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요약

이 방법의 목적은 적혈구 CR1 밀도가 알려진 세 명의 피험체와 비교하여 임의의 적혈구에서 CR1 밀도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 피코에리트린(PE)을 사용하여 증폭된 시스템에 결합된 항 CR1 단일클론 항체에 의한 피험자의 적혈구의 면역 염색 후 유세포분석을 사용한다.

초록

CR1 (CD35, C3b/C4b를 위한 보체 수용체 타입 1)은 약 200 kDa의 고분자량 막 당단백질로, 활성화를 보완하고 면역 복합체를 운반하며 체액 및 세포 면역 반응에 참여합니다. CR1은 적혈구를 포함한 많은 세포 유형의 표면에 존재하며, 길이, 구조(Knops, 또는 KN, 혈액형) 및 밀도에서 다형성을 나타낸다. 적혈구 당 CR1의 평균 밀도 (CR1/E) 적혈구 당 500 분자입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. 우리는 증폭 면역 염색 시스템의 도움으로 낮은 밀도를 발현하는 과목을 포함하여 CR1/E의 밀도를 측정하는 견고한 유량 세포 분석 방법을 제시합니다. 이 방법은 알츠하이머 병 (AD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 에이즈 또는 말라리아와 같은 질병에서 CR1 적혈구 발현의 저하를 보여줄 수있게했습니다.

서문

CR1(수용체 타입 1, CD35)은 적혈구1,B 림프구2,단핵세포, 일부 T 세포, 여포 수지상 세포3,태아 성상세포4,및 사구체 포세포5와같은 많은 세포 유형의 표면에 존재하는 200 kDa 막 막 당단백질이다. CR1은 리간드 C3b, C4b, C3bi6,,7,,88,9,제1 보체 성분의 소단위, C1q10 및 MBL(mannan-binding lectin)을 방해하여 보체 및 세포 면역 반응의 활성화를 억제한다.11

영장류에서, 인간을 포함하는 영장류에서, 적혈구 CR1은 간 및 비장으로 면역 복합체의 수송에 관여하며, 혈액을 정화하고 피부 또는 신장과 같은 취약한 조직에 그들의 축적을방지12,,13,,14. 면역 복합체와 적혈구 사이의 면역 접착의 이러한 현상은 CR1분자(15)의수에 따라 달라지다. 인간에서, CR1/E의 평균 밀도는 단지 500 (즉, 적혈구 당 CR1의 500 분자)입니다. 이 밀도는 한 개인에서 다른 (100-1,200 CR1/E)와 같은 개인의 적혈구에서 다른 사람까지 다양합니다. "null" 표현형의 일부 개인은 20 CR1/E16보다 적게 표현합니다.

CR1/E의 밀도는 CR1*117,,18에대한 코딩 유전자의 인트론 27에서 점 돌연변이에 연결된 2개의 공동 지배적인 상염색체 대두에 의해 조절된다. 이 돌연변이는 HindIII 효소에 대한 추가적인 제한 부위를 생성한다. 이 경우 HindIII로 소화한 후 얻어진 제한 단편은 CR1(H: 하이 알레일)의 강한 발현에 연결된 대문자에 대해 7.4 kb이고, 낮은 CR1 발현에 연결된 대문자에 대한 6.9 kb이다(L: 저알수). 이 링크는 백인과 아시아인에서 발견되지만 아프리카 혈통의 사람들에서는 발견되지 않습니다19.

적혈구 CR1의 발현 수준은 또한 엑소13 인코딩 SCR 10(I643T) 및 엑소온 19 인코딩 SCR16(Q981H)에서 점 뉴클레오티드 돌연변이의 존재와 상관된다. 그것은 동형 접합 643I / 981Q에서 높고 동형 접합 643T / 981H 개인20에서낮습니다. 따라서, "낮은" 개별은 약 150 CR1/E를 표현하고, "매체" 개별은 약 500 CR1/E를 표현하고, "높은" 개별은 약 1,000 CR1/E를 표현합니다.

이 적혈구 밀도 다형성 이외에, CR1은 서로 다른 크기의 네 개의 allotype에 해당하는 길이 다형성을 특징으로합니다 : CR1 * 1 (190 kDa), CR1 * 2 (220 kDa), CR1 * 3 (160 kDa), CR1 * 4 (250 kDa) 및 항원 다형성21 및 항원 다형성21.

우리는 CR1/E의 밀도를 결정하기 위해 유동 세포측정법을 기반으로 하는 방법을 제시합니다. CR1/E 밀도가 알려진 3명의 피험자를 사용하여 저밀도 수준(180 CR1/E), 중간 밀도 수준(646 CR1/E), 고밀도 수준(966 CR1/E)을 발현하여, 면역항혈투모 또는 RBC-CR1 을 이용한 적혈구 또는 적혈구(RBC) 또는 RBC MFI의 평균 형광 강도(MFI)를 측정하기 가 용이하다. 그런 다음 CR1/E 밀도의 함수로 MFI를 나타내는 표준 선을 플롯할 수 있습니다. CR1/E 밀도가 알려지지 않은 피험자의 MFI를 측정하여 이 표준 선과 비교하여 개인의 CR1/E 밀도를 결정할 수 있습니다. 이 기술은 실험실에서 수년 동안 사용되어 왔으며, 전신 성 홍반성 루푸스 (SLE)23,후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)24,말라리아25,최근 알츠하이머 병 (AD)26, 27과같은 많은 병리학에서 적혈구 CR1의 발현 감소를 검출 할 수있게되었습니다.26, 항혈전성약물(28)의 경우와 같이 적혈구와 결합하여 CR1을 표적으로 하는 약물의 개발은 CR1/E 밀도의 평가, 및 CR1을 정량화하는 견고한 기술의 가용성을 필요로 한다.

제시된 프로토콜은 싱글리케이트에서 실행됩니다. 상업적으로 이용 가능한 96개의 웰 플레이트를 사용하는 많은 개인에 대한 CR1/E의 밀도를 결정하는 데 적합합니다(재료 표참조). 이를 위해 96 웰 플레이트에 당사의 방법을 쉽게 조정할 수 있습니다. 각 견본을 위해, 적혈구의 세포 현탁액 (0.5 x 106 -10 06 적혈구)는 잘 당 분포됩니다. 각 우물을 위해, 첫째로 1 차적인 반대로 CR1 항체가 추가되고, 그 다음 streptavidin PE, 이차 항 스트렙타비딘 항체, 그리고 다시 스트렙타비딘 PE, 우리의 방법의 것과 동일한 희석을 사용하여, 그러나 양을 적응하고 비례를 존중해서.

CR1에 대해 정량화될 범위의 피험자 및 피험자의 혈액 샘플을 동시에 그려서 4 °C에서 냉장고에 보관하고 4 °C (얼음 및 / 또는 냉장고에서)에서 처리해야합니다.

프로토콜

인간의 혈액 수집 및 취급을 위한 프로토콜은 지역 윤리 위원회 (CPP Est II)에 의해 검토되고 승인되었으며, 프로토콜 번호는 2011-A00594-37입니다. 다음 의정서는 인간의 혈액 의학적 처리를 설명하기 때문에 생체 유해 물질 의 폐기에 대한 제도적 지침을 따라야 합니다. 실험실 코트와 장갑과 같은 실험실 안전 장비는 착용해야 합니다.

1. 적혈구 세척

참고: 취급 전날, 소 혈청 알부민(BSA)의 0.15%를 함유한 인산염 완충식염수(PBS)를 함유한 PBS-BSA 완충액을 준비하고 4°C의 냉장고에 놓습니다. 이 버퍼는 세척 버퍼 및 희석 버퍼로 사용됩니다.

  1. 50 mL 튜브에 PBS-BSA의 파이펫 20 mL.
  2. 흡인 250 μL 의 나트륨 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 항응고전 혈액을 혈액 저장 관으로부터 및 PBS-BSA의 20 mL를 포함하는 튜브에 첨가하였다. 캡을 나사로 조여 튜브를 닫습니다. 튜브를 2x 반전시켜 부드럽게 섞습니다.
  3. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 부드럽고 세심한 파이펫팅으로 상급물의 잔류 부피에 펠릿을 다시 놓습니다.
  4. 펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 10 mL 파이펫을 사용하여 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
  5. 펠릿을 함유한 튜브에 20 mL의 차가운 PBS-BSA (4 °C)를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 10 분 동안 튜브를 원심 분리기. 튜브를 원심분리기에 4°C로 두고 섹션 2로 이동합니다.

2. 적혈구 희석

  1. 차가운 PBS-BSA의 피펫 3 mL을 50 mL 튜브에 넣고 얼음 선반에 4 °C에 보관하십시오.
  2. 적혈구를 함유한 원심분리튜브(1.4단계)를 얼음에 놓은 랙에 놓는다.
  3. 피펫 8 μL의 펠릿적혈구를 사용하여 피펫을 사용하고 적혈구 희석을 얻기 위해 PBS-BSA의 3 mL을 포함하는 50 mL 튜브에 첨가한다. 적혈구의 균질 한 세포 현탁액을 얻기 위해 손으로 부드럽게 튜브를 혼합.

3. 적혈구 면역 염색

  1. 적혈구 희석의 피펫 100 μL (섹션 4에서 수득) 및 1.4 mL 튜브에 추가.
  2. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 0.05 μg/μL의 농도로 생체 질화된 항 CR1 J3D3 항체의 희석을 준비한다.
  3. 원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
  4. 20 μL의 생체 측화 방지 CR1 J3D3을 펠릿에 직접 추가하십시오. 음수 제어를 준비하려면 대신 PBS-BSA 버퍼 20 μL을 추가합니다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
  5. 45분 간 배양한 후, 튜브에 750 μL의 PBS-BSA를 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
  6. 그 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 스트렙타비딘-피코에리트린의 1:10 희석을 준비한다. 피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석및 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 혼합하고 4 °C에서 45 분 동안 배양하십시오.
  7. 튜브에 PBS-BSA 버퍼 750 μL을 추가합니다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 잘 섞고 원심 분리기를 섞는다. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
  8. 원심 분리 동안, PBS-BSA 완충액에서 희석된 생체질화된 항 스트렙타비딘 항체의 1:100 희석을 준비한다.
  9. 원심분리가 완료되면 상급체를 제거하고 폐기하십시오.
  10. 피펫 20 μL의 1:100 의 생물학적 인 항 스트렙타비딘의 희석튜브내로. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.
  11. 45분 간 배양한 후, PBS-BSA 완충액의 피펫 750 μL을 튜브에 첨가한다. 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 . 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 반복.
  12. 피펫 20 μL의 1:10 스트렙타비딘-피코에리트린의 희석을 튜브에 첨가한다. 튜브를 부드럽게 섞습니다. 4 °C에서 45 분 동안 튜브를 배양하십시오.
  13. PBS-BSA 버퍼의 피펫 750 μL을 튜브에 추가합니다. 잘 혼합하고 430 x g에서4 °C에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 이 단계를 2x 반복합니다.

4. 면역 염색 적혈구 고정

  1. 마지막 원심분리 동안, 세척 완충제 PBS-BSA를 사용하여 37% 포름알데히드의 1:100 희석, 고정 완충제를 준비한다.
  2. 피펫 450 μL의 고정 버퍼를 면역 염색 적혈구 튜브(단계 3.13으로부터)에 첨가하고 5s에 대한 와류를 한다.
  3. 모든 고정 셀을 5 mL 둥근 바닥 튜브에 피펫을 넣고 냉장고에 보관하십시오.
    참고: 프로토콜은 여기에서 최대 48시간 동안 일시 중지할 수 있습니다.

5. 염색된 적혈구의 유세포 분석

참고: 세포측정기(재료 표참조)에 대한 작업자 설명서를 참조하여 세포측정 판독값을 수행하는 방법을 아는 것이 좋습니다. 아래 제안된 파라미터는 사용되는 계측기에 적용되며 각 세포계에 최적화되어야 합니다.

  1. 유세포계를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 30 분 동안 그대로 두면 광학 시스템 온도가 안정화됩니다. Cytometer Connected
  2. 버퍼 컨테이너가 가득 찼고 폐기물 컨테이너가 비어 있는지 확인합니다. 퍼지 시스템을 사용하여 버퍼 필터와 버퍼 라인의 기포를 제거합니다. 세포계의 콘솔에 프라임 버튼을 눌러 유체 시스템을 프라임. 표시등이 빨간색에서 녹색으로 바뀌를 때까지 기다립니다.
  3. 유체를 청소하려면 샘플 주입 포트에 3 mL의 세척 액이 들어있는 튜브를 설치하고 높은 샘플 유량으로 5 분 동안 세척 솔루션을 실행할 수 있습니다. 증류수로 헹구는 용액으로 이 것을 반복하십시오. 시료 주입 포트에 물이 들어있는 튜브를 그대로 둡니다.
  4. 캘리브레이션 비드를 준비하기 위해, PBS의 피펫 400 μL을 둥근 바닥 튜브의 바닥에. 30s. PBS를 포함하는 둥근 바닥 튜브에 드롭을 추가하여 비드 주식을 강하게 섞습니다. 30초 동안 소용돌이를 만들어 조심스럽게 섞으세요.
  5. 성능 검사를 실행합니다. 소프트웨어에서 세포계 설정 및 추적 모듈을 엽니다(그림1A). PE 면역 염색을 사용하여 실험에 세포계 구성이 올바른지 확인합니다. 비드 배치보정이 구성에 맞는지 확인합니다.
  6. 샘플 주입 포트에 비드 튜브를 설치하고 낮은 샘플 유량으로 실행하십시오. 완료하는 데 약 5분이 걸리는 성능 검사를 실행합니다. 성능 검사가 완료되면 세포계 성능이 만족스러운지 확인합니다(그림1B). 소프트웨어의 세포계 설정 및 추적 모듈을 닫습니다.
  7. 실험을 설정하고 응용 프로그램 설정을 만들려면 브라우저 도구 모음에서 새 실험 단추를 클릭하고 새 실험을 엽니다. 실험의 드롭다운 메뉴에서 방향 분산(FSC), 측면 분산(SSC) 및 PE(그림 1C)를선택하여 적절한 세포계 설정을 선택하여 매개변수를 지정합니다. Forward Scatter FSC 매개변수에 대한 선형 모드와 SSC 및 PE 매개변수에 대한 로가리섬 모드를 선택합니다.
  8. 열린 실험에서 세포계 설정(그림 1D)을선택한 다음 응용 프로그램 설정을선택하고 전역 워크시트(그림1E)를만듭니다. 회색 상자와 십자선을 사용하여 최적화를 안내합니다.
  9. 스테인드되지 않은 제어 튜브를 세포계에 로드하고 수집을실행합니다. FSC 및 SSC 전압을 최적화하여 관심 있는 인구(즉, RBC)가 확장되어 있는지 확인합니다. FSC 임계값을 최적화하여 관심 있는 인구를 방해하지 않고 이물질을 제거합니다.
  10. FSC 대 SSC 플롯의 RBC 주위에 게이트를 그립니다. PE 형광의 점 도표에 RBC 인구를 표시합니다. 필요한 경우 광증배관(PMT) 전압의 형광을 증가하여 음수 모집단을 회색 상자 내에 배치합니다. 세포계에서 스테인되지 않은 제어 튜브를 언로드합니다.
  11. 양수 인구가 규모에 있는지 확인합니다. 스테인드 컨트롤 튜브를 세포계에 적재하고 수집을 실행합니다. 양수 모집단이 완전히 규모로 보일 때까지 규모가 축소된 경우 양수 모집단에 대한 PMT 전압을 낮춥니다. 그런 다음 얼룩진 샘플을 언로드합니다.
  12. 샘플을 기록하고 분석하려면 새 글로벌 워크시트에서 데이터를 미리 보기 위한 다음 플롯을 만듭니다: 1) FSC 대 SSC 및 2) PE 형광 히스토그램. 첫 번째 샘플을 세포계에 로드하고 수집을실행합니다.
  13. FSC 대 SSC 플롯의 적혈구 주위에 RBC 게이트를 그립니다. PE 형광 히스토그램에서 RBC 인구를 표시합니다. 통계 보기에서 GR 모집단에서 PE 형광 매개변수에 대한 평균을 선택합니다(그림1F).
  14. 수집 대시보드에서 중지 게이트의 모든 이벤트와 기록할 10,000개의 이벤트를 선택합니다(그림1G). 데이터 기록 을 클릭합니다. 이벤트 기록이 완료되면 세포계에서 첫 번째 튜브를 제거합니다. 전역 워크시트 플롯은 그림 2의플롯과 같아야 합니다.
  15. 다음 샘플을 로드하고 기록합니다.

6. 적혈구 CR1의 밀도의 결정

  1. "낮음" 피험체에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다(도3, 표 I,RBC MFI), "매체" 피험자(도4, 표 D,RBC MFI), "높음" 주제(도4, 표 I,RBC MFI), 및 음의 대조군 샘플(도3, 표 I,RBC MFI).
  2. CR1의 밀도의 함수로서 평균 형광 강도를 나타내는 그래프에서, 음의 대조군, "낮음" 피사체, "중간" 피사체 및 "높음" 피사체에 해당하는 4개의 점을 배치한다(파란색 점, 도 6).
  3. 회귀 선을 그려 보정 선과 방정식을 가져옵니다.
  4. 밀도가 결정되는 피험자에 해당하는 샘플의 평균 형광 강도값을 취합니다. (그림5, 표 D와 I, RBC MFI).
  5. 평균 형광 강도값을 사용하여 "Y"를 대체하여 방정식을 얻고 CR1/E의 밀도를계산합니다(그림 6).
  6. 그래프에서 평균 형광 강도 값과 결정된 CR1/E 밀도가 교정 선의 한 점에 해당하는지 확인합니다(그림6).

결과

CR1의 밀도가 알려진 3명의 피험자의 적혈구("낮음" 대상 [180 CR1/E], "중간" 대상 [646 CR1/E], 및 "높음" 대상 [966 CR1/E]), 그리고 CR1 밀도가 결정되어야 하는 2명의 피험자의 항 CR1 항체결합을 사용하여 증폭계에 면역으로 염색하였다. 처음에, 낮은 고범위로부터 피험자의 CR1 밀도는 방사성 표지된 항체를 이용한 Scatchard 방법29에 의해 결정되었다. 결정된 표준(낮음, 중간 및 높음)은 교정 ...

토론

적혈구 CR1 (CR1/E)의 밀도를 결정하기 위해 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 사용된 첫번째 기술은 항 CR1항체(31)에 의한 적혈구의 응집 및 C3b32로코팅된 적혈구의 존재 에 있는 장미의 대형이었습니다. 이러한 기초적인 기술은 방사성 표지된 항 CR1 항체1,,33을사용하여 면역 염색 방법으로 빠르게 대체되었다. 또한 ?...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

우리는 URCACyt의 모든 구성원, 유동 세포 분석 기술 플랫폼, 면역학의 부서의 직원, 그리고 프로토콜을 최적화하고 검증하는 데 기여 한 내과 및 노인학과의 직원에게 감사드립니다. 이 작품은 랭스 대학 병원에 의해 투자되었다 (보조금 번호 AOL11UF9156).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

참고문헌

  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175 (2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

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