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Resumen

El objetivo de este método es determinar la densidad CR1 en los eritrocitos de cualquier sujeto comparando con tres sujetos cuya densidad de eritrocitos CR1 se conoce. El método utiliza citometría de flujo después de la inmunomancha de los eritrocitos de los sujetos por un anticuerpo monoclonal anti-CR1 acoplado a un sistema amplificado utilizando fileeritrina (PE).

Resumen

CR1 (CD35, Receptor De complemento tipo 1 para C3b/C4b) es una glicoproteína de membrana de alto peso molecular de unos 200 kDa que controla la activación de complemento, transporta complejos inmunológicos y participa en respuestas inmunitarias humorales y celulares. CR1 está presente en la superficie de muchos tipos de células, incluyendo eritrocitos, y exhibe polimorfismos en longitud, estructura (Knops, o KN, grupo sanguíneo), y densidad. La densidad media de CR1 por eritrocitos (CR1/E) es de 500 moléculas por eritrocitos. Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Presentamos aquí un método de citometría de flujo robusto para medir la densidad de CR1/E, incluso en sujetos que expresan una baja densidad, con la ayuda de un sistema de inmunomancha amplificante. Este método nos ha permitido mostrar la disminución de la expresión de eritrocitos CR1 en enfermedades como la enfermedad de Alzheimer (AD), el lupus eritematoso sistémico (LES), el SIDA o la malaria.

Introducción

CR1 (receptor de complemento tipo 1, CD35) es una glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente en la superficie de muchos tipos de células, tales como eritrocitos1, linfocitos B2, células monocíticas, algunas células T, células dendríticas foliculares3, astrocitos fetales4,y podocitos glomerulares5. CR1 interfiriendo con sus ligandos C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una subunidad del primer componente de complemento, C1q10 y MBL (lectina de unión al mannan)11 inhibe la activación del complemento y participa en la respuesta inmune humoral y celular.

En primates, incluidos los humanos, eritrocitos CR1 participa en el transporte de complejos inmunes al hígado y al bazo, para purificar la sangre y prevenir su acumulación en tejidos vulnerables como la piel o los riñones12,,13,,14. Este fenómeno de adhesión inmune entre complejos inmunes y eritrocitos depende del número de moléculas CR115. En los seres humanos, la densidad media de CR1/E es de sólo 500 (es decir, 500 moléculas de CR1 por eritrocitos). Esta densidad varía de un individuo a otro (100–1,200 CR1/E) y de un eritrocitos a otro en el mismo individuo. Algunos individuos de fenotipo "nulo" expresan menos de 20 CR1/E16.

La densidad de CR1/E está regulada por dos alelos autosómicos codominantes vinculados a una mutación puntual en el intrón 27 de la codificación genética para CR1*117,,18. Esta mutación produce un sitio de restricción adicional para la enzima HindIII. Los fragmentos de restricción obtenidos después de la digestión con HindIII en este caso son 7,4 kb para el alelo vinculado a una fuerte expresión de CR1 (H: alelo alto) y 6,9 kb para el alelo vinculado a la expresión baja de CR1 (L: alelo bajo). Este enlace se encuentra en los caucásicos y asiáticos, pero no en las personas de ascendencia africana19.

El nivel de expresión de eritrocitos CR1 también está correlacionado con la presencia de mutaciones de nucleótidos puntuales en el exón 13 codificando SCR 10 (I643T) y en el exón 19 codificando SCR16 (Q981H). Es alto en individuos homocigotos 643I/981Q y bajos en individuos homocigotos 643T/981H20. Por lo tanto, los individuos "bajos" expresan alrededor de 150 CR1/E, los individuos "medios" expresan alrededor de 500 individuos CR1/E, y los individuos "altos" expresan alrededor de 1,000 CR1/E.

Además de este polimorfismo de densidad de eritrocitos, CR1 se caracteriza por un polimorfismo de longitud correspondiente a cuatro alotipos de diferentes tamaños: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) y CR1*4 (250 kDa)21 y un polimorfismo antigénico correspondiente al grupo sanguíneo KN22.

Presentamos nuestro método basado en la citometría de flujo para determinar la densidad de CR1/E. Utilizando tres sujetos cuya densidad CR1/E se conoce, expresando un nivel de baja densidad (180 CR1/E), un nivel de densidad media (646 CR1/E) y un nivel de densidad alto (966 CR1/E), es fácil medir la intensidad media de fluorescencia (MFI) de sus eritrocitos o glóbulos rojos (RBC), o RBC MFI, después de la inmunomancha anti-CR1 utilizando un citómetro de flujo. A continuación, se puede trazar una línea estándar que representa la IMF en función de la densidad CR1/E. La medición de la IMF de sujetos cuya densidad CR1/E no se conoce y compararla con esta línea estándar, es posible determinar la densidad CR1/E de los individuos. Esta técnica se ha utilizado durante muchos años en el laboratorio, y nos ha permitido detectar una reducción en la expresión de eritrocitos CR1 en muchas patologías como el lupus eritematoso sistémico (LES)23, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)24, malaria25,y recientemente la enfermedad de Alzheimer (AD)26,27. El desarrollo de fármacos dirigidos a CR1 a la pareja de eritrocitos, como en el caso de los fármacos antitrombóticos28 requiere la evaluación de la densidad CR1/E, y la disponibilidad de una técnica robusta para cuantificar CR1.

El protocolo presentado se ejecuta en singlicado. Es adaptable para determinar la densidad de CR1/E en muchas personas utilizando 96 placas de pozo disponibles comercialmente específicas (ver Tabla de Materiales). Para ello, es fácil adaptar nuestro método a cualquier placa de pozo 96. Para cada muestra, se distribuye una suspensión celular de eritrocitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrocitos) por pocto. Para cada pozo, primero se añade el anticuerpo primario anti-CR1, luego la estreptavidina PE, el anticuerpo secundario anti-estreptavidina, y de nuevo la estreptavidina PE, utilizando las mismas diluciones que las de nuestro método, pero adaptando los volúmenes y respetando la proporcionalidad.

Las muestras de sangre de los sujetos de la gama y de los sujetos que deben cuantificarse para CR1 deben extraerse al mismo tiempo, almacenarse en el frigorífico a 4 oC y manipularse a 4 oC (sobre hielo y/o en el frigorífico).

Protocolo

El protocolo para la recolección y el manejo de la sangre humana fue revisado y aprobado por el comité de ética regional (CPP Est II), y el número de protocolo es 2011-A00594-37. Debido a que el siguiente protocolo describe el manejo de la sangre humana, se deben seguir las pautas institucionales para la eliminación de material biopeligroso. Se debe usar equipo de seguridad de laboratorio, como batas de laboratorio y guantes.

1. Lavado de eritrocitos

NOTA: El día antes de manipularlo, prepare un tampón PBS-BSA con solución salina tamponada de fosfato (PBS) que contenga el 0,15% de la albúmina sérica bovina (BSA) y colóquelo en el refrigerador a 4 oC. Este tampón se utilizará como tampón de lavado y como tampón de dilución.

  1. Pipetear 20 ml de PBS-BSA en un tubo de 50 ml.
  2. Aspirar 250 l de ácido tetraacético de etilendiamina de sodio (EDTA) anticoagular la sangre entera de los tubos de almacenamiento sanguíneo y añadir al tubo que contiene los 20 ml de PBS-BSA. Cierre el tubo atornillando la tapa. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo 2x.
  3. Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml. Resuspenda el pellet en el volumen residual de sobrenadante mediante un pipeteo suave y cuidadoso.
  4. Añadir 20 ml de PBS-BSA frío (4 oC) en el tubo que contiene el pellet. Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante con una pipeta de 10 ml.
  5. Añadir 20 ml de PBS-BSA frío (4 oC) en el tubo que contiene el pellet. Centrifugar el tubo durante 10 min a 4oC a 430 x g. Dejar el tubo en la centrífuga a 4oC y pasar a la sección 2.

2. Dilución de eritrocitos

  1. Pipetear 3 ml de PBS-BSA frío en un tubo de 50 ml y almacenarlo a 4 oC en un estante en hielo.
  2. Coloque el tubo centrifugado que contiene los eritrocitos (paso 1.4) en un estante colocado en hielo.
  3. Pipetear 8 ml de eritrocitos peletados utilizando la pipeta y añadir al tubo de 50 ml que contiene los 3 ml de PBS-BSA para obtener la dilución de eritrocitos. Mezclar el tubo suavemente a mano para obtener una suspensión celular homogénea de eritrocitos.

3. Inmunomanchado de eritrocitos

  1. Pipetear 100 l de dilución de eritrocitos (obtenido en la sección 4) y añadir a tubos de 1,4 ml.
  2. Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Durante la centrifugación, prepare una dilución del anticuerpo biotinilado anti-CR1 J3D3 a una concentración de 0,05 g/l en el tampón PBS-BSA.
  3. Una vez realizada la centrifugación, retire y deseche el sobrenadante.
  4. Añadir 20 ml de anti-CR1 J3D3 biotinilado directamente al pellet. Para preparar el control negativo, agregue 20 ml de búfer PBS-BSA en su lugar. Mezclar los tubos suavemente e incubar durante 45 min a 4 oC.
  5. Después de 45 min de incubación, añadir 750 éL de PBS-BSA a los tubos. Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
  6. Mientras tanto, prepare una dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerytrerina diluida en el tampón PBS-BSA. Pipetear 20 l de la dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerythrina y añadir a los tubos. Mezclar los tubos suavemente e incubar durante 45 min a 4 oC.
  7. Agregue 750 l de búfer PBS-BSA en los tubos. Mezclar bien y centrifugar durante 5 min a 4 oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
  8. Durante la centrifugación, prepare una dilución 1:100 de anticuerpo anti-estreptavidina biotintilado diluido en el tampón PBS-BSA.
  9. Una vez realizada la centrifugación, retire y deseche el sobrenadante.
  10. Pipeta 20 l de la dilución 1:100 de antiestreptavidina biotincada en los tubos. Mezclar los tubos suavemente. Incubar los tubos durante 45 min a 4oC.
  11. Después de 45 min de incubación, pipeta 750 l de tampón PBS-BSA y añadir en los tubos. Centrifugar los tubos durante 5 min a 4oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repetir.
  12. Pipetear 20 l de la dilución 1:10 de estreptavidina-ficoerythrina y añadir en los tubos. Mezclar los tubos suavemente. Incubar los tubos durante 45 min a 4oC.
  13. Pipetear 750 l de tampón PBS-BSA y añadir en los tubos. Mezclar bien y centrifugar los tubos durante 5 min a 4 oC a 430 x g. Retire y deseche el sobrenadante. Repita este paso 2x.

4. Fijación de eritrocitos inmunomanchados

  1. Durante la última centrifugación, prepare el tampón de fijación, una dilución de 1:100 de formaldehído del 37% utilizando el tampón de lavado PBS-BSA.
  2. Pipetear 450 l de tampón de fijación y añadir en tubos de eritrocitos inmuno-manchados (a partir del paso 3.13) mientras se revuelve durante 5 s.
  3. Pipetear todas las células fijas en tubos inferiores redondos de 5 ml y almacenar en el refrigerador.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí durante un máximo de 48 horas.

5. Análisis de citometría de flujo de eritrocitos manchados

NOTA: Es aconsejable consultar el manual del operador para el citómetro (ver Tabla de Materiales)para saber cómo realizar las lecturas citométricas. Los parámetros sugeridos a continuación se aplican al instrumento utilizado y deben optimizarse para cada citómetro.

  1. Encienda el citometro de flujo y, a continuación, encienda el ordenador. Deje que la temperatura del sistema óptico se estabilice dejándola encendida durante 30 minutos. Compruebe la ventana del citómetro en el software para asegurarse de que el citómetro está conectado a la estación de trabajo (se muestra el mensaje Citómetro conectado).
  2. Compruebe que el contenedor de búfer está lleno y que el contenedor de residuos está vacío. Retire las burbujas de aire en el filtro de búfer y la línea de búfer utilizando el sistema de purga. Pprime el sistema de fluidos pulsando el botón Prime en la consola del catómetro. Espere hasta que la luz indicadora cambie de rojo a verde.
  3. Para limpiar los fluidos, instale un tubo que contenga 3 ml de una solución de limpieza en el puerto de inyección de muestra y permita que la solución de limpieza funcione durante 5 minutos con un alto caudal de muestra. Repita esto con la solución de enjuague con agua destilada. Deje el tubo que contiene agua en el puerto de inyección de la muestra.
  4. Para preparar las perlas de calibración, pipeta 400 l de PBS en la parte inferior de un tubo inferior redondo. Mezclar las existencias de cuentas fuertemente por vórtice durante 30 s. Añadir una gota al tubo inferior redondo que contiene PBS. Mezclar cuidadosamente por vórtice durante 30 s.
  5. Ejecute la comprobación de rendimiento. Abra el módulo Configuración y seguimiento del citometro en el software(Figura 1A). Verifique que la configuración del catómetro sea correcta para el experimento con inmunomancha doliente de PE. Compruebe que el lote de perlas de calibración es correcto con la configuración.
  6. Instale el tubo de cordón en el puerto de inyección de muestras y déjelo funcionar con un caudal de muestra bajo. Ejecute la comprobación de rendimiento, que tarda aproximadamente 5 minutos en completarse). Una vez completada la comprobación de rendimiento, compruebe que el rendimiento del cytómetro es satisfactorio(Figura 1B). Cierre el módulo de configuración y seguimiento del citómetro en el software.
  7. Para configurar un experimento y crear la configuración de la aplicación, haga clic en el botón Nuevo experimento de la barra de herramientas del explorador y abra el nuevo experimento. Especifique los parámetros seleccionando la configuración del citómetro adecuado: Dispersión hacia delante (FSC), Dispersión lateral (SSC) y PE en el menú desplegable del experimento(Figura 1C). Seleccione Modo lineal para el parámetro FSC y Modo de lagarithm para los parámetros SSC y PE.
  8. En el experimento abierto, seleccione Configuración del citómetro (figura 1D) y, a continuación, seleccione Configuración de la aplicacióny cree una hoja de cálculo global(Figura 1E). Utilice los cuadros grises y el punto de mira para guiar la optimización.
  9. Cargue el tubo de control sin mancha en el citómetro y ejecute Adquisición. Asegúrese de que la población de interés (es decir, los glóbulos rojos) esté a escala optimizando los voltajes FSC y SSC. Optimice el valor umbral FSC para eliminar los desechos sin interferir con la población de interés.
  10. Dibuje una puerta alrededor de los RCO en la gráfica FSC vs. Muestre la población de RBC en la gráfica de puntos de fluorescencia PE. Si es necesario, aumente la fluorescencia de los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) para colocar la población negativa dentro de las cajas grises. Descargue el tubo de control sin manchar del catómetro.
  11. Compruebe que las poblaciones positivas están a escala. Cargue el tubo de control manchado en el citómetro y ejecute Adquisición. Reduzca el voltaje de la PMT para la población positiva si está fuera de escala hasta que la población positiva pueda verse completamente a escala. A continuación, descargue la muestra manchada.
  12. Para registrar y analizar muestras, en una nueva hoja de trabajo global, cree las siguientes gráficas para obtener una vista previa de los datos: 1) FSC vs SSC y 2) histograma de fluorescencia PE. Cargue la primera muestra en el citómetro y ejecute Adquisición.
  13. Dibuje una puerta de RBC alrededor de los eritrocitos en la gráfica FSC vs. Visualice la población de RBC en el histograma de fluorescencia PE. En la vista Estadísticas, seleccione la media para los parámetros de fluorescencia de PE en las poblaciones GR(Figura 1F).
  14. En el panel Adquisición, seleccione todos los eventos de la puerta de detención y 10.000 eventos que se grabarán(figura 1G). Haga clic en Registrar datos. Cuando se haya completado la grabación del evento, retire el primer tubo del citometro. Las gráficas de hoja de cálculo global deben ser similares a las de la Figura 2.
  15. Cargue los siguientes ejemplos y regístrelos.

6. Determinación de la densidad del eritrocitos CR1

  1. Tomar los valores de las intensidades medias de fluorescencia de las muestras correspondientes al sujeto "bajo"(Figura 3, Tabla I,RBC MFI), sujeto "medio"(Figura 4, Tabla D, RBC MFI), sujeto "alto"(Figura 4, Tabla I, RBC MFI), y a la muestra de control negativo(Figura 3, Tabla I, RBC MFI).
  2. En un gráfico que represente la intensidad media de fluorescencia en función de la densidad de CR1, coloque los cuatro puntos correspondientes al control negativo, el sujeto "bajo", el sujeto "medio" y el sujeto "alto" (puntos azules, Figura 6).
  3. Dibuje la línea de regresión para obtener la línea de calibración y su ecuación.
  4. Tomar los valores de la intensidad media de fluorescencia de las muestras correspondientes a los sujetos cuya densidad debe determinarse. (Figura5, Tablas D y I, RBC MFI).
  5. Obtenga la ecuación reemplazando "Y" utilizando los valores de las intensidades medias de fluorescencia, y calcule la densidad de CR1/E(Figura 6).
  6. Compruebe en el gráfico que los valores medios de intensidad de fluorescencia y la densidad CR1/E determinada corresponden a un punto de la línea de calibración(Figura 6).

Resultados

Los eritrocitos de tres sujetos cuya densidad de CR1 se conoce ("sujeto bajo" [180 CR1/E], sujeto "medio" [646 CR1/E] y sujeto "alto" [966 CR1/E]), y de dos sujetos cuya densidad CR1 debía determinarse fueron inmunomanchados por un anticuerpo anti-CR1 acoplado a un sistema de amplificación utilizando la fluoracrotrina fierrín. Al principio, la densidad CR1 de los sujetos del rango bajo-alto fue determinada por el método Scatchard29 utilizando anticuerpos radiomarcados. Los estándares (bajos, ...

Discusión

Hay varias técnicas disponibles para determinar la densidad del eritrocito CR1 (CR1/E). Las primeras técnicas utilizadas fueron la aglutinación de glóbulos rojos por anticuerpos anti-CR131 y la formación de rosetas en presencia de eritrocitos recubiertos con C3b32. Estas técnicas rudimentarias fueron rápidamente reemplazadas por métodos de inmunomancha utilizando anticuerpos radiomarcados anti-CR11,33. Tambi...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a todos los miembros de la URCACyt, plataforma técnica de citometría de flujo, el personal del Departamento de Inmunología, y el personal del Departamento de Medicina Interna y Geriatría, que contribuyeron a optimizar y validar el protocolo. Este trabajo fue financiado por los hospitales universitarios de Reims (número de subvención AOL11UF9156).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

Referencias

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