    1. إعداد 20x SSC عن طريق خلط 175.3 غرام من NaCl و 88.2 غرام من سترات الصوديوم في حجم نهائي من 1 لتر من H2O. أوتوكلاف، تصفية وإعداد aliquots.
      ملاحظة: بالنسبة لـ DNA FISH متعدد الألوان، يمكن أن تُعجَّل المجسات المختلفة معًا باستثناء المسابير التي يمكن أن تكون مع بعضها البعض. في هذه الحالات المحددة، نعالجها بشكل منفصل، وتعجل ويعاد تعليق المسابير التي تقسم الكواشف المذكورة في الخطوات 1.5-1.7 فيما يتعلق بعدد المسابير. تجمع المجسات فقط بعد إعادة التعليق في formamide. إذا تم استخدام التغطيات الزجاجية التي تزيد عن 10 مم أو أقل من 10 مم، فقم بزيادة/انخفاض حجم الكواشف المستخدمة في الخطوات 1.5−1.7 بشكل متناسب مع حجم الشريحة. يمكن تخزين مسابجة التهجين عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى شهرين).

2- تثبيت الخلايا، والعلاج المسبق، ونفاذها

ملاحظة: ممرات البيرمابيلية وإزالة البروتين هي خطوات حاسمة. يعتمد وقت رد الفعل وتركيز الكواشف بشدة على نوع الخلية ، ووفرة السيتوبلازم ، ومورفولوجيا نووية.

  1. تثبيت الخلايا، ما قبل العلاج ونفاذية للخلايا اللمفاوية T الأساسية البشرية
    ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب للخلايا الصغيرة، مع نواة صغيرة وكمية منخفضة من السيتوبلازم.
    1. استخدام القسائم الزجاجية (10 ملم، سمك رقم 1.5H).
    2. غسل الزجاج مع DDH2O، ثم مع 70٪ EtOH والسماح لهم الجافة. استخدام كوب واحد لكل بئر من لوحة 24 جيدا.
    3. إضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ بولي-L-ليسين (ث/v)(جدول المواد)مباشرة على الزجاج لتشكيل قطرة. انتبه واحرص على أن يبقى القطرة على سطح الزجاج دون لمس البئر لمدة 2-5 دقيقة.
    4. تنفيذ الخطوة 2.1.3 مرتين أكثر.
    5. وضع 200 ميكرولتر من خلايا التعليق (2 × 106/ مل، تعليق PBS من الخلايا اللمفاوية T الابتدائية السابقة) مباشرة على الزجاج، والسماح للخلايا البذور في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    6. إزالة بسرعة قطرة. إضافة الطازجة 4% PFA (أعدت في PBS/0.1% TWEEN 20, درجة الحموضة 7.0, تصفية) لمدة 10 دقيقة وإصلاح الخلايا المزروعة في RT.
    7. غسل ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما مع 0.05٪ تريتون X-100/PBS (TPBS) في RT. Permeabilize مع 0.5٪ TPBS لمدة 10 دقيقة في RT.
    8. قم بإجراء علاج RNase بإضافة 2.5 ميكرولتر من كوكتيل RNase(جدول المواد)في 250 ميكرولتر من PBS /well في لوحة 24-well لساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    9. شطف في برنامج تلفزيوني، إضافة 20٪ الجلسرين / PBS، واحتضان بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن تتراوح هذه الخطوة من 1 ساعة إلى ON. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 20٪ الجلسرين / PBS في 4 درجة مئوية تصل إلى 7 أيام.
    10. تجميد الجليد الجاف (15-30 ث)، وذوبان الجليد تدريجيا في RT، ونقع في 20٪ الجلسرين / PBS. كرر الخطوة 2.1.9 آخر ثلاث مرات.
    11. غسل في 0.5٪ TPBS لمدة 5 دقيقة في RT. غسل في 0.05٪ TPBS، مرتين لمدة 5 دقيقة في RT. احتضان في 0.1 N HCl لمدة 12 دقيقة في RT. شطف في 2x SSC.
    12. احتضان في 50٪ formamide درجة الحموضة 7.0/2x SSC ON في RT.
      ملاحظة: يمكن تحسين وقت الحضانة وتقليله في نهاية المطاف. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 50٪ formamide/2x SSC لعدة أيام.
  2. تثبيت الخلايا، ما قبل العلاج ونفاذية لmyoblasts الإنسان الأولية
    ملاحظة: هذا البروتوكول مناسب للخلايا الكبيرة، مع كمية عالية من السيتوبلازم.
    1. تنمو myoblasts البشرية الأولية مباشرة على نظارات coverslip في لوحات 24-well في وسط النمو (متوسط النسر المعدل ة Dulbecco (DMEM) ، 20٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، 25 نانوغرام / مل عامل نمو الليفية (FGF) ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، 10 ميكروغرام / مل الأنسولين البشري ، 1x الجلوتامين، 1x البنسلين/ستريبتومسين) لمدة 24 ساعة على الأقل (تصل إلى 50-70٪ من التقاء).
      ملاحظة: لتسهيل الالتصاق، يمكن استخدام الجيلاتين أو الكولاجين أو البولي L-ليسين لمعطف قسيمة الغطاء قبل البذر.
    2. شطف الخلايا في 2-3 تغييرات من برنامج تلفزيوني. إضافة أدلى حديثا 4٪ PFA وإصلاح الخلايا لمدة 10 دقيقة في RT.
    3. غسل ثلاث مرات لمدة 3 دقيقة لكل منهما في 0.01٪ TPBS في RT. Permeabilize في 0.5٪ TPBS لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. قم بإجراء علاج RNase بإضافة 2.5 ميكرولتر من كوكتيل RNase(جدول المواد)في 250 ميكرولتر من PBS /well في لوحة 24-well لساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    5. شطف في برنامج تلفزيوني، إضافة 20٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني، واحتضان على في RT.
      ملاحظة: يمكن أن تتراوح هذه الخطوة من 1 ساعة إلى ON. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 20٪ الجلسرين / PBS في 4 درجة مئوية تصل إلى 7 أيام.
    6. تجميد الجليد الجاف (15-30 ث)، وذوبان الجليد تدريجيا في RT، ونقع في 20٪ الجلسرين / PBS. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
    7. يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني. احتضان في 0.1 N HCl لمدة 5 دقيقة في RT. شطف في 2x SSC.
    8. احتضان في 50٪ formamide درجة الحموضة 7.0/2x SSC ON في RT.
      ملاحظة: يمكن تحسين وقت الحضانة وتقليله في نهاية المطاف. يمكن الاحتفاظ بالشرائح في 50٪ formamide/2x SSC لعدة أيام.
    9. الشرائح التوازنية (أبقى في 50٪ formamide/2x SSC) في SSC 2x لمدة 2 دقيقة. ثم، equilibrate في برنامج تلفزيوني لمدة 3 دقيقة.
    10. علاج مع 0.01 N HCl/0.0025% البيبسين من بضع ثوان تصل إلى 5 دقائق, اعتمادا على نوع الخلية. خلال هذه الخطوة ، لاحظ الخلايا تحت المجهر البصري ووقف التفاعل (الخطوة 2.2.11) بمجرد أن تكون النوى خالية من السيتوبلازم ، مع الحفاظ على هيكلها سليمة (على سبيل المثال ، لا تزال النيوكليولية مرئية وسليمة).
    11. تعطيل البيبسين عن طريق الغسيل مرتين لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 50 م م م MgCl2/PBS.
    12. بعد الإصلاح في 1٪ PFA / PBS لمدة 1 دقيقة غسل لمدة 5 دقيقة في برنامج تلفزيوني. غسل مرتين لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 2x SSC، ثم إضافة 50٪ formamide/2x SSC لمدة 30 دقيقة على الأقل.

3. 3D متعدد الألوان التهجين الحمض النووي الأسماك

  1. تشويه المجسات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة، ثم وضعها بسرعة على الجليد.
  2. تحميل تحقيقات التهجين على شريحة المجهر نظيفة. بدوره غطاء مع الخلايا رأسا على عقب على قطرة من المجسات التهجين.
  3. ختم غطاء مع الاسمنت المطاط. دع الأسمنت المطاطي يجف تمامًا. ثم ضع الشرائح على كتلة التدفئة وتشوه في 75 درجة مئوية لمدة 4 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن زيادة توقيت التسخ ودرجة حرارة التسخ، حتى 80 درجة مئوية.
  4. هجين عند 37 درجة مئوية في صندوق معدني يطفو في حمام مائي.
    ملاحظة: لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، يمكن أن ترتفع درجة حرارة التهجين إلى 42 درجة مئوية.
  5. قشر قبالة الاسمنت المطاطي، تزج الشرائح في 2x SCC، وتجريد قبالة غطاء الزجاج ونقله إلى SSC 2x في لوحة 6-جيدا.
  6. اغسل في 2x SSC ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منها في 37 درجة مئوية، وتهتز عند 90 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة. يغسل في 0.1x SSC ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 60 درجة مئوية، تهتز في 90 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة. شطف لفترة وجيزة في 4x SSC/0.2% TWEEN 20.

4. 3D الكشف عن الحمض النووي متعدد الألوان الأسماك

ملاحظة: بالنسبة للتحقيقات المسماة مباشرة، تخطي الخطوتين 4.1 و4.2.

  1. كتلة في 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% بوملين مصل البقر (BSA) لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية في لوحة 24-جيدا, تهتز في 20 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
  2. احتضان مع التركيز المناسب لمكافحة digoxygenin (1:150)، و / أو ستريبتفيفيدين (1:1،000)(جدول المواد)المخفف في 4x SSC/0.2٪ TWEEN 20/4٪ BSA لمدة 35 دقيقة في غرفة مظلمة ومبللة في 37 درجة مئوية.
  3. يغسل في 4x SSC/0.2% TWEEN 20 ثلاث مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما في 37 درجة مئوية, تهتز في 90 دورة في الدقيقة في لوحة 6-well في شاكر حاضنة.
  4. Equilibrate في برنامج تلفزيوني وما بعد الإصلاح في 2 ٪ الفورمالديهايد / برنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة في RT في لوحة 24 جيدا.
    ملاحظة: لا تحتاج المسابير المسماة مباشرة إلى تثبيت بعد.
  5. غسل 5x لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. وصمة عار مع 1 نانوغرام / مل DAPI (4،6-diamidino-2-phenylindole)/PBS لمدة 5 دقيقة في RT.
  6. غسل 5x لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. جبل مع حل antifade(جدول المواد).

5. 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك المجهر والتحليل

  1. الحصول على صور ثلاثية الأبعاد مع نظام المجهر.
    ملاحظة: هنا، يتم استخدام مجهر واسع الحقل بمسافة محورية تبلغ 0.2-0.25 ميكرومتر بين المقاطع المتتالية(الشكل 1B).
  2. تحليل أكوام الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام برامج وأدوات مختلفة (هنا ، NuCLаD أو محدد مواقع الاتصالات النووية في 3D).
    ملاحظة: وقد وضعت أداة NuCLεD من أجل تحليل تلقائيا 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك في خلية مضان صورة z-مداخن. NuCLεD يعيد بناء النوى من أكوام صورة الخلية في 3D وكذلك يكتشف وتوطين البقع 3D الفلورسنت. وهو يقيس تحديد المواقع النسبية للبقع في النواة (على سبيل المثال، المسافة من مركز النوى و / أو محيط النوى) والحد الأقصى لنصف قطر لكل نواة ومسافات بين البقع. يتم وصف الأداة والخوارزمية المستخدمة بالكامل في Cortesi et al.16.
  3. تحليل البيانات (على سبيل المثال، المسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد وترددات الوسط النووي وترددات الاتصال) التي يتم استردادها بواسطة NuCLεD.
    ملاحظة: بالنسبة للمسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد والمركزية النووية، يمكنك تطبيع المسافات على الحد الأقصى لنصف قطر كل نواة وتمثل هذه البيانات كتوزيعات ترددية للمسافات العادية من السنت رويد النووي. بالنسبة لدراسات التفاعلات بعيدة المدى، من المفترض أن تكون ترددات الاتصال في حدود 10-20%21 مع عتبة بين المسافة يمكن أن تختلف ويمكن وضعها حول 2 ميكرومتر35.
    1. لإجراء التحليل الإحصائي، تحليل ما يقرب من 100 نواة لكل تكرار البيولوجية. تمثل المسافات ثلاثية الأبعاد بين موضع الجينوم المحدد كتوزيعات تردد تراكمية للمسافات التي تقع تحت العتبة بين المسافات المحددة وتستخدم اختبار tلتقييم أهمية الاختلافات في التوزيعات. أيضا، حساب النسبة المئوية للنواة إيجابية للتفاعلات التي هي تحت عتبة بين المسافة المحددة، واستخدام اختبار فيشر الدقيق لتقييم أهمية الاختلافات في النسب المئوية.

النتائج

طريقة 3D متعدد الألوان الحمض النووي الأسماك المذكورة في هذه المقالة يسمح التصور المعاصر للloci الجينوم مختلفة داخل النوى 3D المحفوظة(الشكل 1B). يسمح هذا البروتوكول بقياس المسافات بين الأليس، ومختلف المواقع الجينومية من أجل تقييم قربها المكاني، وتقييم موقعها داخل الف...

Discussion

تصف الطريقة الحالية بروتوكولًا خطوة بخطوة لتنفيذ الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان FISH على مجموعة واسعة من الخلايا الأساسية البشرية. على الرغم من أن الحمض النووي FISH هو تقنية في الاستخدام الواسع ، فإن الحمض النووي ثلاثي الأبعاد FISH على النوى ثلاثية الأبعاد المحفوظة لا يزال من الصعب ا...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالمساعدة التقنية التي يقدمها مرفق التصوير INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM)، ميلانو، إيطاليا)، ولا سيما C. Cordiglieri، للحصول على المساعدة خلال صور الحمض النووي ثلاثي الأبعاد متعدد الألوان اقتناء. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية إلى B.B.: برنامج EPIGEN الإيطالي الرائد ، جمعية Française contre les Myopathies (AFM-Telethon ، منحة NR 18754) وجيوفاني رايسركاتوري ، وزارة الصحة الإيطالية (GR-2011-02349383). وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنحة التالية لF.M.: فوندازيون كاريبلو (باندو جيوفاني، منحة NR 2018-0321).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesThermo Fisher Scientific142475
6-well platesThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (bovine serum albumine)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testesSigmaD7656
Dextran sulfate (powder)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polymerase IThermo Fisher Scientific18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EthanolSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Formaldehyde solutionSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutammineThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulin HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline)SigmaP4417
Pennycillin/StreptavidinThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinBioradP6887
PhasePrep BAC DNA KitSigmaNA0100-1KT
Poly-L-lysine solutionSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo KitThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK210010
RNAse cocktailThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Tri-Sodium CitrateSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

References

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 3D 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved