JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذه الطريقة هو تحديد كثافة CR1 في كريات الدم الحمراء من أي موضوع عن طريق مقارنة مع ثلاثة مواضيع التي يعرف كثافة CR1 الكريات الحمراء. تستخدم هذه الطريقة قياس الخلايا المتدفقة بعد المناعة من كريات الدم الحمراء للأشخاص بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CR1 إلى جانب نظام مضخم باستخدام phycoerythrin (PE).

Abstract

CR1 (CD35, مكمل مستقبلات نوع 1 لC3b/C4b) هو غشاء الوزن الجزيئي عالية جليكوبروتين من حوالي 200 كيلو دا التي تسيطر على استكمال التنشيط, ينقل المجمعات المناعية, ويشارك في استجابات المناعة الفكاهية والخلوية. CR1 موجود على سطح العديد من أنواع الخلايا، بما في ذلك كريات الدم الحمراء، ويعرض تعدد الأشكال في الطول، والهيكل (Knops، أو KN، مجموعة الدم)، والكثافة. متوسط كثافة CR1 لكل كريات الدم الحمراء (CR1/E) هو 500 جزيء لكل كريات الدم الحمراء. تختلف هذه الكثافة من فرد إلى آخر (100-1200 CR1/E) ومن كريات حمراء إلى أخرى في نفس الشخص. نقدم هنا طريقة قوية لقياس الخلايا المتدفقة لقياس كثافة CR1/E ، بما في ذلك في الموضوعات التي تعبر عن كثافة منخفضة ، بمساعدة نظام تضخيم المناعة. وقد مكنتنا هذه الطريقة من إظهار انخفاض التعبير عن كريات الدم الحمراء CR1 في أمراض مثل مرض الزهايمر (AD) ، الذئبة الجهازية erythematosus (SLE) ، الإيدز ، أو الملاريا.

Introduction

CR1 (استكمال مستقبلات النوع 1، CD35) هو 200 كيلو دا بروتين سكري عبر الغشاء الموجود على سطح العديد من أنواع الخلايا، مثل كريات الدم الحمراء1،B الخلايا الليمفاوية2،الخلايا الأحادية، بعض الخلايا التائية،خلايادالجريب 3، الخلايا الفلكية الجنينية4،والخلايا البوائية الكروية5. CR1 التدخل مع ليغاندس C3b, C4b, C3bi6,,7,,8,,9,وحدة فرعية من مكون تكملة الأولى, C1q10 و MBL (المنان ملزمة lectin)11 يمنع تفعيل تكملة وتشارك في استجابة المناعة الفكاهية والخلوية.

في الرئيسيات ، بما في ذلك البشر ، تشارك كريات الدم الحمراء CR1 في نقل المجمعات المناعية إلى الكبد والطحال ، لتنقية الدم ومنع تراكمها في الأنسجة الضعيفة مثل الجلد أو الكلى12،13،14. هذه الظاهرة من التصاق المناعة بين المجمعات المناعية والكريات الحمراء يعتمد على عدد جزيئات CR115. في البشر ، فإن متوسط كثافة CR1 /E هو 500 فقط (أي 500 جزيء من CR1 لكل إريثروسيت). تختلف هذه الكثافة من فرد إلى آخر (100-1200 CR1/E) ومن كريات حمراء إلى أخرى في نفس الشخص. بعض الأفراد من النمط الظاهري "فارغة" التعبير عن أقل من 20 CR1/E16.

يتم تنظيم كثافة CR1/E من قبل اثنين من أليلات autosomal المشتركة المهيمنة المرتبطة بطفرة نقطة في intron 27 من الترميز الجيني لCR1 * 117،18. تنتج هذه الطفرة موقع تقييد إضافي لإنزيم HindIII. شظايا القيد التي تم الحصول عليها بعد الهضم مع HindIII في هذه الحالة هي 7.4 كيلوبايت للأليل مرتبطة بتعبير قوي من CR1 (H: allele عالية) و 6.9 كيلوبايت للأليل المرتبطة بالتعبير CR1 منخفضة (L: allele منخفضة). تم العثور على هذا الرابط في القوقازيين والآسيويين ولكن ليس في السكان المنحدرين من أصل أفريقي19.

ويرتبط أيضا مستوى التعبير عن ERythrocyte CR1 مع وجود الطفرات النيوكليوتيدات نقطة في exon 13 ترميز SCR 10 (I643T) وفي exon 19 ترميز SCR16 (Q981H). وهو مرتفع في homozygous 643I/981Q وانخفاض في homozygous 643T/981H الأفراد20. وهكذا، يعبر الأفراد "المنخفضون" عن حوالي 150 CR1/E، ويعبر الأفراد "المتوسطون" عن حوالي 500 CR1/E، ويعبر الأفراد "المرتفعون" عن حوالي 1000 CR1/E.

بالإضافة إلى تعدد الأشكال كثافة الكريات الحمراء هذا ، يتميز CR1 بتعدد الأشكال الطول المطابق لأربعة أنماط من الأحجام المختلفة: CR1 * 1 (190 kDa) ، CR1 * 2 (220 kDa) ، CR1 * 3 (160 kDa) ، وCR1 * 4 (250 kDa)21 وتعدد الأشكال المضادة للطبيعة المقابلة لمجموعة الدم KN22.

نقدم طريقتنا على أساس قياس التدفق الخلوي لتحديد كثافة CR1/E. باستخدام ثلاثة مواضيع تعرف كثافتها CR1/E، يعبر عن مستوى كثافة منخفض (180 CR1/E)، ومستوى كثافة متوسطة (646 CR1/E)، ومستوى كثافة عالية (966 CR1/E)، فمن السهل قياس شدة الفلورسال (MFI) المنخفضة لخلايا الدم الحمراء أو خلايا الدم الحمراء (RBC)، أو RBC MFI، بعد المكافحة المناعية لـ CR1 باستخدام مقياس تدفق. يمكن للمرء بعد ذلك رسم خط قياسي يمثل MFI كدالة لكثافة CR1/E. قياس MFI من المواضيع التي CR1 / E كثافة غير معروفة ومقارنتها مع هذا الخط القياسي ، فمن الممكن تحديد الأفراد CR1 / E كثافة. وقد استخدمت هذه التقنية لسنوات عديدة في المختبر، ومكنتنا من الكشف عن انخفاض في التعبير عن الكريات الحمراء CR1 في العديد من الأمراض مثل الذئبة الجهازية (SLE)23،متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز)24، الملاريا25، ومؤخرا مرض الزهايمر (AD)26،27. تطوير الأدوية التي تستهدف CR1 إلى زوجين مع كريات الدم الحمراء، كما هو الحال في الأدوية المضادة للتجلط28 يتطلب تقييم كثافة CR1/E، وتوافر تقنية قوية لتحديد CR1.

عرض البروتوكول أشواط في singlicate. وهو قابل للتكيف لتحديد كثافة CR1/E على العديد من الأفراد باستخدام 96 لوحات بئر محددة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد). لتحقيق هذه الغاية، فمن السهل لتكييف طريقتنا إلى أي لوحة جيدة 96. لكل عينة، يتم توزيع تعليق الخلية من كريات الدم الحمراء (0.5 × 106- 1 × 106 كريات الدم الحمراء) لكل بئر. لكل بئر، أولاً يتم إضافة الأجسام المضادة لCR1 الأولية، ثم العقدية PE، والجسم المضاد الثانوي المضاد للستريبتافيدين، ومرة أخرى streptavidin PE، وذلك باستخدام نفس التخفيفات مثل تلك من طريقتنا، ولكن عن طريق تكييف وحدات التخزين واحترام التناسب.

وينبغي سحب عينات الدم من مواضيع النطاق ومن المواضيع التي يتعين قياسها كميا ً لـ CR1 في نفس الوقت، وتخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، والتعامل معها عند 4 درجات مئوية (على الثلج و/أو في الثلاجة).

Protocol

وقد استعرضت لجنة الأخلاقيات الإقليمية بروتوكول جمع الدم البشري والتعامل معه ووافقت عليه، ورقم البروتوكول هو 2011-A00594-37. ولأن البروتوكول التالي يصف التعامل مع الدم البشري، ينبغي اتباع مبادئ توجيهية مؤسسية للتخلص من المواد الخطيرة بيولوجياً. يجب ارتداء معدات السلامة المختبرية، مثل معاطف المختبر والقفازات.

1. غسل كريات الدم الحمراء

ملاحظة: في اليوم السابق للمعالجة، قم بإعداد عازل PBS-BSA مع محلول ملافي احتياطي للفوسفات (PBS) يحتوي على 0.15٪ من ألبوم مصل البقر (BSA) ووضعه في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. سيتم استخدام هذا المخزن المؤقت كمخزن مؤقت للغسيل وكمخزن مؤقت للتخفيف.

  1. Pipette 20 مل من PBS-BSA في أنبوب 50 مل.
  2. يستنشق 250 ميكرولتر من حمض رباعي الأتراسيك الإثيلين الصوديوم (EDTA) الدم الكامل المضاد للتخثر من أنابيب تخزين الدم وإضافة إلى الأنبوب الذي يحتوي على 20 مل من PBS-BSA. أغلق الأنبوب عن طريق الشد الغطاء. مزيج بلطف عن طريق عكس أنبوب 2x.
  3. طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 430 × غرام. إزالة وتجاهل supernatant باستخدام ماصة 10 مل. إعادة تعليق بيليه في الحجم المتبقي من supernatant عن طريق الأنابيب لطيف ودقيق.
  4. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني بارد-BSA (4 درجة مئوية) في أنبوب يحتوي على بيليه. طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 430 × غرام. إزالة وتجاهل supernatant باستخدام ماصة 10 مل.
  5. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني بارد-BSA (4 درجة مئوية) في أنبوب يحتوي على بيليه. طرد مركزي الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 430 × غرام. اترك الأنبوب في جهاز الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجة مئوية واذهب إلى القسم 2.

2. تخفيف كريات الدم الحمراء

  1. Pipette 3 مل من PBS-BSA الباردة في أنبوب 50 مل وتخزينها في 4 درجة مئوية على رف في الجليد.
  2. وضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على كريات الدم الحمراء (الخطوة 1.4) على رف وضعت في الجليد.
  3. ماصة 8 ميكرولتر من كريات كريات الدم الحمراء باستخدام الماصة وإضافة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على 3 مل من PBS-BSA للحصول على تخفيف كريات الدم الحمراء. اخلط الأنبوب يدويًا للحصول على تعليق متجانس للخلايا الحمراء.

3. الكريات الحمراء المناعية

  1. ماصة 100 ميكرولتر من تخفيف كريات الدم الحمراء (تم الحصول عليها في القسم 4) وإضافة إلى أنابيب 1.4 مل.
  2. طرد مركزي أنابيب لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية في 430 × ز. أثناء الطرد المركزي، قم بإعداد تخفيف للجسم المضاد الحيوي الضئيل لـ CR1 J3D3 بتركيز 0.05 ميكروغرام/ميكرولتر في المخزن المؤقت PBS-BSA.
  3. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بإزالة وتجاهل supernatant.
  4. إضافة 20 ميكرولتر من مضادات الحيوية CR1 J3D3 مباشرة إلى بيليه. لإعداد عنصر التحكم السلبي، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS-BSA بدلاً من ذلك. اخلطي الأنابيب بلطف واحتضنتلمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  5. بعد 45 دقيقة من الحضانة، أضف 750 ميكرولتر من PBS-BSA إلى الأنابيب. طرد مركزي أنابيب لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية في 430 × ز. إزالة وتجاهل supernatant. كرر.
  6. في غضون ذلك، إعداد تخفيف 1:10 من العقديات فيكويرثيرين المخفف في العازلة PBS-BSA. Pipette 20 μL من تخفيف 1:10 من العقديات فيكويريثرين وإضافة إلى الأنابيب. اخلطي الأنابيب بلطف واحتضنتلمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  7. إضافة 750 ميكرولتر من الحاجز PBS-BSA في الأنابيب. اخلطي جيداً والطرد المركزي لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 430 × غرام. إزالة وتجاهل supernatant. كرر.
  8. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة للستستريبتافين المخففة في عازل PBS-BSA.
  9. بمجرد الانتهاء من الطرد المركزي ، قم بإزالة وتجاهل supernatant.
  10. Pipette 20 μL من تخفيف 1:100 من مضادات العقديات في الأنابيب. اخلطي الأنابيب بلطف. احتضان أنابيب لمدة 45 دقيقة في 4 °C.
  11. بعد 45 دقيقة من الحضانة، ماصة 750 ميكرولتر من الحاجز PBS-BSA وإضافة إلى الأنابيب. طرد مركزي أنابيب لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية في 430 × ز. إزالة وتجاهل supernatant. كرر.
  12. Pipette 20 μL من تخفيف 1:10 من العقديات فيكويريثرين وإضافة إلى الأنابيب. اخلطي الأنابيب بلطف. احتضان أنابيب لمدة 45 دقيقة في 4 °C.
  13. مابيت 750 ميكرولتر من الحاجز PBS-BSA وإضافة إلى الأنابيب. اخلط جيدا وطارد الأنابيب لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 430 × غرام. إزالة وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة 2x.

4. تثبيت الكريات الحمراء المنفطس المناعي

  1. خلال الطرد المركزي الأخير، وإعداد المخزن المؤقت التثبيت، والتخفيف 1:100 من الفورمالديهايد 37٪ باستخدام الغسيل المؤقت PBS-BSA.
  2. ماصة 450 ميكرولتر من تثبيت المخزن المؤقت وإضافة إلى أنابيب الكريات الحمراء الملطخة بمناعة (من الخطوة 3.13) في حين دوامة لمدة 5 ق.
  3. Pipette جميع الخلايا الثابتة في أنابيب قاع مستديرة 5 مل وتخزينها في الثلاجة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا لمدة تصل إلى 48 ساعة.

5. تدفق تحليل قياس الخلايا من كريات الدم الحمراء الملطخة

ملاحظة: من المستحسن الإشارة إلى دليل المشغل للمقياس الخلوي (انظر جدول المواد)لمعرفة كيفية إجراء قراءات القياس الخلوي. تنطبق المعلمات المقترحة أدناه على الأداة المستخدمة ويجب تحسينها لكل مقياس للخلايا.

  1. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي، ثم قم بتشغيل الكمبيوتر. السماح للاستقرار درجة حرارة النظام البصري عن طريق تركها على لمدة 30 دقيقة. تحقق من نافذة مقياس الخلايا في البرنامج للتأكد من أن يتم توصيل مقياس الخلايا إلى محطة العمل (يتم عرض الرسالة Cytometer متصل).
  2. تأكد من أن حاوية المخزن المؤقت ممتلئة وأن حاوية النفايات فارغة. إزالة فقاعات الهواء في عامل تصفية المخزن المؤقت وخط المخزن المؤقت باستخدام نظام التطهير. رئيس نظام fluidics عن طريق الضغط على زر رئيس الوزراء على وحدة التحكم في مقياس الخلايا. انتظر حتى يتغير ضوء المؤشر من الأحمر إلى الأخضر.
  3. لتنظيف السوائل، قم بتركيب أنبوب يحتوي على 3 مل من محلول التنظيف على منفذ حقن العينة والسماح لمحلول التنظيف بالتشغيل لمدة 5 دقيقة مع معدل تدفق عينة مرتفع. كرر هذا مع محلول الشطف بالماء المقطر. اترك الأنبوب الذي يحتوي على الماء على منفذ حقن العينة.
  4. لإعداد الخرز معايرة، ماصة 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الجزء السفلي من أنبوب أسفل الجولة. خلط أسهم خرز بقوة عن طريق دوامة لمدة 30 ق. إضافة قطرة إلى أنبوب القاع الجولة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. مزيج بعناية عن طريق الدوامة لمدة 30 ق.
  5. تشغيل التحقق من الأداء. افتح وحدة إعداد وتتبع مقياس الخلايا في البرنامج(الشكل 1A). تحقق من صحة تكوين مقياس الخلايا للتجربة باستخدام المناعة PEstaining. تحقق من صحة دفعة حزة المعايرة مع التكوين.
  6. تثبيت أنبوب حزة على منفذ حقن العينة والسماح لها تشغيل مع انخفاض معدل تدفق العينة. تشغيل فحص الأداء، الذي يستغرق حوالي 5 دقيقة لإكمال). بمجرد اكتمال فحص الأداء، تحقق من أن أداء مقياس الخلايا مرضٍ(الشكل 1B). أغلق وحدة إعداد وقياس الخلايا وتتبعها في البرنامج.
  7. لإعداد تجربة وإنشاء إعدادات التطبيق، انقر فوق زر التجربة الجديدة على شريط أدوات المستعرض وافتح التجربة الجديدة. حدد المعلمات عن طريق تحديد إعدادات مقياس الخلايا المناسبة: التشتت الأمامي (FSC) وتشتت الجانب (SSC) وPE من القائمة المنسدلة للتجربة(الشكل 1C). حدد الوضع الخطي لمعلمة FSC ووضع لوغاريتم لمعلمات SSC و PE.
  8. في التجربة المفتوحة، حدد إعدادات مقياس Cytometer (الشكل 1D)،ثم حدد إعدادات التطبيق،وأنشئ ورقة عمل عمومية(الشكل 1E). استخدام مربعات رمادية ومرمى لتوجيه التحسين.
  9. تحميل أنبوب التحكم غير الملطخة على مقياس الخلايا وتشغيل اقتناء. تأكد من أن عدد السكان من الفائدة (أي RBCs) على نطاق واسع من خلال تحسين الفولتية FSC و SSC. تحسين قيمة عتبة FSC لإزالة الحطام دون التدخل في عدد السكان ذوي الاهتمام.
  10. رسم بوابة حول RBCs على FSC مقابل SSC المؤامرة. عرض السكان RBC في مؤامرة نقطة من الفلورسينس PE. إذا لزم الأمر، وزيادة الفلورسال من أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) الفولتية لوضع السكان السلبية داخل مربعات رمادية. قم بتفريغ أنبوب التحكم غير الملطخ من مقياس الخلايا.
  11. تحقق من أن السكان الإيجابيين على نطاق واسع. تحميل أنبوب التحكم الملون على مقياس الخلايا وتشغيل الاستحواذ. خفض الجهد PMT للسكان إيجابية إذا كان خارج النطاق حتى يمكن رؤية السكان إيجابية تماما على نطاق. ثم تفريغ العينة الملونة.
  12. لتسجيل وتحليل العينات، على ورقة عمل عمومية جديدة، قم بإنشاء المؤامرات التالية لمعاينة البيانات: 1) FSC مقابل SSC، و 2) مخطط بياني PE fluorescence. تحميل العينة الأولى على مقياس الخلايا وتشغيل اقتناء.
  13. رسم بوابة RBC حول كريات الدم الحمراء على FSC مقابل SSC المؤامرة. عرض عدد سكان RBC في الرسم البياني PE fluorescence. في طريقة عرض الإحصائيات، حدد المتوسط لمعلمات الفلورسين سب على مجموعات الموارد الوراثية(الشكل 1F).
  14. في لوحة معلومات الاستحواذ، حدد جميع الأحداث في بوابة الإيقاف و10,000 حدث لتسجيل(الشكل 1G). انقر فوق تسجيل البيانات. عند اكتمال تسجيل الحدث، قم بإزالة الأنبوب الأول من مقياس الخلايا. يجب أن تبدو قطع ورقة العمل العمومية مثل تلك الموجودة في الشكل 2.
  15. تحميل العينات التالية وتسجيلها.

6. تحديد كثافة كريات الدم الحمراء CR1

  1. خذ قيم متوسط كثافة الفلورسينس من العينات المقابلة للموضوع "المنخفض"(الشكل 3، الجدول الأول، RBC MFI) ، الموضوع "المتوسط"(الشكل 4، الجدول D، RBC MFI) ، الموضوع "العالي"(الشكل 4، الجدول الأول، RBC MFI) ، وإلى عينة التحكم السلبية(الشكل 3، الجدول الأول، RBC MFI).
  2. على الرسم البياني الذي يمثل متوسط كثافة الفلورسان كدالة لكثافة CR1 ، ضع النقاط الأربع المقابلة للتحكم السلبي ، والموضوع "المنخفض" ، والموضوع "المتوسط" ، والموضوع "العالي" (النقاط الزرقاء ، الشكل 6).
  3. رسم خط الانحدار للحصول على خط المعايرة ومعادلته.
  4. خذ قيم شدة الفلورسينس المتوسط للعينات المقابلة للمواضيع التي سيتم تحديد كثافتها. (الشكل5، الجدولين D وأنا، RBC MFI).
  5. الحصول على المعادلة عن طريق استبدال "Y" باستخدام قيم متوسط كثافة الفلورسينس، وحساب كثافة CR1/E(الشكل 6).
  6. تحقق من الرسم البياني الذي يتوافق متوسط قيم كثافة الفلورسان وكثافة CR1/E المحددة مع نقطة على خط المعايرة(الشكل 6).

النتائج

الكريات الحمراء من ثلاثة مواضيع التي من المعروف كثافة CR1 ("منخفضة" الموضوع [180 CR1/E], موضوع "متوسط" [646 CR1/E]، وموضوع "عالية" [966 CR1/E])، ومن بين اثنين من المواضيع التي كثافة CR1 التي تحتاج إلى تحديد كانت مناعية من قبل الأجسام المضادة المضادة لCR1 إلى جانب نظام تضخيم باستخدام فلوروكروم phycoerythrin. في البداية...

Discussion

تتوفر العديد من التقنيات لتحديد كثافة الكريات الدم الحمراء CR1 (CR1/E). وكانت التقنيات الأولى المستخدمة agglutination من خلايا الدم الحمراء من قبل الأجسام المضادة المضادة لCR131 وتشكيل الورود في وجود كريات الدم الحمراء المغلفة مع C3b32. تم استبدال هذه التقنيات البدائية بسرعة ب?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر جميع أعضاء URCACyt ، منصة قياس الخلايا التدفق ، وموظفي قسم علم المناعة ، وموظفي قسم الطب الباطني وطب الشيخوخة ، الذين ساهموا في تحسين البروتوكول والتحقق من صحته. تم تمويل هذا العمل من قبل مستشفيات جامعة ريمس (رقم المنحة AOL11UF9156).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

References

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 CR1 CD35 C3b C4b CR1 erythematosus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved