Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

3D multicolor DNA FISH representa una herramienta para visualizar múltiples loci genómicos dentro de núcleos conservados 3D, definiendo inequívocamente sus interacciones recíprocas y localización dentro del espacio nuclear a un solo nivel de célula. Aquí, se describe un protocolo paso a paso para un amplio espectro de células primarias humanas.

Resumen

Una de las principales preguntas en la biología celular es la organización genómica dentro del espacio nuclear y cómo la arquitectura de la cromatina puede influir en procesos como la expresión génica, la identidad celular y la diferenciación. Muchos enfoques desarrollados para estudiar la arquitectura 3D del genoma se pueden dividir en dos categorías complementarias: tecnologías basadas en la captura de conformación cromosómica (tecnologías C) e imágenes. Mientras que el primero se basa en la captura de la conformación cromosómica y las interacciones proximales del ADN en una población de células fijas, la segunda, basada en la hibridación in situ por fluorescencia del ADN (FISH) en núcleos conservados en 3D, permite la visualización contemporánea de múltiples loci a un solo nivel de célula (multicolor), examinando sus interacciones y distribución dentro del núcleo (3D multicolor DNA FISH). La técnica del ADN multicolor 3D FISH tiene una limitación de visualizar sólo unos pocos loci predeterminados, no permitiendo un análisis exhaustivo de la arquitectura nuclear. Sin embargo, dada la solidez de sus resultados, 3D multicolor DNA FISH en combinación con la microscopía 3D y la reconstrucción de imágenes es un método posible para validar los resultados basados en la tecnología C y para estudiar inequívocamente la posición y organización de loci específicos a un solo nivel de célula. Aquí, proponemos un método paso a paso de 3D multicolor DNA FISH adecuado para una amplia gama de células primarias humanas y discutimos todas las acciones prácticas, pasos cruciales, nociones de imagen 3D y análisis de datos necesarios para obtener un multicolor 3D exitoso e informativo DNA FISH dentro de diferentes contextos biológicos.

Introducción

Los eucariotas más altos necesitan condensar y compactar sistemáticamente una enorme cantidad de información genética en el espacio 3D minuto del núcleo1,2,3,4. Hoy en día, sabemos que el genoma está ordenado espacialmente en compartimentos y dominios topológicamente asociados5 y que los múltiples niveles de plegado de ADN generan contactos entre diferentes regiones genómicas que pueden implicar la formación de bucles de cromatina6,7. El bucle dinámico 3D de la cromatina puede influir en muchos procesos biológicos diferentes como la transcripción8,9,la diferenciación y desarrollo10,11, la reparación del ADN12,13, mientras que sus perturbaciones están implicadas en diversas enfermedades14,15,16 y defectos de desarrollo15,17,18.

Se han desarrollado muchos enfoques para estudiar la organización del genoma 3D. Se han desarrollado tecnologías basadas en la captura de conformación cromosómica (tecnologías C, 3C, 4C, 5C, Hi-C y derivados) para estudiar la organización del genoma en células fijas3,4,19,20. Estos enfoques se basan en la capacidad de capturar las frecuencias de contacto entre loci genómicos en proximidad física. Las tecnologías C, dependiendo de su complejidad, capturan la organización mundial del genoma 3D y la topología nuclear de una población celular3,4,19,20. Sin embargo, las interacciones 3D son dinámicas en el tiempo y el espacio, altamente variables entre las células individuales que consisten en interacciones multiplex, y son ampliamente heterogéneas21,22.

La hibridación in situ de la fluorescencia del ADN multicolor 3D (FISH) es una técnica que permite la visualización de loci genólicos específicos a un nivel de célula única, permitiendo la investigación directa de la arquitectura nuclear 3D de manera complementaria a las tecnologías C. Representa una tecnología utilizada actualmente para validar inequívocamente los resultados C. 3D multicolor DNA FISH utiliza sondas etiquetadas fluorescentmente complementarias a los loci genómicos de los intereses. El uso de diferentes fluoróforos y equipos de microscopía adecuados permiten la visualización contemporánea de múltiples objetivos dentro del espacio nuclear23,24. En los últimos años, FISH se ha combinado con los avances tecnológicos en microscopía para obtener la visualización de estructuras de escala fina a alta resolución25,26 o con enfoques CRISPR-Cas para la visualización de los ácidos nucleicos en imágenes en vivo27,28. A pesar de la amplia adopción, el enfoque 3D multicolor DNA FISH todavía se considera difícil en muchos laboratorios porque el material biológico utilizado debe adaptarse.

Aquí, proporcionamos un protocolo integral para el ADN 3D multicolor FISH (desde la preparación de células/sondas hasta el análisis de datos) aplicable a una amplia gama de células primarias humanas, permitiendo la visualización de múltiples loci genómicos y preservando la estructura 3D de los núcleos. Para estudiar la arquitectura nuclear, se debe preservar la estructura 3D de los núcleos. Por esta razón, contrastando con otros protocolos existentes29,30,31,evitamos el uso de un gradiente alcohólico y el almacenamiento de los cubreobjetos en alcohol que puede afectar a la estructura de la cromatina32. El método se adapta a partir de los protocolos FISH de ADN 3D conservados24,33 para aplicarse a una amplia gama de células primarias humanas, tanto aisladas ex vivo o cultivadas in vitro. Existen parámetros de permeabilización y desproteinización para diferentes morfologías nucleares y características citológicas (por ejemplo, diferentes grados de compactación nuclear, abundancia de citoesqueleto)34. Estos parámetros se describen generalmente en otros protocolos24,33, sin proporcionar una clara discriminación del procedimiento dentro de diferentes tipos de células. Además, desarrollamos una herramienta específica llamada NuCL-D (localizador de contactos nucleares en 3D)16,proporcionando principios para el análisis de datos que mejorarán la proximidad 3D entre diferentes loci y su distribución topológica nuclear dentro del espacio nuclear de forma automatizada.

Protocolo

1. Procedimientos de preparación y etiquetado de la sonda de ADN con traducción de nick

  1. Purificar y limpiar cromosomas artificiales bacterianos (BAC), plásmidos o productos PCR con kits específicos(Tabla de materiales),resuspender en ddH2O, comprobar por electroforesis en un gel de agarosa y cuantificar.
  2. Realice la traducción de nicks en 1,5 x 2 g de ADN a partir del paso 1.1 en un volumen final de 50 l mezclando todos los reactivos en un tubo de ADN de unión baja de 0,5 ml de acuerdo con la Tabla 1.
    NOTA: Las sondas etiquetadas directamente pueden mejorar la relación señal-ruido. Los kits para producir sondas etiquetadas indirectamente y directamente con varios fluorocromos Alexa por traducción de nick están disponibles comercialmente.
  3. Incubar la mezcla de traducción de nick en un mezclador térmico a 16oC durante un tiempo dependiendo de la longitud del material de ADN inicial: 45 min para productos PCR (un grupo de productos PCR de 2.000 bp cada uno) y hasta 4 h para ADN BAC y plásmidos.
  4. Compruebe el tamaño de las sondas producidas en el paso 1.3 por electroforesis en un gel de agarosa del 2,2%.
    NOTA: El tamaño óptimo de la sonda es <200 bp(Figura 1A).
    1. Si el ADN no se digiere lo suficiente, añadir 5 U de ADN polimerasa I y 0,05 U de DNase I a la reacción e incubar durante 1 x 2 h a 16 oC y posteriormente volver a comprobar. Detener la reacción con 0,5 mM EDTA (concentración final). Almacene las sondas a -20 oC.
  5. Para cada experimento DNA FISH, precipita las siguientes cantidades de sondas dependiendo del material de ADN inicial a partir del cual se producen las sondas: 200 ng de productos de PCR traducidos por Nick, 100 ng de BACtraducidos nick, o 300 ng de plásmido traducido nick. Añadir ddH2O hasta 150 ol, 20 g de ADN de espermatozoides de salmón sin etiquetar, 3,5 g de ADN de cot-1 específico de la especie, 3 volúmenes de 100% EtOH y 1/10 volumen de acetato de sodio de 3 M pH 5.2. Precipitar a -80oC durante 1 h.
  6. Centrifugar a una velocidad máxima de 1 h a 4oC y desechar el sobrenadante. Lave el pellet dos veces con 70% EtOH.
  7. Resuspender el pellet en 2 sL de 100% de formamida pH 7.0, agitar a 40 oC durante 30 minutos (puede tomar hasta unas horas) y luego añadir un volumen igual de 4 x citrato de sodio salino (SSC) / 20% sulfato de dextran.
    1. Preparar 20x SSC mezclando 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en un volumen final de 1 L de H2O. Autoclave, filtrar y preparar alícuotas.
      NOTA: Para el ADN multicolor FISH, las diferentes sondas se pueden precipitar juntas excepto para sondas que pueden recocido entre sí. En estos casos específicos, tratarlos por separado, precipitar y resuspender las sondas que dividen los reactivos mencionados en los pasos 1.5-1.7 con respecto al número de sondas. Agrupa las sondas sólo después de la resuspensión en formamida. Si se utilizan revestimientos de vidrio superiores a 10 mm o menos de 10 mm, escale/reduzca verticalmente el volumen de los reactivos utilizados en los pasos 1,5 a 1,7 proporcionalmente al tamaño de la diapositiva. Las sondas de hibridación se pueden almacenar a -20 oC durante un largo período de tiempo (hasta dos meses).

2. Fijación celular, pretratamiento y permeabilización

NOTA: Los pasajes de permeabilización y desproteinización son pasos cruciales. El tiempo de reacción y concentración de los reactivos depende en gran su nombre del tipo de célula, la abundancia del citoplasma y la morfología nuclear.

  1. Fijación celular, pretratamiento y permeabilización para linfocitos T primarios humanos
    NOTA: Este protocolo es adecuado para células pequeñas, con núcleos pequeños y una baja cantidad de citoplasma.
    1. Utilice tapas de vidrio (10 mm, espesor No. 1.5H).
    2. Lavar el vaso con ddH2O, luego con 70% EtOH y dejar que se sequen. Utilice un vaso para cada pocal de un plato de 24 pocillos.
    3. Añadir 200 s de poli-L-lisina al 0,1% (p/v)(Tabla de materiales)directamente en el vidrio para formar una gota. Preste atención ya que la gota debe permanecer en la superficie de vidrio sin tocar el pozo durante 2 x 5 minutos. Deje que el vidrio se seque durante 30 minutos.
    4. Realice el paso 2.1.3 dos veces más.
    5. Poner 200 l de células de suspensión (2 x 106/ml, suspensión de PBS de linfocitos T primarios ex vivo) directamente en el vidrio, permitir que las células siembren a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
    6. Retire rápidamente la gota. Añadir PFA 4% recién hecho (preparado en PBS/0.1% TWEEN 20, pH 7.0, filtrado) durante 10 min y fijar las células sembradas en RT.
    7. Lavar tres veces durante 5 min cada una con 0.05% Triton X-100/PBS (TPBS) en RT. Permeabilize con 0.5% TPBS para 10 min en RT.
    8. Realizar el tratamiento de RNase añadiendo 2,5 ml de cóctel de RNase(Tabla de materiales)en 250 ml de PBS/bien en una placa de 24 pocillos durante 1 h a 37 oC.
    9. Enjuagar en PBS, añadir un 20% de glicerol/PBS e incubar durante la noche (ON) a 4oC.
      NOTA: Este paso puede variar de 1 h a ON. Las diapositivas se pueden mantener en un 20% de glicerol/PBS a 4 oC hasta 7 días.
    10. Congele en hielo seco (15-30 s), descongele gradualmente a RT y empape en 20% de glicerol/PBS. Repita el paso 2.1.9 otras tres veces.
    11. Lavar en 0,5% TPBS durante 5 min a RT. Lavar en 0,05% TPBS, dos veces durante 5 min a RT. Incubar en 0,1 N HCl durante 12 min en RT. Enjuagar en 2x SSC.
    12. Incubar en 50% de formamida pH 7.0/2x SSC ON en RT.
      NOTA: El tiempo de incubación se puede optimizar y eventualmente reducir. Las diapositivas se pueden mantener en un 50% de formamida/2x SSC durante varios días.
  2. Fijación celular, pretratamiento y permeabilización para mioblastos primarios humanos
    NOTA: Este protocolo es adecuado para células grandes, con una gran cantidad de citoplasma.
    1. Cultivar mioblastos primarios humanos directamente en las gafas de encubrimiento en placas de 24 pocillos en medio de crecimiento (medio águila modificado de Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal del 20% (FBS), factor de crecimiento de fibroblastos de 25 ng/ml (FGF), factor de crecimiento epidérmico de 10 ng/ml (EGF), insulina humana de 10 g/ml, 1x glutamina, 1x penicilina/estreptomicina) durante al menos 24 h (alcanzando 50-70% de confluencia).
      NOTA: Para facilitar la adhesión, la gelatina o el colágeno o la poli-L-lisina se pueden utilizar para recubrir el cubreobjetos antes de la sembrada.
    2. Enjuague las células en 2 x 3 cambios de PBS. Agregue el 4% de PFA recién hecho y fije las células durante 10 minutos en RT.
    3. Lavar tres veces durante 3 min cada una en 0.01% TPBS en RT. Permeabilizar en 0.5% TPBS para 10 min en RT.
    4. Realizar el tratamiento de RNase añadiendo 2,5 ml de cóctel de RNase(Tabla de materiales)en 250 ml de PBS/bien en una placa de 24 pocillos durante 1 h a 37 oC.
    5. Enjuague en PBS, agregue 20% de glicerol/PBS e incubar ON en RT.
      NOTA: Este paso puede variar de 1 h a ON. Las diapositivas se pueden mantener en un 20% de glicerol/PBS a 4 oC hasta 7 días.
    6. Congele en hielo seco (15-30 s), descongele gradualmente a RT y empape en 20% de glicerol/PBS. Repita este paso tres veces.
    7. Lavar tres veces durante 10 minutos cada uno en PBS. Incubar en 0,1 N HCl durante 5 min a RT. Enjuague en 2x SSC.
    8. Incubar en 50% de formamida pH 7.0/2x SSC ON en RT.
      NOTA: El tiempo de incubación se puede optimizar y eventualmente reducir. Las diapositivas se pueden mantener en un 50% de formamida/2x SSC durante varios días.
    9. Diapositivas de equilibrio (mantenidas en 50% de formamida/2x SSC) en 2x SSC durante 2 min. A continuación, equilibrar en PBS durante 3 min.
    10. Tratar con 0.01 N HCl/0.0025% pepsina desde unos segundos hasta 5 min, dependiendo del tipo de celda. Durante este paso, observe las células bajo un microscopio óptico y detenga la reacción (paso 2.2.11) tan pronto como los núcleos estén libres del citoplasma, manteniendo su estructura intacta (por ejemplo, los nucleolisiguen visibles e intactos).
    11. Inactivar la pepsina lavando dos veces durante 5 min cada uno en 50 mM MgCl2/PBS.
    12. Post-fijo en 1% PFA/PBS durante 1 min. Lavar durante 5 min en PBS. Lavar dos veces durante 5 min cada uno en 2x SSC, y luego añadir 50% de formamida/2x SSC durante al menos 30 min.

3. Hibridación 3D multicolor DNA FISH

  1. Desnaturalizar las sondas a 80 oC durante 5 minutos, y luego poner rápidamente en hielo.
  2. Cargue las sondas de hibridación en una diapositiva limpia del microscopio. Gire el cubreobjetos con las células al revés en la gota de las sondas de hibridación.
  3. Selle la cubierta con cemento de goma. Deje que el cemento de goma se seque por completo. A continuación, coloque los portaobjetos en un bloque de calefacción y desnaturaliza a 75 oC durante 4 min.
    NOTA: Se puede aumentar el tiempo de desnaturalización y la temperatura de la desnaturalización, hasta 80 oC.
  4. Hibrida a 37oC ON en una caja metálica flotando en un baño de agua.
    NOTA: Para mejorar la relación señal-ruido, la temperatura de hibridación puede llegar hasta 42 oC.
  5. Pelar el cemento de goma, sumergir los portaobjetos en 2x SCC, quitar el cubreobjetos de vidrio y transferirlo a 2x SSC en placa de 6 pocillos.
  6. Lavar en 2x SSC tres veces durante 5 min cada uno a 37oC, agitando a 90 rpm en una coctelera de incubadora. Lavar en 0,1x SSC tres veces durante 5 min cada una a 60 oC, agitando a 90 rpm en una coctelera de incubadora. Enjuague brevemente en 4x SSC/0.2% TWEEN 20.

4. Detección de FISH de ADN multicolor 3D

NOTA: Para sondas etiquetadas directamente, omita los pasos 4.1 y 4.2.

  1. Bloquear en 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% albúmina sérica bovina (BSA) durante 20 min a 37oC en una placa de 24 pocillos, agitando a 20 rpm en una coctelera de incubadora.
  2. Incubar con la concentración adecuada de antidigoxigenina (1:150) y/o estreptavidina (1:1.000)(Tabla de materiales)diluida en 4x SSC/0.2% TWEEN 20/4% BSA durante 35 min en una cámara oscura y húmeda a 37oC.
  3. Lavar en 4x SSC/0.2% TWEEN 20 tres veces durante 5 min cada uno a 37oC, agitando a 90 rpm en una placa de 6 pocillos en una coctelera de incubadora.
  4. Equilibrar en PBS y post-fijar en 2% formaldehído/PBS durante 2 min a RT en una placa de 24 pocillos.
    NOTA: Las sondas etiquetadas directamente no necesitan post-fijación.
  5. Lavar 5 veces brevemente en PBS. Mancha con 1 ng/mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole)/PBS durante 5 min en RT.
  6. Lavar 5 veces brevemente en PBS. Montaje con solución antidescolora(Tabla de materiales).

5. Microscopía y análisis 3D multicolor DNA FISH

  1. Adquiera imágenes 3D con un sistema de microscopio.
    NOTA: Aquí se utiliza un microscopio de campo ancho con una distancia axial de 0,2 x 0,25 m entre secciones consecutivas(Figura 1B).
  2. Analice las pilas de imágenes 3D utilizando diferentes software y herramientas (aquí, NuCL-D o Localizador de Contactos Nucleares en 3D).
    NOTA: La herramienta NuCL-D se ha desarrollado con el fin de analizar automáticamente 3D ADN multicolor FISH en pilas z de imagen de célula de fluorescencia. NuCL-D reconstruye los núcleos a partir de pilas de imágenes celulares en 3D, así como detecta y localiza puntos 3D fluorescentes. Mide el posicionamiento relativo de las manchas en el núcleo (por ejemplo, la distancia desde el centroide de los núcleos y/o la periferia de los núcleos) y el radio máximo para cada núcleo y las distancias entre puntos. La herramienta y el algoritmo utilizado están completamente descritos en Cortesi et al.16.
  3. Analizar los datos (por ejemplo, distancias 3D entre los loci genómicos especificados y el centroide nuclear y las frecuencias de contacto) recuperados por NuCL-D.
    NOTA: Para las distancias 3D entre los loci genómicos especificados y el centroide nuclear, normalice las distancias en el radio máximo para cada núcleo y represente estos datos como distribuciones de frecuencia de distancias normalizadas desde el centroide nuclear. Para los estudios de interacciones de largo alcance, se supone que las frecuencias de contacto están en el rango de 10 a 20%21 con un umbral de interdistancia que puede variar y se puede poner alrededor de 2 m35.
    1. Para realizar análisis estadísticos, analice aproximadamente 100 núcleos por réplica biológica. Representar distancias 3D entre loci genómicos especificados como distribuciones de frecuencia acumulativa de distancias que están por debajo del umbral entre distancias seleccionado y utilizar una prueba tpara evaluar la importancia de las diferencias en las distribuciones. Además, calcule el porcentaje de núcleos positivos para las interacciones que están por debajo del umbral de interdistancia seleccionado, y utilice la prueba exacta de Fisher para evaluar la importancia de las diferencias en los porcentajes.

Resultados

El método de ADN multicolor 3D FISH descrito en este artículo permite la visualización contemporánea de diferentes loci genómicos dentro de los núcleos 3D conservados(Figura 1B). Este protocolo permite medir las distancias entre los alelos y los diferentes loci genómicos para evaluar su proximidad espacial, y evaluar su ubicación dentro del espacio nuclear (por ejemplo, la distancia de loci desde el centroide o la periferia de los núcleos)16....

Discusión

El método actual describe un protocolo paso a paso para realizar ADN FISH multicolor 3D en una amplia gama de células primarias humanas. Aunque DNA FISH es una tecnología de uso amplio, el ADN 3D multicolor FISH en núcleos interfásicos 3D conservados sigue siendo difícil de realizar en muchos laboratorios, principalmente debido a las características de las muestras utilizadas23,24.

La traducción de nick de sonda es un paso fund...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen la asistencia técnica del INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milán, Italia), en particular C. Cordiglieri, para la asistencia durante las imágenes 3D multicolor DNA FISH Adquisición. Este trabajo ha sido apoyado por las siguientes subvenciones a B.B.: el programa insignia italiano EPIGEN, la Asociación Francesa contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) y Giovani Ricercatori, Ministerio de Salud de Italia (GR-2011-02349383). Este trabajo ha sido apoyado por la siguiente subvención a F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesThermo Fisher Scientific142475
6-well platesThermo Fisher Scientific140675
Anti-Digoxigenin 488DBADI7488
b-MercaptoethanolSigmaM3148
bFGFPeproTech100-18B
Biotin 11 d-UTPThermo Fisher ScientificR0081
BSA (bovine serum albumine)SigmaA7030
CoverlsipsMarienfeld117500
CY3 d-UTPGE HealthcarePA53022
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)Thermo Fisher ScientificD21490
Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testesSigmaD7656
Dextran sulfate (powder)Santa Cruzsc-203917A
Digoxigenin 11 d-UTPRoche11093088910
DMEMThermo Fisher Scientific21969-035 500mL
DNA polymerase IThermo Fisher Scientific18010-017
DNase ISigmaAMPD1
dNTPs (C-G-A-T)EurocloneBL0423A/C/G
EGFSigmaE9644.2MG
EthanolSigma02860-1L
FBS HycloneThermo Fisher ScientificSH30109
Formaldehyde solutionSigmaF8775-25mL
FormamideSigmaF9037
GlutammineThermo Fisher Scientific25030-024 100mL
GlycerolSigmaG5516-100mL
GlycogenThermo Fisher ScientificAM9510
HClSigma30721
Human Cot-1 DNAThermo Fisher Scientific15279-001
Insulin HumanSigmaI9278-5 mL
MgCl2Sigma63069
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)SigmaS2889
NaClSigmaS9888
ParaformaldehydeSigma158127-25G
PBS (phosphate-buffered saline)SigmaP4417
Pennycillin/StreptavidinThermo Fisher Scientific15070-063 100mL
PepsinBioradP6887
PhasePrep BAC DNA KitSigmaNA0100-1KT
Poly-L-lysine solutionSigmaP8920
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36970
PureLink Quick Gel Extraction & PCR Purification Combo KitThermo Fisher ScientificK220001
PureLink Quick Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK210010
RNAse cocktailThermo Fisher ScientificAM2288
RubbercementBostik
SlidesVWR631-0114
Streptavidina Alexa fluor 647Thermo Fisher ScientificS21374
Tri-Sodium CitrateSigma1110379026
Tris-HClSigmaT3253-500g
Triton X-100SigmaT8787-250mL
TWEEN 20SigmaP9416-100mL

Referencias

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  3. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  4. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).
  5. van Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).
  6. Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. Spatial genome organization and cognition. Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).
  7. Pombo, A., Dillon, N. Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).
  8. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  9. Therizols, P., et al. Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells. Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).
  10. Gonzalez-Sandoval, A., et al. Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos. Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).
  11. Hubner, B., et al. Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).
  12. Aymard, F., et al. Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).
  13. Sellou, H., et al. The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage. Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).
  14. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).
  15. Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
  16. Cortesi, A., et al. 4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).
  17. Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits. PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).
  18. Woltering, J. M., Duboule, D. Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model. Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).
  19. de Laat, W., Dekker, J. 3C-based technologies to study the shape of the genome. Methods. 58 (3), 189-191 (2012).
  20. Denker, A., de Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
  21. Finn, E. H., et al. Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization. Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).
  22. Zheng, M., et al. Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision. Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).
  23. Solovei, I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections. Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).
  24. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).
  25. Legant, W. R., et al. High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).
  26. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  27. Chen, B., et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).
  28. Nelles, D. A., et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell. 165 (2), 488-496 (2016).
  29. Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures. Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).
  30. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).
  31. Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP. Genes & Development. 22 (4), 489-498 (2008).
  32. Kraus, F., et al. Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures. Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).
  33. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).
  34. Skinner, B. M., Johnson, E. E. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).
  35. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  36. Lubeck, E., Cai, L. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).
  37. Beliveau, B. J., et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nature Communication. 6, 7147 (2015).
  38. Beliveau, B. J., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).
  39. Samacoits, A., et al. A computational framework to study sub-cellular RNA localization. Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).
  40. Cardozo Gizzi, A. M., et al. Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms. Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).
  41. Mateo, L. J., et al. Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution. Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).
  42. Nir, G., et al. Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling. PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).
  43. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), (2018).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Gen ticaN mero 155hibridaci n fl or in situADN 3D FISHn cleos interf sicos preservadosarquitectura nuclearplegado del genoma 3Dcontactos de ADNposicionamiento nuclearc lulas primarias humanas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados