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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Lo scopo di questo metodo è quello di determinare la densità di CR1 negli eritrociti di qualsiasi soggetto confrontandosi con tre soggetti la cui densità di eritrocito CR1 è nota. Il metodo utilizza la citometria di flusso dopo l'immunostaining degli eritrociti dei soggetti da parte di un anticorpo monoclonale anti-CR1 accoppiato a un sistema amplificato utilizzando la ficoerythrina (PE).

Abstract

CR1 (CD35, Complement Receptor tipo 1 per C3b/C4b) è una glicoproteina a membrana ad alto peso molecolare di circa 200 kDa che controlla l'attivazione del complemento, trasporta i complessi immunitari e partecipa alle risposte immunitarie umorali e cellulari. CR1 è presente sulla superficie di molti tipi di cellule, tra cui eritrociti, ed esibisce polimorfismi in lunghezza, struttura (Knops, o KN, gruppo sanguigno), e densità. La densità media di CR1 per eritrocite (CR1/E) è di 500 molecole per eritrocito. Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Qui presentiamo un robusto metodo di citometria di flusso per misurare la densità di CR1/E, anche in soggetti che esprimono una bassa densità, con l'aiuto di un sistema di immunostaining amplificante. Questo metodo ci ha permesso di mostrare l'abbassamento dell'espressione di cr1 errociti in malattie come il morbo di Alzheimer (AD), il lupus erythematosus (SLE), l'AIDS o la malaria.

Introduzione

CR1 (recettore di complemento di tipo 1, CD35) è una glicoproteina transmembrana da 200 kDa presente sulla superficie di molti tipi di cellule, come gli eritrociti1, B linfociti2, cellule monocitiche, alcune cellule T, cellule dendritiche follicolari3, astrociti fetali4e glomerari podociti5. CR1 che interferisce con i suoi ligandi C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, una sottounità del primo componente complementare, C1q10 e MBL (mannan-leg lectin)11 inibisce l'attivazione del complemento ed è coinvolto nella risposta immunitaria umorale e cellulare.

Nei primati, compresi gli esseri umani, l'eritrocite CR1 è coinvolto nel trasporto di complessi immunitari al fegato e alla milza, per purificare il sangue e prevenirne l'accumulo nei tessuti vulnerabili come la pelle o i reni12,13,14. Questo fenomeno di adesione immunitaria tra complessi immunitari ed eritrociti dipende dal numero di molecole CR115. Nell'uomo, la densità media di CR1/E è solo 500 (cioè 500 molecole di CR1 per eritrocito). Questa densità varia da un individuo all'altro (100-1.200 CR1/E) e da un eritrocito all'altro nello stesso individuo. Alcuni individui di fenotipo "null" esprimono meno di 20 CR1/E16.

La densità di CR1/E è regolata da due alleli autosomici co-dominanti legati a una mutazione puntiforme nell'intron 27 della codifica genica per CR1-117,18. Questa mutazione produce un sito di restrizione aggiuntiva per l'enzima HindIII. I frammenti di restrizione ottenuti dopo la digestione con HindIII in questo caso sono 7,4 kb per l'allele legato a una forte espressione di CR1 (H: high allele) e 6,9 kb per l'allele legato alla bassa espressione CR1 (L: basso allele). Questo collegamento si trova in caucasici e asiatici, ma non in persone di origine africana19.

Il livello di espressione dell'eritrocite CR1 è anche correlato alla presenza di mutazioni di nucleotidi puntuali nella codifica exon 13 SCR 10 (I643T) e nella codifica exon 19 SCR16 (Q981H). È alto in omozigolo 643I/981Q e basso in omozygous 643T/981H individui20. Così, individui "bassi" esprimono circa 150 CR1/E, individui "medi" esprimono circa 500 CR1/E, e le persone "alte" esprimono circa 1.000 CR1/E.

Oltre a questo polimorfismo a densità di eritrociti, CR1 è caratterizzato da un polimorfismo di lunghezza corrispondente a quattro allotipi di diverse dimensioni: CR1,1 (190 kDa), CR1-2 (220 kDa), CR1-3 (160 kDa) e CR1-4 (250 kDa)21 e un antimorfismo corrispondente al gruppo sanguigno KN22.

Presentiamo il nostro metodo basato sulla citometria di flusso per determinare la densità di CR1/E. Utilizzando tre soggetti la cui densità CR1/E è nota, esprimendo un basso livello di densità (180 CR1/E), un livello di densità media (646 CR1/E) e un alto livello di densità (966 CR1/E), è facile misurare l'intensità media di fluorescenza (MFI) dei loro eritrociti o globuli rossi (RBC) o RBC MFI, dopo l'anti-CR1ining utilizzando un citometro a flusso. Si può quindi tracciare una linea standard che rappresenta la MFI in funzione della densità CR1/E. Misurando le MFI di soggetti la cui densità CR1/E non è nota e confrontandola con questa linea standard, è possibile determinare la densità CR1/E degli individui. Questa tecnica è stata utilizzata per molti anni in laboratorio, e ci ha permesso di rilevare una riduzione dell'espressione di eritrocite CR1 in molte patologie come il lupus erythematosos sistemico (SLE)23, Sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS)24,malaria25e recentemente malattia di Alzheimer (AD)26,27. Lo sviluppo di farmaci destinati a CR1 ad accoppiarsi con eritrociti, come nel caso dei farmaci antitroculo28 richiede la valutazione della densità CR1/E e la disponibilità di una tecnica robusta per quantificare CR1.

Il protocollo presentato viene eseguito nel singliatore. È adattabile per determinare la densità di CR1/E su molti individui utilizzando specifiche lastre disponibili in commercio 96 pozze (vedi Tabella dei materiali). A tal fine, è facile adattare il nostro metodo a qualsiasi piastra da 96 pozzi. Per ogni campione, una sospensione cellulare di eritrociti (0,5 x 106–1 x 106 eretrociti) viene distribuita per ogni pozzo. Per ogni pozzo, prima viene aggiunto l'anticorpo anti-CR1 primario, poi streptavidin PE, l'anticorpo anti-streptavidin secondario, e di nuovo streptavidin PE, utilizzando le stesse diluizioni del nostro metodo, ma adattando i volumi e rispettando la proporzionalità.

I campioni di sangue provenienti da soggetti della gamma e da soggetti da quantificare per CR1 devono essere prelevati contemporaneamente, conservati in frigorifero a 4 gradi centigradi e trattati a 4 gradi centigradi (sul ghiaccio e/o in frigorifero).

Protocollo

Il protocollo per la raccolta e la manipolazione del sangue umano è stato rivisto e approvato dal comitato etico regionale (CPP Est II), e il numero di protocollo è 2011-A00594-37. Poiché il seguente protocollo descrive la manipolazione del sangue umano, devono essere seguite linee guida istituzionali per lo smaltimento di materiale biopericoloso. Devono essere indossate attrezzature di sicurezza di laboratorio, come cappotti da laboratorio e guanti.

1. Lavaggio eretritrita

NOTA: Il giorno prima della movimentazione, preparare un buffer PBS-BSA con salina tampina tampone fosfata (PBS) contenente lo 0,15% dell'albumina del siero bovino (BSA) e posizionarlo in frigorifero a 4 gradi centigradi. Questo buffer verrà utilizzato come buffer di lavaggio e come buffer di diluizione.

  1. Pipette 20 mL di PBS-BSA in un tubo da 50 mL.
  2. Aspirare 250 - L di sodio etilenedia acido tetraacetico (EDTA) anticoagulato sangue intero da tubi di stoccaggio del sangue e aggiungere al tubo contenente i 20 mL di PBS-BSA. Chiudere il tubo avvitando il tappo. Mescolare delicatamente invertendo il tubo 2x.
  3. Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il supernatante utilizzando una pipetta da 10 mL. Risospendere il pellet nel volume residuo del supernatante con una leggera e attenta pipettatura.
  4. Aggiungere 20 mL di PBS-BSA freddo (4 gradi centigradi) nel tubo contenente il pellet. Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il supernatante utilizzando una pipetta da 10 mL.
  5. Aggiungere 20 mL di PBS-BSA freddo (4 gradi centigradi) nel tubo contenente il pellet. Centrifugare il tubo per 10 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Lasciare il tubo nella centrifuga a 4 gradi centigradi e passare alla sezione 2.

2. Diluizione eritrociti

  1. Pipette 3 mL di PBS-BSA freddo in un tubo da 50 mL e conservarlo a 4 gradi centigradi su un rack nel ghiaccio.
  2. Mettere il tubo centrifugato contenente gli eritrociti (passaggio 1.4) su un rack posto nel ghiaccio.
  3. Pipette 8 - L di eritrociti pelleta utilizzando la pipetta e aggiungere al tubo da 50 mL contenente il 3 mL di PBS-BSA per ottenere la diluizione eritrocita. Mescolare delicatamente il tubo a mano per ottenere una sospensione omogenea delle cellule degli eritrociti.

3. Immunostaining all'eritrocito

  1. Pipetta 100 - L di diluizione eritrocite (ottenuta nella sezione 4) e aggiunta a tubi da 1,4 mL.
  2. Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Durante la centrifugazione, preparare una diluizione dell'anticorpo biotinylato anti-CR1 J3D3 ad una concentrazione di 0,05 g/l nel buffer PBS-BSA.
  3. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere e scartare il supernatale.
  4. Aggiungere al pellet 20 l di anti-CR1 J3D3 biotinylato. Per preparare il controllo negativo, aggiungere invece 20 l di buffer PBS-BSA. Mescolare delicatamente i tubi e incubare per 45 min a 4 gradi centigradi.
  5. Dopo 45 min di incubazione, aggiungere 750 -L di PBS-BSA ai tubi. Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
  6. Nel frattempo, preparare una diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin diluita nel buffer PBS-BSA. Pipette 20 -L della diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin e aggiungere ai tubi. Mescolare delicatamente i tubi e incubare per 45 min a 4 gradi centigradi.
  7. Aggiungere 750 l di tampone PBS-BSA nei tubi. Mescolare bene e centrifugare per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
  8. Durante la centrifugazione, preparare una diluizione 1:100 dell'anticorpo anti-streptavidinbio biotinylato diluito nel tampone PBS-BSA.
  9. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere e scartare il supernatale.
  10. Pipette 20 -L della diluizione 1:100 di anti-streptavidina biomutata nei tubi. Mescolare delicatamente i tubi. Incubare i tubi per 45 min a 4 gradi centigradi.
  11. Dopo 45 minuti di incubazione, pipetta 750 l di tampone PBS-BSA e aggiungere nei tubi. Centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere.
  12. Pipette 20 -L della diluizione 1:10 di streptavidin-phycoerythrin e aggiungere nei tubi. Mescolare delicatamente i tubi. Incubare i tubi per 45 min a 4 gradi centigradi.
  13. Pipetta 750 L di tampone PBS-BSA e aggiungere nei tubi. Mescolare bene e centrifugare i tubi per 5 min a 4 gradi centigradi a 430 x g. Rimuovere e scartare il super-natante. Ripetere questo passaggio 2x.

4. Fissazione dell'eritrocito immunostaina

  1. Durante l'ultima centrifugazione, preparare il buffer di fissaggio, una diluizione di 1:100 del 37% di formaldeide utilizzando il buffer di lavaggio PBS-BSA.
  2. Pipetta 450 - L di tampone di fissaggio e aggiungere in tubi di eritrocito immunostained (dal punto 3.13) durante il vortice per 5 s.
  3. Pipette tutte le cellule fisse in tubi di fondo rotondi 5 mL e conservare in frigorifero.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui per un massimo di 48 h.

5. Analisi della citometria di flusso degli eritrociti macchiati

NOTA: Si consiglia di fare riferimento al manuale dell'operatore per il citometro (vedi Tabella dei materiali) per sapere come eseguire le letture citometriche. I parametri suggeriti di seguito si applicano allo strumento utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni citometro.

  1. Accendere il citometro di flusso, quindi accendere il computer. Lasciare che la temperatura del sistema ottico si stabilizzi lasciandolo acceso per 30 min. Controllare la finestra del citometro nel software per assicurarsi che il citometro sia collegato alla stazione di lavoro (viene visualizzato il messaggio Cytometer Connected).
  2. Verificare che il contenitore del buffer sia pieno e che il contenitore dei rifiuti sia vuoto. Rimuovere le bolle d'aria nel filtro buffer e la linea del buffer utilizzando il sistema di spurgo. Prime il sistema fluidico premendo il tasto Prime sulla console del citometro. Attendere che la spia dell'indicatore cambi da rosso a verde.
  3. Per pulire la fluidicsità, installare un tubo contenente 3 mL di una soluzione di pulizia sulla porta di iniezione del campione e consentire alla soluzione di pulizia di funzionare per 5 min con un'elevata portata di campionamento. Ripetere l'operazione con la soluzione di risciacquo con acqua distillata. Lasciare il tubo contenente acqua sulla porta di iniezione del campione.
  4. Per preparare le perline di calibrazione, pipetta 400 L di PBS nella parte inferiore di un tubo inferiore rotondo. Mescolare fortemente i supporti di perline vortice per 30 s. Aggiungere una goccia al tubo rotondo inferiore contenente PBS. Mescolare con cura vortice per 30 s.
  5. Eseguire il controllo delle prestazioni. Aprire il modulo Setup e Tracking del citometro nel software ( Figura1A). Verificare che la configurazione del citometro sia corretta per l'esperimento utilizzando l'immunostaining PE. Verificare che il batch di perline di calibrazione sia corretto con la configurazione.
  6. Installare il tubo di perline sulla porta di iniezione del campione e lasciarlo funzionare con una bassa portata di campionamento. Eseguire il controllo delle prestazioni, che richiede circa 5 minuti per il completamento). Una volta completato il controllo delle prestazioni, verificare che le prestazioni del citometro siano soddisfacenti (Figura 1B). Chiudere il modulo Impostazione e monitoraggio del citometro nel software.
  7. Per configurare un esperimento e creare le impostazioni dell'applicazione, fai clic sul pulsante Nuovo esperimento sulla barra degli strumenti del browser e apri il nuovo esperimento. Specificare i parametri selezionando le impostazioni del citometro appropriate: Dispersione in avanti (FSC), Dispersione laterale (SSC) e PE dal menu a discesa dell'esperimento (Figura 1C). Selezionare Modalità lineare per il parametro FSC e Modalità logaritmo per i parametri SSC e PE.
  8. Nell'esperimento aperto selezionare Impostazioni citometro (Figura 1D), quindi Impostazioni applicazionee creare un foglio di lavoro globale (Figura 1E). Utilizzare le caselle grigie e mirino per guidare l'ottimizzazione.
  9. Caricare il tubo di controllo non infilato sul citometro ed eseguire Acquisizione. Assicurarsi che la popolazione di interesse (ad esempio, RBC) sia in scala ottimizzando le tensioni FSC e SSC. Ottimizzare il valore soglia FSC per eliminare i detriti senza interferire con la popolazione di interesse.
  10. Disegnare un cancello intorno agli RBC sul grafico FSC vs SSC. Visualizza la popolazione RBC nella trama a punti della fluorescenza PE. Se necessario, aumentare la fluorescenza delle tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per posizionare la popolazione negativa all'interno delle caselle grigie. Scaricare il tubo di controllo non instanellato dal citometro.
  11. Verificare che le popolazioni positive siano su larga scala. Caricare il tubo di controllo colorato sul citometro ed eseguire acquisizione. Abbassare la tensione di PMT per la popolazione positiva se è fuori scala fino a quando la popolazione positiva può essere visto interamente su scala. Quindi scaricare il campione macchiato.
  12. Per registrare e analizzare gli esempi, in un nuovo foglio di lavoro globale creare i grafici seguenti per l'anteprima dei dati: 1) FSC e SSC e 2) istogramma a fluorescenza PE. Caricare il primo campione sul citometro ed eseguire Acquisizione.
  13. Disegna un cancello RBC intorno agli eritrociti sulla trama FSC contro SSC. Visualizzare la popolazione RBC nell'istogramma della fluorescenza PE. Nella vista Statistiche, selezionare la media per i parametri di fluorescenza PE su popolazioni GR (Figura 1F).
  14. Nel dashboard Acquisizione selezionare tutti gli eventi nel gate di arresto e 10.000 eventi da registrare (Figura 1G). Fare clic su Registra dati. Al termine della registrazione degli eventi, rimuovere il primo tubo dal citometro. I grafici del foglio di lavoro globale dovrebbero essere simili a quelli della Figura 2.
  15. Caricare i campioni seguenti e registrarli.

6. Determinazione della densità dell'eritrocito CR1

  1. Prendere i valori dell'intensità media a fluorescenza dei campioni corrispondenti al soggetto "basso" (Figura 3, Tabella I, RBC MFI), soggetto "medio" ( Figura4, Tabella D, RBC MFI), soggetto "alto" ( Figura4, Tabella I, RBC MFI), e al campione di controllo negativo ( Figura3, Tabella I, RBC MFI).
  2. In un grafico che rappresenta l'intensità media di fluorescenza in funzione della densità di CR1, posizionare i quattro punti corrispondenti al controllo negativo, al soggetto "basso", al soggetto "medio" e al soggetto "alto" (punti blu, figura 6).
  3. Disegnare la retta di regressione per ottenere la retta di calibrazione e la relativa equazione.
  4. Prendere i valori dell'intensità media di fluorescenza dei campioni corrispondenti ai soggetti la cui densità deve essere determinata. (Figura 5, Tabelle D e I, RBC MFI).
  5. Ottenere l'equazione sostituendo "Y" utilizzando i valori delle intensità di fluorescenza media e calcolare la densità di CR1/E (Figura 6).
  6. Controllare sul grafico che i valori medi di intensità a fluorescenza e la densità determinata di CR1/E corrispondano a un punto sulla linea di calibrazione (Figura 6).

Risultati

Gli eritrociti di tre soggetti la cui densità di CR1 è nota ("bassa" [180 CR1/E], soggetto "medio" [646 CR1/E], e soggetto "alto" [966 CR1/E]), e di due soggetti la cui densità di CR1 doveva essere determinata sono stati immunostained da un anti-organismo anti-CR1 accoppiato ad un sistema di amplificazione utilizzando il fisiologia. All'inizio, la densità CR1 dei soggetti della fascia bassa-alta è stata determinata dal metodo Scatchard29 utilizzando anticorpi radioetichettati. Gli standard (b...

Discussione

Sono disponibili diverse tecniche per determinare la densità dell'eritrocito CR1 (CR1/E). Le prime tecniche utilizzate sono state l'agglutinazione dei globuli rossi dagli anticorpi anti-CR131 e la formazione di rosette in presenza di eritrociti rivestiti con C3b32. Queste tecniche rudimentali sono state rapidamente sostituite da metodi di immunostainizzazione utilizzando anticorpi anti-CR1 radioetichettati1,33. È ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo tutti i membri della piattaforma tecnica URCACyt, la piattaforma tecnica di citometria di flusso, lo staff del Dipartimento di Immunologia e lo staff del Dipartimento di Medicina Interna e Geriatria, che hanno contribuito a ottimizzare e convalidare il protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Reims University Hospitals (numero di sovvenzione AOL11UF9156).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

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