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Neste Artigo

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Resumo

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Resumo

Uma questão importante na biologia celular é a organização genômica dentro do espaço nuclear e como a arquitetura da cromatina pode influenciar processos como expressão genética, identidade celular e diferenciação. Muitas abordagens desenvolvidas para estudar a arquitetura 3D do genoma podem ser divididas em duas categorias complementares: tecnologias baseadas em captura de conformação cromossa (C-technologies) e imagem. Enquanto o primeiro é baseado na captura da conformação cromossomo e interações de DNA proximal em uma população de células fixas, este último, baseado na fluorescência de DNA na hibridização situ (FISH) em núcleos preservados em 3D, permite a visualização contemporânea de loci múltiplo em um único nível celular (multicolor), examinando suas interações e distribuição dentro do núcleo (3D multicolor DNA FISH). A técnica do DNA 3D multicolor FISH tem uma limitação de visualizar apenas alguns loci pré-determinados, não permitindo uma análise abrangente da arquitetura nuclear. No entanto, dada a robustez de seus resultados, o DNA FISH multicolorido 3D em combinação com microscopia 3D e reconstrução de imagens é um método possível para validar resultados baseados em tecnologia C e estudar inequivocamente a posição e organização de loci específico em um único nível celular. Aqui, propomos um método passo a passo de Peixe sna multicolorido 3D adequado para uma ampla gama de células primárias humanas e discutimos todas as ações práticas, passos cruciais, noções de imagem 3D e análise de dados necessárias para obter uma multicolor 3D bem sucedida e informativa Peixe de DNA em diferentes contextos biológicos.

Introdução

Os eucalitos mais altos precisam condensar sistematicamente e compactar uma enorme quantidade de informações genéticas no espaço 3D do núcleo1,2,3,4. Hoje, sabemos que o genoma é espacialmente encomendado em compartimentos e domínios topologicamente associados5 e que os múltiplos níveis de dobramento de DNA geram contatos entre diferentes regiões genômicas que podem envolver a formação de loop de cromromatina6,7. O looping dinâmico 3D da cromromatina pode influenciar muitos processos biológicos diferentes, como transcrição8,9, diferenciação e desenvolvimento10,11, reparação de DNA12,13, enquanto suas perturbações estão envolvidas em várias doenças14,15,16 e defeitos de desenvolvimento15,17,18.

Muitas abordagens foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma 3D. Tecnologias baseadas em conformação cromossa (c-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivados) foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma em células fixas3,4,19,20. Tais abordagens baseiam-se na capacidade de capturar as frequências de contato entre loci genômico na proximidade física. C-tecnologias, dependendo de sua complexidade, capturam a organização global do genoma 3D e a topologia nuclear de uma população celular3,4,19,20. No entanto, as interações 3D são dinâmicas no tempo e no espaço, altamente variáveis entre células individuais que consistem em interações multiplex, e são extensivamente heterogênitas21,22.

Fluorescência de DNA multicolor 3D na hibridização situ (FISH) é uma técnica que permite a visualização de loci genômico específico em um único nível celular, permitindo a investigação direta da arquitetura nuclear 3D de forma complementar às tecnologias C. Representa uma tecnologia atualmente usada para validar inequivocamente os resultados C. O DNA FISH 3D multicolor usa sondas com rótulo fluorescente complementares aos loci genômicos de interesses. O uso de diferentes fluoroforóres e equipamentos adequados de microscopia permitem a visualização contemporânea de múltiplos alvos dentro do espaço nuclear23,24. Nos últimos anos, o FISH tem sido combinado com os avanços tecnológicos na microscopia para obter a visualização de estruturas em escala fina em alta resolução25,26 ou com abordagens CRISPR-Cas para a visualização dos ácidos nucleicos em imagens vivas27,28. Apesar da ampla adoção, a abordagem 3D multicolor DNA FISH ainda é considerada difícil em muitos laboratórios porque o material biológico utilizado deve ser adaptado.

Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para peixes de DNA multicoloridos 3D (da preparação celular/sonda à análise de dados) aplicável a uma ampla gama de células primárias humanas, permitindo a visualização de múltiplos loci genômicos e preservando a estrutura 3D de núcleos. Para estudar a arquitetura nuclear, a estrutura 3D dos núcleos deve ser preservada. Por essa razão, contrastando com outros protocolos existentes29,30,31, evitamos o uso de um gradiente de álcool e o armazenamento dos comprovantes de cobertura no álcool que podem afetar a estrutura de cromatina32. O método é adaptado a partir de protocolos de Peixe sna 3D preservados24,33 a serem aplicados a uma ampla gama de células primárias humanas, tanto ex vivo isoladas quanto cultizadas in vitro. Existem parâmetros de permeabilização e desproteína para diferentes características citológicas e citológicas nucleares (por exemplo, diferentes graus de compactação nuclear, abundância de citoesqueleto)34. Esses parâmetros são geralmente descritos em outros protocolos24,33, sem fornecer uma clara discriminação do procedimento dentro de diferentes tipos de células. Além disso, desenvolvemos uma ferramenta específica chamada NuCLεD (localizador de contatos nucleares em 3D)16, fornecendo princípios para análise de dados que melhorarão a proximidade 3D entre diferentes loci e sua distribuição topológica nuclear dentro do espaço nuclear de forma automatizada.

Protocolo

1. Procedimentos de preparação e rotulagem de sondas de DNA com tradução de nick

  1. Cromossomos artificiais bacterianos purificados e limpos (BACs), plasmídeos ou produtos PCR com kits específicos (Tabela de Materiais),resuspendem no ddH2O, verifiquem por eletroforese em gel de agarose e quantificar.
  2. Realize a tradução de nick em 1,5-2 μg de DNA a partir da etapa 1.1 em um volume final de 50 μL misturando todos os reagentes em um tubo de DNA de baixa ligação de 0,5 mL de acordo com a Tabela 1.
    NOTA: Sondas diretamente rotuladas podem melhorar a relação sinal/ruído. Kits para produzir sondas indiretas e diretamente rotuladas com vários fluorocromáticos Alexa por tradução de nick estão disponíveis comercialmente.
  3. Incubar a mistura de tradução nick em uma batedeira térmica a 16 °C por um tempo, dependendo do comprimento do material de DNA inicial: 45 min para produtos PCR (um pool de produtos PCR de 2.000 bp cada) e até 4 h para DNA BAC e plasmídeos.
  4. Verifique o tamanho das sondas produzidas na etapa 1.3 por eletroforrose em um gel de agarose de 2,2%.
    NOTA: O tamanho ideal da sonda é <200 bp(Figura 1A).
    1. Se o DNA não for digerido o suficiente, adicione 5 U de DNA polymerase I e 0,05 U de DNase I à reação e incubar por 1-2 h a 16 °C e posteriormente re-verificar. Pare a reação com 0,5 mM EDTA (concentração final). Armazene sondas a -20 °C.
  5. Para cada experimento de DNA FISH, precipitar as seguintes quantidades de sondas dependendo do material de DNA inicial do qual as sondas são produzidas: 200 ng de produtos PCR traduzidos por Nick, 100 ng de BACs traduzidos por Nick, ou 300 ng de nick traduzido plasmid. Adicione ddH2O até 150 μL, 20 μg de DNA de esperma torça de salmão não rotulado, 3,5 μg de DNA Cot-1 específico de espécies, 3 volumes de 100% EtOH e 1/10 volume de 3 M de acetato de sódio pH 5.2. Precipitar a -80 °C por 1h.
  6. Centrífuga em velocidade máxima por 1 h a 4 °C e descarte o supernatante. Lave a pelota duas vezes com 70% de EtOH.
  7. Resuspender a pelota em 2 μL de 100% de pH 7.0, tremer a 40 °C por 30 min (pode levar até algumas horas) e, em seguida, adicionar um volume igual de citrato salina-sódio 4x (SSC)/20% dextran sulfato.
    1. Prepare 20x SSC misturando 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio em um volume final de 1 L de H2O. Autoclave, filtrar e preparar alíquotas.
      NOTA: Para peixes de DNA multicoloridos, as diferentes sondas podem ser precipitadas juntas, exceto para sondas que podem anrneá-los uns com os outros. Nestes casos específicos, trate-os separadamente, precipitar e resuspender as sondas que dividem os reagentes mencionados nas etapas 1.5-1,7 em relação ao número de sondas. Pool as sondas somente após a resuspensão em formamide. Se forem utilizadas tampas de vidro superiores a 10 mm ou menos de 10 mm, dimensione para cima/para baixo o volume dos reagentes utilizados nos passos 1,5-1,7 proporcionalmente ao tamanho do slide. As sondas de hibridização podem ser armazenadas a -20 °C por um longo período de tempo (até dois meses).

2. Fixação celular, pré-tratamento e permeabilização

NOTA: As passagens de permeabilização e desproteína são passos cruciais. O tempo de reação e concentração dos reagentes dependem fortemente do tipo celular, da abundância de citoplasma e da morfologia nuclear.

  1. Fixação celular, pré-tratamento e permeabilização para linfócitos t primários humanos
    NOTA: Este protocolo é adequado para pequenas células, com pequenos núcleos e uma baixa quantidade de citoplasma.
    1. Use tampas de vidro (10 mm, espessura nº 1,5H).
    2. Lave o vidro com ddH2O, depois com 70% de EtOH e deixe-os secar. Use um copo para cada poço de uma placa de 24 poços.
    3. Adicione 200 μL de 0,1% poli-L-lysine (w/v) (Tabela de Materiais) diretamente no vidro para formar uma gota. Preste atenção, pois a gota deve permanecer na superfície do vidro sem tocar no poço por 2-5 min. Deixe de fora a queda cuidadosamente, e deixe o vidro secar por 30 min.
    4. Faça a etapa 2.1.3 duas vezes mais.
    5. Coloque 200 μL de células de suspensão (2 x 106/mL, suspensão PBS de linfócitos ex vivo primárioT) diretamente no vidro, permita que as células semarem à temperatura ambiente (RT) por 30 min.
    6. Remova rapidamente a queda. Adicione recém-feito 4% PFA (preparado na PBS/0,1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrado) por 10 min e fixar as células semeadas na RT.
    7. Lave três vezes por 5 min cada com 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) na RT. Permeabilize com 0,5% TPBS por 10 min na RT.
    8. Realizar o tratamento RNase adicionando 2,5 μL de coquetel RNase (Tabela de Materiais) em 250 μL de PBS/bem em uma placa de 24 poços por 1 h a 37 °C.
    9. Enxágüe na PBS, adicione 20% de glicerol/PBS e incuba durante a noite (ON) a 4°C.
      NOTA: Este passo pode variar de 1h a ON. Os slides podem ser mantidos em 20% glicerol/PBS a 4 °C até 7 dias.
    10. Congele no gelo seco (15-30 s), descongele gradualmente na RT e mergulhe em 20% glicerol/PBS. Repita o passo 2.1.9 mais três vezes.
    11. Lave em 0,5% TPBS por 5 min na RT. Wash em 0,05% TPBS, duas vezes por 5 min na RT. Incubar em 0,1 N HCl por 12 min na RT. Rinse em 2x SSC.
    12. Incubar em 50% de pH 7.0/2x SSC ON na RT.
      NOTA: O tempo de incubação pode ser otimizado e eventualmente reduzido. Os slides podem ser mantidos em 50% de formamide/2x SSC por vários dias.
  2. Fixação celular, pré-tratamento e permeabilização para mioblastos primários humanos
    NOTA: Este protocolo é adequado para células grandes, com uma alta quantidade de citoplasma.
    1. Cultivar mioblastos primários humanos diretamente nos óculos de deslizamento de cobertura em placas de 24 poços em meio de crescimento (o meio eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 20% de soro bovino fetal (FBS), fator de crescimento do fibroblasto de 25 ng/mL (FGF), fator de crescimento epidérmico de 10 ng/mL (EGF), 10 μg/mL insulina humana, 1x glutamina, 1x penicilina/estreptomia) por pelo menos 24 h (atingindo 50-70% de confluência).
      NOTA: Para facilitar a adesão, gelatina ou colágeno ou poli-l-lysina pode ser usado para cobrir o deslizamento de cobertura antes da semente.
    2. As células de enxágüe em 2-3 alterações de PBS. Adicione recém-feito 4% pfa e fixe as células por 10 min na RT.
    3. Lave três vezes por 3 min cada em 0,01% TPBS na RT. Permeabilize em 0,5% TPBS por 10 min na RT.
    4. Realizar o tratamento RNase adicionando 2,5 μL de coquetel RNase (Tabela de Materiais) em 250 μL de PBS/bem em uma placa de 24 poços por 1 h a 37 °C.
    5. Enxágüe na PBS, adicione 20% de glicerol/PBS e incuba na RT.
      NOTA: Este passo pode variar de 1h a ON. Os slides podem ser mantidos em 20% glicerol/PBS a 4 °C até 7 dias.
    6. Congele no gelo seco (15-30 s), descongele gradualmente na RT e mergulhe em 20% glicerol/PBS. Repita esta etapa três vezes.
    7. Lave três vezes por 10 min cada em PBS. Incubar em 0,1 N HCl por 5 min na RT. Rinse em 2x SSC.
    8. Incubar em 50% de pH 7.0/2x SSC ON na RT.
      NOTA: O tempo de incubação pode ser otimizado e eventualmente reduzido. Os slides podem ser mantidos em 50% de formamide/2x SSC por vários dias.
    9. Deslizamentos de equilíbrio (mantidos em 50% de formamide/2x SSC) em 2x SSC por 2 min. Em seguida, equilibre na PBS por 3 min.
    10. Trate com 0,01 N HCl/0,0025% pepsin a partir de alguns segundos até 5 minutos, dependendo do tipo celular. Durante esta etapa, observe as células um microscópio óptico e pare a reação (passo 2.2.11) assim que os núcleos estiverem livres do citoplasma, mantendo sua estrutura intacta (por exemplo, o nucleoli ainda está visível e intacto).
    11. Inative a pepsina lavando duas vezes por 5min cada em 50 mM MgCl 2/PBS.
    12. Pós-fixação em 1% PFA/PBS por 1 min. Lave por 5 min na PBS. Lave duas vezes por 5 min cada em 2x SSC, e depois adicione 50% de formamide/2x SSC por pelo menos 30 min.

3. Hibrid de DNA 3D

  1. Desnatura as sondas a 80 °C por 5 min, e depois coloque rapidamente no gelo.
  2. Carregue as sondas de hibridização em um slide de microscópio limpo. Gire o deslizamento de cobertura com células de cabeça para baixo na queda de sondas de hibridização.
  3. Selar o deslizamento de cobertura com cimento de borracha. Deixe o cimento de borracha secar completamente. Em seguida, coloque slides em um bloco de aquecimento e desnatureza a 75 °C por 4 min.
    NOTA: O tempo de desnaturação e temperatura de desnaturação podem ser aumentados, até 80 °C.
  4. Hibridize a 37 °C ON em uma caixa metálica flutuando em um banho de água.
    NOTA: Para melhorar a relação sinal/ruído, a temperatura da hibridização pode subir para 42 °C.
  5. Retire o cimento de borracha, mergulhe os slides em 2x SCC, retire o deslizamento de cobertura de vidro e transfira-o para 2x SSC em placa de 6 poços.
  6. Lave em 2x SSC três vezes por 5 min cada a 37 °C, tremendo a 90 rpm em um agitador de incubadora. Lave em 0,1x SSC três vezes por 5 min cada a 60 °C, tremendo a 90 rpm em um agitador de incubadora. Enxágüe brevemente em 4x SSC/0,2% TWEEN 20.

4. Detecção de PEIXE sna de DNA multicolorido 3D

NOTA: Para sondas diretamente rotuladas, pule as etapas 4.1 e 4.2.

  1. Bloqueie em 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% de albumina de soro bovino (BSA) por 20 min a 37 °C em uma placa de 24 poços, tremendo a 20 rpm em um shaker incubadora.
  2. Incubar com a concentração adequada de anti-digoxygenin (1:150), e/ou streptavidin (1:1.000) (Tabela de Materiais) diluída em 4x SSC/0,2% TWEEN 20/4% BSA por 35 min em uma câmara escura e úmida a 37 °C.
  3. Lave em 4x SSC/0,2% TWEEN 20 três vezes por 5 min cada a 37 °C, tremendo a 90 rpm em uma placa de 6 poços em um shaker incubadora.
  4. Equilibre-se na PBS e pós-fixação em 2% formaldeído/PBS por 2 min na RT em uma placa de 24 poços.
    NOTA: Sondas diretamente rotuladas não precisam de pós-fixação.
  5. Lave 5x brevemente na PBS. Mancha com 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS por 5 min na RT.
  6. Lave 5x brevemente na PBS. Montar com solução antifumada (Tabela de Materiais).

5. Microscopia e análise de Peixe sna multicolorido 3D

  1. Adquirir imagens 3D com um sistema de microscópio.
    NOTA: Aqui, um microscópio widefield com uma distância axial de 0,2-0,25 μm entre seções consecutivas(Figura 1B) é usado.
  2. Analise pilhas de imagens 3D usando diferentes softwares e ferramentas (aqui, NuCLεD ou Localizador de Contatos Nucleares em 3D).
    NOTA: A ferramenta NuCLεD foi desenvolvida para analisar automaticamente o DNA de DNA 3D em pilhas de imagem celular de fluorescência. O NuCLεD reconstrói os núcleos das pilhas de imagem celular em 3D, bem como detecta e localiza manchas 3D fluorescentes. Mede o posicionamento relativo das manchas no núcleo (por exemplo, distância do centroide dos núcleos e/ou periferia dos núcleos) e o raio máximo para cada núcleo e distâncias intermanchas. A ferramenta e o algoritmo utilizado são totalmente descritos em Cortesi et al.16.
  3. Analise os dados (por exemplo, distâncias 3D entre loci genômico especificado e as frequências nucleares e de contato) recuperadas pelo NuCLεD.
    NOTA: Para distâncias 3D entre loci genômico especificado e o centroide nuclear, normalize distâncias no raio máximo para cada núcleo e represente esses dados como distribuições de frequência de distâncias normalizadas do centroide nuclear. Para estudos de interações de longo alcance, as frequências de contato devem estar na faixa de 10-20%21 com um limiar inter-distância que pode variar e pode ser colocada em torno de 2 μm35.
    1. Para realizar análiseestatística, analise aproximadamente 100 núcleos por replicação biológica. Represente distâncias 3D entre loci genômico especificado como distribuições de frequência cumulativa de distâncias que estão abaixo do limiar inter-distância selecionada e usam um teste tpara avaliar a significância das diferenças nas distribuições. Além disso, calcule o percentual de núcleos positivos para as interações que estão abaixo do limiar inter-distância selecionado, e use o teste exato de Fisher para avaliar a significância das diferenças nos percentuais.

Resultados

O método de DNA 3D multicolorido FISH descrito neste artigo permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados (Figura 1B). Este protocolo permite a medição de distâncias entre alelos, e diferentes loci genômicos para avaliar sua proximidade espacial, e avaliar sua localização dentro do espaço nuclear (por exemplo, a distância loci do centroide ou da periferia dos núcleos)16. No entanto, e...

Discussão

O método atual descreve um protocolo passo a passo para executar peixes de DNA multicoloridos 3D em uma ampla gama de células primárias humanas. Embora o DNA FISH seja uma tecnologia em grande uso, o Peixe de DNA multicolorido 3D em núcleos interfásicos 3D preservados ainda é difícil de executar em muitos laboratórios, principalmente devido às características das amostras utilizadas23,24.

A tradução de nick de sonda é um p...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem a assistência técnica do INM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milão, Itália), em particular C. Cordiglieri, para assistência durante imagens 3D multicolor DNA FISH Aquisição. Este trabalho tem sido apoiado pelas seguintes subvenções ao B.B.: Programa principal italiano epigen, Associação Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e Giovani Ricercatori, Ministério da Saúde italiano (GR-2011-02349383). Este trabalho tem sido apoiado pela seguinte concessão ao F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, bolsa nR 2018-0321).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesThermo Fisher Scientific142475
6-well platesThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (bovine serum albumine)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testesSigmaD7656
Dextran sulfate (powder)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polymerase IThermo Fisher Scientific18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EthanolSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Formaldehyde solutionSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutammineThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulin HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline)SigmaP4417
Pennycillin/StreptavidinThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinBioradP6887
PhasePrep BAC DNA KitSigmaNA0100-1KT
Poly-L-lysine solutionSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo KitThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK210010
RNAse cocktailThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Tri-Sodium CitrateSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

Referências

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