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Résumé

3D multicolor DNA FISH représente un outil pour visualiser les loci génomiques multiples dans les noyaux préservés 3D, définissant sans ambiguïté leurs interactions réciproques et leur localisation dans l'espace nucléaire à un seul niveau cellulaire. Ici, un protocole étape par étape est décrit pour un large éventail de cellules primaires humaines.

Résumé

Une question majeure en biologie cellulaire est l'organisation génomique dans l'espace nucléaire et comment l'architecture de chromatine peut influencer des processus tels que l'expression des gènes, l'identité cellulaire et la différenciation. De nombreuses approches développées pour étudier l'architecture 3D du génome peuvent être divisées en deux catégories complémentaires : les technologies basées sur la conformation chromosomique (technologies C) et l'imagerie. Alors que le premier est basé sur la capture de la conformation chromosomique et des interactions d'ADN proximal dans une population de cellules fixes, le second, basé sur la fluorescence de l'ADN in situ hybridation (FISH) sur des noyaux conservés en 3D, permet la visualisation contemporaine de loci multiples à un seul niveau cellulaire (multicolor), examinant leurs interactions et leur distribution dans le noyau (3D MULTIcolor DNA FISH). La technique de l'ADN multicolore 3D FISH a une limitation de visualiser seulement quelques loci prédéterminés, ne permettant pas une analyse complète de l'architecture nucléaire. Cependant, compte tenu de la robustesse de ses résultats, 3D multicolor DNA FISH en combinaison avec la microscopie 3D et la reconstruction d'image est une méthode possible pour valider les résultats basés sur la technologie C et d'étudier sans ambiguïté la position et l'organisation de loci spécifiques au niveau d'une seule cellule. Ici, nous proposons une méthode étape par étape de 3D MULTIcolor DNA FISH adapté à un large éventail de cellules primaires humaines et discuter de toutes les actions pratiques, étapes cruciales, notions d'imagerie 3D et l'analyse des données nécessaires pour obtenir un succès et instructif 3D multicolore DNA FISH dans différents contextes biologiques.

Introduction

Les eucaryotes plus élevés doivent condenser et compacter systématiquement une énorme quantité d'informations génétiques dans l'espace 3D minute du noyau1,2,3,4. Aujourd'hui, nous savons que le génome est classé spatialement dans des compartiments et des domaines topologiquement associés5 et que les niveaux multiples de pliage de l'ADN génèrent des contacts entre différentes régions génomiques qui peuvent impliquer la formation de boucle de chromatine6,7. La boucle dynamique 3D de la chromatine peut influencer de nombreux processus biologiques différents tels que la transcription8,9, la différenciation et le développement10,11, réparation de l'ADN12,13, tandis que ses perturbations sont impliqués dans diverses maladies14,15,16 et les défauts de développement15,17,18.

De nombreuses approches ont été développées pour étudier l'organisation du génome 3D. Des technologies basées sur le capture de conformation de chromosome (C-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C et dérivés) ont été développées pour étudier l'organisation de génome dans les cellules fixes3,4,19,20. Ces approches sont basées sur la capacité de capturer les fréquences de contact entre les loci génomiques à proximité physique. C-technologies, en fonction de leur complexité, attraper l'organisation mondiale du génome 3D et la topologie nucléaire d'une population cellulaire3,4,19,20. Néanmoins, les interactions 3D sont dynamiques dans le temps et l'espace, très variables entre les cellules individuelles composées d'interactions multiplexes, et sont largement hétérogènes21,22.

L'hybridation 3D de fluorescence in situ de l'ADN multicolore (FISH) est une technique qui permet la visualisation de loci génomiques spécifiques à un seul niveau de cellule, permettant une étude directe de l'architecture nucléaire 3D d'une manière complémentaire aux technologies C. Il représente une technologie actuellement utilisée pour valider sans ambiguïté les résultats C. 3D multicolor DNA FISH utilise des sondes étiquetées fluorescentes complémentaires aux loci génomiques d'intérêts. L'utilisation de différents fluorophores et d'équipements de microscopie appropriés permet la visualisation contemporaine de cibles multiples dans l'espace nucléaire23,24. Ces dernières années, FISH a été combiné avec les progrès technologiques dans la microscopie pour obtenir la visualisation des structures à échelle fine à haute résolution25,26 ou avec des approches CRISPR-Cas pour la visualisation des acides nucléiques en imagerie en direct27,28. Malgré une large adoption, l'approche 3D multicolor DNA FISH est encore considérée comme difficile dans de nombreux laboratoires car le matériel biologique utilisé doit être adapté.

Ici, nous fournissons un protocole complet pour 3D multicolor DNA FISH (de la préparation cellulaire / sonde à l'analyse des données) applicable à un large éventail de cellules primaires humaines, permettant la visualisation de loci génomiques multiples et la préservation de la structure 3D des noyaux. Afin d'étudier l'architecture nucléaire, la structure 3D des noyaux doit être préservée. Pour cette raison, contrairement à d'autres protocoles existants29,30,31, nous évitons l'utilisation d'un gradient d'alcool et le stockage des couvertures dans l'alcool qui peut affecter la structure de chromatine32. La méthode est adaptée à partir de protocoles FISH d'ADN 3D conservés24,33 à appliquer à un large éventail de cellules primaires humaines, à la fois isolées ex vivo ou cultivées in vitro. Il existe des paramètres de perméabilisation et de déprotéinisation pour différentes morphologies nucléaires et caractéristiques cytologiques (p. ex., différents degrés de compactage nucléaire, abondance de cytosquelettes)34. Ces paramètres sont souvent généralement décrits dans d'autres protocoles24,33, sans fournir une discrimination claire de la procédure au sein de différents types de cellules. En outre, nous avons développé un outil spécifique nommé NuCLD (localisateur de contacts nucléaires en 3D)16, fournissant des principes pour l'analyse des données qui permettra d'améliorer la proximité 3D entre les différents loci et leur distribution topologique nucléaire dans l'espace nucléaire d'une manière automatisée.

Protocole

1. Procédures de préparation et d'étiquetage de la sonde d'ADN avec traduction de pseudo

  1. Purifiez et nettifiez les chromosomes artificiels bactériens (BAC), les plasmides ou les produits PCR avec des kits spécifiques (Table of Materials), resuspend in ddH2O, vérifier par électrophorèse sur un gel agarose et quantifier.
  2. Effectuer une traduction de pseudo sur 1,5 à 2 g d'ADN à partir de l'étape 1.1 dans un volume final de 50 L en mélangeant tous les réactifs dans un tube d'ADN liant de 0,5 mL bas selon le tableau 1.
    REMARQUE : Les sondes directement étiquetées peuvent améliorer le rapport signal/bruit. Des kits pour produire des sondes indirectement et directement étiquetées avec divers fluorochromes Alexa par traduction de pseudo sont disponibles dans le commerce.
  3. Incuber le mélange de traduction de pseudo dans un mélangeur thermique à 16 oC pendant un certain temps en fonction de la longueur du matériel d'ADN de départ : 45 min pour les produits PCR (un pool de produits PCR de 2 000 bp chacun) et jusqu'à 4 h pour l'ADN BAC et les plasmides.
  4. Vérifiez la taille des sondes produites à l'étape 1.3 par électrophoresis sur un gel agarose de 2,2%.
    REMARQUE : La taille optimale de la sonde est de 200 pb(figure 1A).
    1. Si l'ADN n'est pas assez digéré, ajoutez 5 U de polymérase d'ADN I et 0,05 U de DNase I à la réaction et incubez pendant 1 à 2 h à 16 oC et vérifiez par la suite. Arrêtez la réaction avec 0.5 mM EDTA (concentration finale). Stocker les sondes à -20 oC.
  5. Pour chaque expérience DNA FISH, précipitez les quantités suivantes de sondes en fonction du matériel d'ADN de départ à partir duquel les sondes sont produites : 200 ng de produits PCR traduits en pseudo, 100 ng de BAC traduits en pseudo, ou 300 ng de pseudo traduit plasmide. Ajouter ddH2O jusqu'à 150 O, 20 g d'ADN de sperme de saumon non étiqueté, 3,5 g d'ADN Cot-1 spécifique à l'espèce, 3 volumes de 100 % EtOH et 1/10 volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2. Précipitation à -80 oC pendant 1 h.
  6. Centrifugeàeur à vitesse maximale pendant 1 h à 4 oC et jetez le supernatant. Laver la pastille deux fois avec 70% EtOH.
  7. Resuspendre la pastille en 2 l de 100% de pH 7.0 formamide, secouer à 40 oC pendant 30 minutes (peut prendre jusqu'à quelques heures) puis ajouter un volume égal de 4x de citrate saline-sodium (SSC)/20% de sulfate de dextran.
    1. Préparer 20x SSC en mélangeant 175,3 g de NaCl et 88,2 g de citrate de sodium dans un volume final de 1 L de H2O. Autoclave, filtrer et préparer les aliquots.
      REMARQUE: Pour l'ADN multicolore FISH, les différentes sondes peuvent être précipitées ensemble, sauf pour les sondes qui peuvent annexer les uns avec les autres. Dans ces cas spécifiques, traitez-les séparément, précipitez et suspendez de nouveau les sondes divisant les réactifs mentionnés dans les étapes 1.5-1.7 en ce qui concerne le nombre de sondes. Pool les sondes seulement après la résuspension dans formamide. Si des couvercles en verre de plus de 10 mm ou moins de 10 mm sont utilisés, augmenter/descendre le volume des réactifs utilisés dans les étapes 1,5 à 1,7 proportionnellement à la taille de la glissière. Les sondes d'hybridation peuvent être stockées à -20 oC pendant une longue période (jusqu'à deux mois).

2. Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation

REMARQUE : Les passages de perméabilisation et de déprotéinisation sont des étapes cruciales. Le temps de réaction et de concentration des réactifs dépend fortement du type de cellule, de l'abondance du cytoplasme et de la morphologie nucléaire.

  1. Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation pour les lymphocytes T primaires humains
    REMARQUE: Ce protocole est adapté pour les petites cellules, avec de petits noyaux et une faible quantité de cytoplasme.
    1. Utilisez des couvercles en verre (10 mm, épaisseur No. 1.5H).
    2. Laver le verre avec ddH2O, puis avec 70% EtOH et les laisser sécher. Utilisez un verre pour chaque puits d'une assiette de 24 puits.
    3. Ajouter 200 l de 0,1 % de polylysine (w/v)(tableau des matériaux)directement sur le verre pour former une goutte. Faites attention car la goutte doit rester sur la surface de verre sans toucher le puits pendant 2 à 5 min. Laissez la goutte soigneusement, et laissez le verre sécher pendant 30 min.
    4. Effectuez l'étape 2.1.3 deux fois plus.
    5. Mettre 200 l de cellules de suspension (2 x 106/mL, suspension PBS des lymphocytes T primaires ex vivo) directement sur le verre, permettent aux cellules de semer à température ambiante (RT) pendant 30 min.
    6. Retirez rapidement la goutte. Ajouter le PFA fraîchement préparé à 4 % (préparé en PBS/0,1 % TWEEN 20, pH 7,0, filtré) pendant 10 min et fixer les cellules ensemoit à RT.
    7. Laver trois fois pendant 5 min chacun avec 0,05% Triton X-100/PBS (TPBS) à RT. Permeabilize avec 0,5% TPBS pour 10 min à RT.
    8. Effectuer le traitement de RNase en ajoutant 2,5 l de cocktail RNase(Table of Materials) dans 250 'L de PBS/puits dans une assiette de 24 puits pendant 1 h à 37 oC.
    9. Rincer dans le PBS, ajouter 20 % de glycérol/PBS et couver toute la nuit (ON) à 4 oC.
      REMARQUE: Cette étape peut varier de 1 h à ON. Les glissières peuvent être conservées dans 20 % de glycérol/PBS à 4 oC jusqu'à 7 jours.
    10. Congeler sur de la glace sèche (15 à 30 s), décongeler graduellement à rt et tremper dans 20 % de glycérol/PBS. Répétez l'étape 2.1.9 encore trois fois.
    11. Laver en TPBS de 0,5 % pendant 5 min à RT. Wash en 0,05 % TPBS, deux fois pendant 5 min à RT. Incubate en 0.1 N HCl pendant 12 min à RT. Rinse en 2x SSC.
    12. Incubate dans 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON à RT.
      REMARQUE : Le temps d'incubation peut être optimisé et éventuellement réduit. Les glissières peuvent être conservées dans 50% formamide/2x SSC pendant plusieurs jours.
  2. Fixation cellulaire, prétraitement et perméabilisation des myoblastes primaires humains
    REMARQUE: Ce protocole est adapté pour les grandes cellules, avec une grande quantité de cytoplasme.
    1. Cultivez les myoblastes primaires humains directement sur les verres de couverture dans des plaques de 24 puits dans le milieu de croissance (le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 20% de sérum bovin foetal (FBS), le facteur de croissance de fibroblaste de 25 ng/mL (FGF), le facteur épidermique de 10 ng/mL (EGF), l'insuline humaine de 10 g/mL, 1x glutamine, 1x pénicilline/streptomycine) pendant au moins 24 h (atteignant 50 à 70% de la confluence).
      REMARQUE : Pour faciliter l'adhérence, la gélatine ou le collagène ou la poly-l-lysine peuvent être utilisés pour enrober le bordereau avant l'ensemencement.
    2. Rincer les cellules dans les changements de 2 à 3 de PBS. Ajouter fraîchement fait 4% PFA et fixer les cellules pendant 10 min à RT.
    3. Laver trois fois pendant 3 min chacun en 0,01% TPBS à RT. Permeabilize en 0,5% TPBS pour 10 min à RT.
    4. Effectuer le traitement de RNase en ajoutant 2,5 l de cocktail RNase(Table of Materials) dans 250 'L de PBS/puits dans une assiette de 24 puits pendant 1 h à 37 oC.
    5. Rincer dans PBS, ajouter 20% de glycérol/PBS, et incuber ON à RT.
      REMARQUE: Cette étape peut varier de 1 h à ON. Les glissières peuvent être conservées dans 20 % de glycérol/PBS à 4 oC jusqu'à 7 jours.
    6. Congeler sur de la glace sèche (15 à 30 s), décongeler graduellement à rt et tremper dans 20 % de glycérol/PBS. Répétez cette étape trois fois.
    7. Laver trois fois pendant 10 min chacun en PBS. Incuber en 0.1 N HCl pendant 5 min à RT. Rinse en 2x SSC.
    8. Incubate dans 50% formamide pH 7.0/2x SSC ON à RT.
      REMARQUE : Le temps d'incubation peut être optimisé et éventuellement réduit. Les glissières peuvent être conservées dans 50% formamide/2x SSC pendant plusieurs jours.
    9. Diapositives d'équilibre (maintenues dans 50% formamide/2x SSC) en 2x SSC pendant 2 min. Ensuite, équilibrez en PBS pendant 3 min.
    10. Traiter avec 0,01 N HCl/0.0025% pepsine de quelques secondes jusqu'à 5 min, selon le type de cellule. Au cours de cette étape, observez les cellules sous un microscope optique et arrêtez la réaction (étape 2.2.11) dès que les noyaux sont exempts du cytoplasme, tout en maintenant leur structure intacte (par exemple, les nucléoles sont encore visibles et intacts).
    11. Inactiver la pepsine en lavant deux fois pendant 5 min chacun e en 50 mM MgCl2/PBS.
    12. Post-fixer dans 1% PFA/PBS pendant 1 min. Laver pendant 5 min en PBS. Laver deux fois pendant 5 min chacun en 2x SSC, puis ajouter 50% formamide/2x SSC pendant au moins 30 min.

3. Hybridation 3D multicolorE D'ADN FISH

  1. Dénaturer les sondes à 80 oC pendant 5 min, puis les mettre rapidement sur la glace.
  2. Chargez les sondes d'hybridation sur une lame de microscope propre. Tournez le bordereau avec des cellules à l'envers sur la goutte de sondes d'hybridation.
  3. Scellez la glissière de couverture avec du ciment en caoutchouc. Laisser sécher complètement le ciment en caoutchouc. Ensuite, placez les glissières sur un bloc de chauffage et dénaturez à 75 oC pendant 4 min.
    REMARQUE : Le moment de la dénaturation et la température de la dénaturation peuvent être augmentés, jusqu'à 80 oC.
  4. Hybrider à 37 oC ON dans une boîte métallique flottant dans un bain d'eau.
    REMARQUE : Pour améliorer le rapport signal/bruit, la température d'hybridation peut aller jusqu'à 42 oC.
  5. Épluchez le ciment en caoutchouc, immerger les lames dans 2x SCC, dépouiller le bordereau en verre et le transférer à 2x SSC dans une assiette de 6 puits.
  6. Laver en 2x SSC trois fois pendant 5 min chacun à 37 oC, en secouant à 90 tr/min dans un shaker d'incubateur. Laver en 0,1x SSC trois fois pendant 5 min chacun à 60 oC, en secouant à 90 tr/min dans un shaker d'incubateur. Rincer brièvement dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20.

4. Détection 3D multicolore d'ADN FISH

REMARQUE : Pour les sondes directement étiquetées, sautez les étapes 4.1 et 4.2.

  1. Bloquer dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 20 min à 37 oC dans une assiette de 24 puits, en secouant à 20 tr/min dans un shaker d'incubateur.
  2. Incuber avec la concentration appropriée d'anti-digoxygénine (1:150), et/ ou de streptavidin (1:1,000) (Tableau des matériaux) dilué dans 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% BSA pendant 35 min dans une chambre sombre et humide à 37 oC.
  3. Laver en 4x SSC/0,2% TWEEN 20 trois fois pendant 5 min chacun à 37 oC, en secouant à 90 tr/min dans une assiette de 6 puits dans un shaker.
  4. Équilibre dans PBS et post-fixe dans 2% formaldéhyde/PBS pendant 2 min à RT dans une plaque de 24 puits.
    REMARQUE : Les sondes directement étiquetées n'ont pas besoin de post-fixation.
  5. Laver 5x brièvement dans PBS. Tache avec 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)/PBS pendant 5 min à RT.
  6. Laver 5x brièvement dans PBS. Mont avec solution antifade (Tableau des Matériaux).

5. Microscopie et analyse 3D multicolorDNA FISH

  1. Acquérir des images 3D avec un système de microscope.
    REMARQUE : Ici, un microscope à champ large avec une distance axiale de 0,2 à 0,25 m entre les sections consécutives (figure 1B) est utilisé.
  2. Analysez les piles d'images 3D à l'aide de différents logiciels et outils (ici, NuCLMD ou Nuclear Contacts Locator en 3D).
    REMARQUE : L'outil NuCLMD a été développé afin d'analyser automatiquement l'ADN multicolor edeur3D FISH dans les piles z d'image cellulaire de fluorescence. NuCL-D reconstitue les noyaux à partir de piles d'images cellulaires en 3D et détecte et localise les taches 3D fluorescentes. Il mesure le positionnement relatif des taches dans le noyau (p. ex., la distance par rapport au centroïde des noyaux et/ou de la périphérie des noyaux) et le rayon maximal pour chaque noyau et chaque distance entre les taches. L'outil et l'algorithme utilisé sont entièrement décrits dans Cortesi et al.16.
  3. Analyser les données (p. ex., distances 3D entre les loci génomiques spécifiés et les fréquences de contact et de centroïdes nucléaires) récupérées par NuCL-D.
    REMARQUE : Pour les distances 3D entre les loci génomiques spécifiés et le centroïde nucléaire, normalisez les distances sur le rayon maximum de chaque noyau et représentent ces données comme des distributions de fréquences des distances normalisées du centroïde nucléaire. Pour les études d'interactions à longue portée, les fréquences de contact sont censées être de l'ordre de 10 à 20 %21 avec un seuil inter-distance qui peut varier et peut être mis autour de 2 m35.
    1. Pour effectuer une analyse statistique, analysez environ 100 noyaux par réplique biologique. Représenter les distances 3D entre les loci génomiques spécifiés comme des distributions cumulatives de fréquences inférieures au seuil inter-distance sélectionné et utiliser un test tpour évaluer l'importance des différences dans les distributions. En outre, calculer le pourcentage de noyaux positifs pour les interactions qui sont en dessous du seuil inter-distance sélectionné, et utiliser le test exact de Fisher pour évaluer l'importance des différences dans les pourcentages.

Résultats

La méthode de l'ADN multicolore 3D FISH décrit dans cet article permet la visualisation contemporaine de différents loci génomiques dans les noyaux 3D conservés (Figure 1B). Ce protocole permet de mesurer les distances entre les allèles et les différents loci génomiques afin d'évaluer leur proximité spatiale et d'évaluer leur emplacement dans l'espace nucléaire (p. ex., distance loci du centroïde ou de la périphérie des noyaux)16. Cepen...

Discussion

La méthode actuelle décrit un protocole étape par étape pour effectuer 3D MULTIcolor DNA FISH sur un large éventail de cellules primaires humaines. Bien que l'ADN FISH soit une technologie largement utilisée, l'ADN 3D multicolore FISH sur les noyaux interphases 3D conservés est encore difficile à réaliser dans de nombreux laboratoires, principalement en raison des caractéristiques des échantillons utilisés23,24.

La traducti...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent l'assistance technique de l'INSTALLATION d'imagerie INGM (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milan, Italie), en particulier C. Cordiglieri, pour l'assistance lors des images 3D multicolor DNA FISH Achat. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes à B.B.: EPIGEN programme phare italien, Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon, subvention nr 18754) et Giovani Ricercatori, ministère italien de la Santé (GR-2011-02349383). Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, subvention nr 2018-0321).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesThermo Fisher Scientific142475
6-well platesThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (bovine serum albumine)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testesSigmaD7656
Dextran sulfate (powder)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polymerase IThermo Fisher Scientific18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EthanolSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Formaldehyde solutionSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutammineThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulin HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline)SigmaP4417
Pennycillin/StreptavidinThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinBioradP6887
PhasePrep BAC DNA KitSigmaNA0100-1KT
Poly-L-lysine solutionSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo KitThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK210010
RNAse cocktailThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Tri-Sodium CitrateSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

Références

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