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要約

3DマルチカラーDNA FISHは、3D保存核内の複数のゲノム軌跡を視覚化するツールを表し、核空間内での相互相互作用と局在性を単一の細胞レベルで明確に定義します。ここで、ヒト一次細胞の広いスペクトルについて段階的にプロトコルをステップごとに説明する。

要約

細胞生物学における大きな問題は、核空間内のゲノム組織と、クロマチンアーキテクチャが遺伝子発現、細胞同一性、分化などのプロセスにどのような影響を与えるかです。ゲノムの3Dアーキテクチャを研究するために開発された多くのアプローチは、染色体立体構造キャプチャベースの技術(C技術)とイメージングの2つの相補的なカテゴリーに分けることができます。前者は固定細胞集団における染色体立体構造と近位DNA相互作用を捉えるが、後者は3D保存核上のその場ハイブリダイゼーション(FISH)におけるDNA蛍光に基づいて、現代的な視覚化を可能にする単一の細胞レベル(多色)で複数の遺伝子座を有し、核内での相互作用と分布を調べる(3D多色DNA FISH)。3D多色DNA FISHの技術は、少数の所定の座位座のみを可視化するという制限があり、核アーキテクチャの包括的な分析を許さない。しかし、その結果の堅牢性を考えると、3D多色DNA FISHと3D顕微鏡と画像再構成を組み合わせて、C技術ベースの結果を検証し、特定の遺伝子座の位置と組織を明確に研究する方法です。1 つのセル レベルで。ここでは、幅広いヒト初等細胞に適した3D多色DNA FISHのステップバイステップ方式を提案し、成功した有益な3Dマルチカラーを得るために必要なすべての実用的な行動、重要なステップ、3Dイメージングの概念、およびデータ分析について議論するDNA FISH 異なる生物学的文脈の中で.

概要

高い真核生物は、核1、2、3、4の分の3D空間で、膨大な量の遺伝情報を体系的に凝縮し、コンパクト化する必要があります。今日、我々は、ゲノムが区画およびトポロジー関連ドメイン5において空間的に秩序化され、DNAフォールディングの複数のレベルがクロマチンループ形成6、7を伴う可能性のある異なるゲノム領域間の接触を生成することを知っている。クロマチンの3D動的ループは、転写8、9、分化および現像10、11、DNA修復12、13、その摂動が様々な疾患14、15、16および発達欠陥15、17、18に関与している間、多くの異なる生物学的プロセスに影響を及ぼし得る。

3Dゲノム組織を研究するために多くのアプローチが開発されています。染色体コンフォメーションキャプチャベースの技術(C技術、3C、4C、5C、Hi-Cおよび誘導体)は、固定細胞3、4、19、20のゲノム組織を研究するために開発された。このようなアプローチは、物理的近接でゲノム遺伝子座間の接触周波数を捕捉する能力に基づいている。C-技術は、その複雑さに応じて、細胞集団3、4、19、20のグローバル3Dゲノム組織と核トポロジーをキャッチします。それにもかかわらず、3D相互作用は時間および空間において動的であり、多重相互作用からなる個々の細胞間で高度に可変であり、かつ広範囲に異種21、22である。

3D多色DNA蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)は、特定のゲノム軌跡を単一細胞レベルで可視化し、C技術に対して3D核アーキテクチャを補完的に直接調査することを可能にする技術です。これは、C-結果を明確に検証するために現在使用されている技術を表します。3DマルチカラーDNA FISHは、興味のゲノム遺伝子座に相補的な蛍光標識プローブを使用しています。異なる蛍光発光器および適切な顕微鏡装置の使用は核空間23、24内の複数のターゲットの現代的な視覚化を可能にする。近年、FISHは、マイクロスコピーの技術進歩と組み合わされ、高解像度25、26、またはCRISPR-Cas法による微細スケール構造の可視化を得て、ライブイメージング27,28で核酸の可視化を行っている。広く採用されているにもかかわらず、3D多色DNA FISHアプローチは、使用される生物学的材料を適応しなければならないため、多くの研究室では依然として困難であると考えられている。

ここでは、幅広いヒト一次細胞に適用できる3D多色DNA FISH(細胞/プローブ調製からデータ解析まで)の包括的なプロトコルを提供し、多重ゲノム軌跡の可視化を可能にし、核の3D構造を維持します。核建築を研究するためには、核の3D構造を維持しなければならない。このため、他の既存のプロトコル29、30、31とは対照的に、クロマチン構造32に影響を与えるアルコールのアルコール勾配およびカバースリップの貯蔵の使用を避ける。この方法は、保存された3D DNA FISHプロトコル24、33から、広範囲のヒト一次細胞に適用されるように適合され、両方とも単離されたエクスビボまたはインビトロで培養される。異なる核形態および細胞学的特性に対する透過性および脱蛋白パラメータ(例えば、異なる核圧縮度、細胞骨格量)34がある。これらのパラメータは、一般に、異なる細胞型内での手順の明確な識別を提供することなく、他のプロトコル24、33で説明される。さらに、核空間内の異なる軌跡とその核トポロジー分布の3D近接性を自動で改善するデータ解析の原理を提供する、NuCLεD(3Dにおける核接触ロケータ)16という特定のツールを開発しました。

プロトコル

ニック翻訳によるDNAプローブ調製とラベリング手順

  1. 細菌人工染色体(BAC)、プラスミドまたはPCR製品を特定のキット(材料表)で精製し、精製し、アガロースゲル上の電気泳動でチェックし、定量します。
  2. 表1に従って0.5 mLの低結合DNAチューブに全ての試薬を混合することにより、ステップ1.1から50μLの最終体積で1.5-2μgのDNAにニック翻訳を行う。
    注:直接ラベル付けされたプローブは、信号対ノイズ比を改善することができます。ニック翻訳により様々なAlexaフルオロクロムを用いて間接的および直接的に標識されたプローブを製造するキットが市販されています。
  3. ニック翻訳ミックスを、開始DNA材料の長さによって一定時間、16°Cのサーマルミキサーにインキュベートします:PCR産物(それぞれ2,000 bpのPCR産物のプール)とBAC DNAおよびプラスミドの場合は最大4時間。
  4. 2.2%のアガロースゲルで電気泳動により、ステップ1.3で生成されたプローブのサイズを確認します。
    注 : 最適なプローブ サイズは <200 bp です (図 1A)。
    1. DNAが十分に消化されない場合は、5 UのDNAポリメラーゼIと0.05 UのDNase Iを反応に加え、16°Cで1〜2時間インキュベートし、その後再チェックします。0.5 mM EDTA(最終濃度)で反応を停止します。プローブは-20°Cに保存してください。
  5. 各DNA FISH実験について、プローブが生成される開始DNA材料に応じて、ニック翻訳されたPCR産物から200ng、ニック翻訳BACsから100ng、ニック翻訳プラスミドから300ngのプローブ量を沈殿させます。ddH2Oを最大150μL、20μgの無ラベルサーモン精子DNA、3.5μgの種特異的Cot-1 DNA、3体積の100%EtOH、および3 M酢酸ナトリウムpH 5.2の1/10容積を加える。1時間の-80°Cで沈殿する。
  6. 4°Cで1時間の最高速度で遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを70%EtOHで2回洗浄します。
  7. ペレットを100%フォルムアミドpH 7.0の2μLで再懸濁し、40°Cで30分間(数時間かかることがあります)、4倍の生理食塩水ナトリウム(SSC)/20%デキストラン硫酸塩を加えます。
    1. 20x SSCを175.3gのNaClと88.2gのクエン酸ナトリウムを1Lの最終体積のH2O.オートクレーブで混合し、フィルターを適用し、アリコートを準備します。
      注:多色DNA FISHの場合、互いにアニールできるプローブを除いて、異なるプローブを一緒に沈殿させることができます。これらの特定のケースでは、それらを別々に処理し、プローブの数に関してステップ1.5-1.7で述べた試薬を分割してプローブを沈殿させ、再懸濁します。フォルメミドで再懸濁した後にのみプローブをプールします。ガラスのカバースリップが 10 mm または 10 mm 未満を使用する場合は、スライドサイズに比例してステップ 1.5-1.7 で使用する試薬の体積を拡大/縮小します。ハイブリダイゼーションプローブは、-20°Cで長期間(最大2ヶ月間)保存できます。

2. 細胞固定、前処理、透過

注:浸透と脱タンパク質化の通路は重要なステップです。試薬の反応時間と濃度は、細胞型、細胞質の豊富さ、核形態に大きく依存します。

  1. ヒト原発性Tリンパ球の細胞固定、前処理および透過性
    注:このプロトコルは小さな細胞に適しており、小さな核と細胞質の量が少ない。
    1. ガラスのカバースリップ(10mm、厚さ1.5H)を使用してください。
    2. ddH2Oでガラスを洗い、70%のEtOHで洗い、乾燥させます。24ウェルプレートの各ウェルにグラスを1枚使用します。
    3. 200 μL の 0.1% ポリ L-リジン (w/v) (材料の表) をガラスに直接加えて、ドロップを形成します。2-5分間井戸に触れずにガラス表面に落ちない状態に注意してください。
    4. ステップ2.1.3をさらに2回実行します。
    5. 200 μLの懸濁液細胞(2 x106/mL、エキセビボ原発性Tリンパ球のPBS懸濁液)をガラス上に直接入れ、細胞を室温(RT)で30分間播種させる。
    6. ドロップを素早く削除します。作りたての4%PFA(PBS/0.1%TWEEN 20、pH 7.0、フィルター処理で調製)を10分間添加し、RTで播種細胞を固定します。
    7. RTで0.05%トリトンX-100/PBS(TPBS)でそれぞれ5分間3回洗浄します。
    8. 2.5 μLのRNaseカクテル(材料表)を250μLのPBS/ウェルに加えて、24ウェルプレートで37°Cで1時間処理します。
    9. PBSでリンスし、グリセロール/PBSを20%添加し、4°Cで一晩(ON)インキュベートします。
      注: このステップの範囲は 1 時間から ON です。スライドは、最大7日間4°Cで20%グリセロール/PBSに保つことができます。
    10. ドライアイス(15-30s)で凍結し、RTで徐々に解凍し、20%のグリセロール/PBSに浸します。手順 2.1.9 をもう 3 回繰り返します。
    11. RTで0.5%TPBSで0.5%TPBSを0.05%TPBSで洗浄し、RTで5分間5分間、RT.1 N HClで0.1 N HClで2x SSCで12分間洗浄します。
    12. RTで50%ホルムアミドpH 7.0/2x SSC ONでインキュベート。
      注:インキュベーション時間は最適化され、最終的に短縮できます。スライドは、50%のホルムアミド/2x SSCで数日間保持することができます。
  2. ヒト原発性筋芽細胞の細胞固定、前治療および透過性
    注:このプロトコルは、細胞質の量が多い大きな細胞に適しています。
    1. 成長培地(Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)、20%ウシ胎児血清(FBS)、25ng/mL線維芽細胞増殖因子(FGF)、10 ng/mL表皮成長因子(EGF)、10 μg/mLヒトインスリンのカバースリップガラス上でヒト原発性筋芽球を直接成長させる 1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン)少なくとも24時間(合流の50〜70%に達する)。
      注:接着を容易にするために、ゼラチンまたはコラーゲンまたはポリL-リジンを使用して、播種前にカバースリップをコーティングすることができます。
    2. PBSの2-3変化で細胞をすすいでください。作りたての4%のPFAを加え、RTで10分間細胞を固定します。
    3. RTで0.01%TPBSでそれぞれ3分間3回洗浄します。
    4. 2.5 μLのRNaseカクテル(材料表)を250μLのPBS/ウェルに加えて、24ウェルプレートで37°Cで1時間処理します。
    5. PBSでリンスし、グリセロール/PBSを20%添加し、RTでオンにインキュベートします。
      注: このステップの範囲は 1 時間から ON です。スライドは、最大7日間4°Cで20%グリセロール/PBSに保つことができます。
    6. ドライアイス(15-30s)で凍結し、RTで徐々に解凍し、20%のグリセロール/PBSに浸します。この手順を 3 回繰り返します。
    7. PBSでそれぞれ10分間3回洗います。2x SSCのRT.リンスで5分間0.1 N HClでインキュベートします。
    8. RTで50%ホルムアミドpH 7.0/2x SSC ONでインキュベート。
      注:インキュベーションの時間を最適化し、最終的に短縮することができます。スライドは、50%のホルムアミド/2x SSCで数日間保持することができます。
    9. 2分間の2x SSCで平衡スライド(50%ホルムアミド/2x SSCに保持)次いで、PBSで3分間平衡化する。
    10. 細胞タイプに応じて、数秒から5分までの0.01 N HCl/0.0025%ペプシンで治療してください。このステップでは、光学顕微鏡下で細胞を観察し、核が細胞質から解放されるとすぐに反応を停止します(例えば、核オリは依然として目に見え、そのまま残されています)。
    11. 50 mM MgCl2/PBSでそれぞれ5分間2回洗浄してペプシンを不活性化します。
    12. 1% PFA/PBS で 1 分間の後の修正. 1 分間 洗浄 5 分 PBS.2x SSCでそれぞれ5分間2回洗浄し、少なくとも30分間50%のホルムアミド/2x SSCを加えます。

3. 3DマルチカラーDNA FISHハイブリダイゼーション

  1. プローブを80°Cで5分間変性させ、すぐに氷の上に置きます。
  2. ハイブリダイゼーションプローブをクリーンな顕微鏡スライドにロードします。ハイブリダイゼーションプローブのドロップでセルを逆さまにしてカバースリップを回します。
  3. カバースリップをゴムセメントで密封します。ゴムセメントを完全に乾燥させます。次に、加熱ブロックの上にスライドを置き、4分間75°Cで変性します。
    注:変性のタイミングと変性温度は、80°Cまで、拡張することができます。
  4. 水槽に浮かぶ金属箱の中で37°C ONでハイブリダイズ。
    注:信号対雑音比を改善するために、ハイブリダイゼーション温度は42°Cまで上がることができます。
  5. ゴムセメントを剥がし、スライドを2x SCCに浸し、ガラスのカバースリップを取り除き、6ウェルプレートで2x SSCに移します。
  6. 2x SSCで3回37°Cで5分間、インキュベーターシェーカーで90rpmで振る。0.1x SSCで60°Cでそれぞれ5分間3回洗浄し、インキュベーターシェーカーで90rpmで振る。4x SSC/0.2%TWEEN 20で簡単にリンスしてください。

4. 3DマルチカラーDNA FISH検出

メモ: 直接ラベル付けされたプローブの場合は、手順 4.1 および 4.2 をスキップします。

  1. 4x SSC/0.2%TWEEN 20/4%ウシ血清アルブミン(BSA)で24ウェルプレートで37°Cで20分間ブロックし、インキュベーターシェーカーで20rpmで振る。
  2. 抗ジガニゲオキシゲチン(1:150)および/またはストレプトアビジン(1:1,000)(材料表)を4x SSC/0.2%TWEEN 20/4%BSAで37°Cの暗くて湿ったチャンバーで35分間希釈し、適切な濃度でインキュベートします。
  3. 4x SSC/0.2% TWEEN 20で37°Cでそれぞれ5分間3回洗浄し、インキュベーターシェーカーで6ウェルプレートで90rpmで振る。
  4. 24ウェルプレートでRTで2分間、2%ホルムアルデヒド/PBSでPBSを平衡化し、後修正します。
    注: 直接ラベル付けされたプローブは、後固定する必要はありません。
  5. PBSで5倍の洗浄を短時間行います。RTで5分間1 ng /mL DAPI(4,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)/PBSを備えた染色。
  6. PBSで5倍の洗浄を短時間行います。アンチフェード溶液(材料のテーブル)でマウントします。

5. 3DマルチカラーDNA FISH顕微鏡と分析

  1. 顕微鏡システムで3D画像を取得。
    注: ここでは、連続する断面間の軸方向の距離が 0.2~0.25 μm の広視野顕微鏡 (図 1B)が使用されます。
  2. さまざまなソフトウェアとツールを使用して3D画像スタックを解析します(ここでは、NuCLεDまたは3Dの核接触ロケータ)。
    注:NuCLεDツールは、蛍光細胞画像zスタックで3DマルチカラーDNA FISHを自動的に分析するために開発されました。NuCLεDは、細胞画像スタックから3Dで核を再構成し、蛍光3Dスポットを検出して局クトします。これは、核内のスポットの相対的な位置(例えば、核の重心および/または核の周囲からの距離)および各核およびスポット間距離の最大半径を測定する。ツールと使用されるアルゴリズムは、コルテシら16で完全に説明されています。
  3. NuCLεDによって取得されたデータ(例えば、指定されたゲノム軌跡と核心重心と接触周波数との間の3D距離)を分析します。
    注: 指定されたゲノム軌跡と核心心の間の 3D 距離の場合、各核の最大半径で距離を正規化し、これらのデータを核心重心からの正規化された距離の周波数分布として表します。長距離相互作用の研究では、接触周波数は10〜20%21の範囲にあり、距離間の閾値は変動し、2μm35前後で配置できる。
    1. 統計解析を行うために、生体複製あたり約100個の核を分析します。指定されたゲノム遺伝子座間の3D距離を、選択した閾値間距離以下の距離の累積周波数分布として表し、t-testを使用して分布の差異の有意性を評価します。また、選択した距離間の閾値を下回る相互作用に対する核陽性の割合を計算し、フィッシャーの正確な検定を使用してパーセンテージの差異の有意性を評価します。

結果

本稿で説明した3D多色DNA FISHの方法により、保存された3D核内の異なるゲノム軌跡を現代的に視覚化することができます(図1B)。このプロトコルは、対立遺伝子と、それらの空間的近接性を評価するために異なるゲノム遺伝子座との間の距離の測定を可能にし、かつ、核空間内の位置(例えば、心積心または核の周囲からの軌跡距離)16を評価す...

ディスカッション

現在の方法は、ヒト一次細胞の広い範囲で3D多色DNA FISHを実行するためのステップバイステッププロトコルを記述する。DNA FISHは広く使用されている技術ですが、保存された3Dの相間核上の3D多色DNA FISHは、主に23、24を使用するサンプルの特性のために、多くの研究室で行うことが困難です。

プローブニック翻訳は、成功した3Dマ...

開示事項

著者たちは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、3D多色DNA FISH画像の間の支援のために、INGMイメージング施設(イシティト・ナツィオナーレ・ディ・ジェネティスタ・モレコラレ「ロミオ・エド・エンリカ・インヴェルニッツィ」(INGM)、ミラノ、ミラノ、特にC.コルディグリエリの技術的支援を認める取得。この作品は、B.B.への助成金、EPIGENイタリアの旗艦プログラム、協会フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM-Telethon、助成金nr 18754)、イタリア保健省のジョヴァニ・リセルカトリ(GR-2011-02349383)に支えられてきました。この作品は、F.M.への以下の助成金によって支えられてきました:フォンダツィオーネ・カリプロ(バンド・ジョヴァーニ、グラントnr 2018-0321)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesThermo Fisher Scientific142475
6-well platesThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (bovine serum albumine)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testesSigmaD7656
Dextran sulfate (powder)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polymerase IThermo Fisher Scientific18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EthanolSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Formaldehyde solutionSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutammineThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulin HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline)SigmaP4417
Pennycillin/StreptavidinThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinBioradP6887
PhasePrep BAC DNA KitSigmaNA0100-1KT
Poly-L-lysine solutionSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo KitThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK210010
RNAse cocktailThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Tri-Sodium CitrateSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

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