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Resumo

O objetivo deste método é determinar a densidade cr1 nos eritrócitos de qualquer sujeito, comparando-se com três sujeitos cuja densidade eritrócito CR1 é conhecida. O método utiliza citometria de fluxo após a imunocoloração dos eritrócitos dos sujeitos por um anticorpo monoclonal anti-CR1 acoplado a um sistema amplificado usando ficoitrina (PE).

Resumo

CR1 (CD35, Receptor Complementar tipo 1 para C3b/C4b) é uma glicoproteína de membrana de alto peso molecular de cerca de 200 kDa que controla a ativação complementar, transporta complexos imunológicos e participa de respostas imunes humorais e celulares. CR1 está presente na superfície de muitos tipos de células, incluindo eritrócitos, e exibe polimorfismos em comprimento, estrutura (Knops, ou KN, grupo sanguíneo) e densidade. A densidade média de CR1 por eritrócito (CR1/E) é de 500 moléculas por eritrócito. Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Apresentamos aqui um método robusto de citometria de fluxo para medir a densidade de CR1/E, inclusive em sujeitos que expressam baixa densidade, com a ajuda de um sistema de imunocoloração amplificador. Este método nos permitiu mostrar a redução da expressão eritrócito cr1 em doenças como a doença de Alzheimer (DA), lúpus eritematoso sistêmico (LE), AIDS ou malária.

Introdução

CR1 (receptor complementar tipo 1, CD35) é uma glicoproteína transmembrana de 200 kDa presente na superfície de muitos tipos de células, tais como eritrócitos1, Linfócitos B2,células monocíticas, algumas células T, células dendríticas foliculares3, ostrócitos fetais4, e podocitos glomerulares5. CR1 interferindo com seus ligantes C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, uma subunidade do primeiro componente complementar, C1q10 e MBL (lectina de ligação manan)11 inibe a ativação do complemento e está envolvido na resposta imune humoral e celular.

Em primatas, incluindo humanos, o eritrócito CR1 está envolvido no transporte de complexos imunológicos para o fígado e baço, para purificar o sangue e prevenir seu acúmulo em tecidos vulneráveis como a pele ou rins12,13,14. Este fenômeno de adesão imune entre complexos imunológicos e eritrócitos depende do número de moléculas cr115. Em humanos, a densidade média de CR1/E é de apenas 500 (ou seja, 500 moléculas de CR1 por eritrócito). Essa densidade varia de um indivíduo para outro (100-1.200 CR1/E) e de um eritrócito para outro no mesmo indivíduo. Alguns indivíduos de fenótipo "nulo" expressam menos de 20 CR1/E16.

A densidade de CR1/E é regulada por dois alelos autossômicos co-dominantes ligados a uma mutação de ponto no intron 27 da codificação genética para CR1*117,18. Esta mutação produz um local de restrição adicional para a enzima HindIII. Os fragmentos de restrição obtidos após a digestão com HindIII neste caso são de 7,4 kb para o alelo ligado a uma forte expressão de CR1 (H: alelo alto) e 6,9 kb para o alelo ligado à baixa expressão CR1 (L: alelo baixo). Este elo é encontrado em caucasianos e asiáticos, mas não em pessoas de ascendência africana19.

O nível de expressão do eritrócito CR1 também está correlacionado com a presença de mutações de nucleotídeos pontuais no exon 13 codificando SCR 10 (I643T) e na codificação exon 19 SCR16 (Q981H). É alta em homozigosos 643I/981Q e baixa em indivíduos homozigos os 643T/981H20. Assim, indivíduos "baixos" expressam cerca de 150 CR1/E, indivíduos "médios" expressam cerca de 500 CR1/E e indivíduos "altos" expressam cerca de 1.000 CR1/E.

Além desse polimorfismo de densidade eritrócito, CR1 é caracterizado por um polimorfismo de comprimento correspondente a quatro alotipos de tamanhos diferentes: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) e CR1*4 (250 kDa)21 e um polimorfismo antigênico correspondente ao grupo sanguíneo KN22.

Apresentamos nosso método baseado na citometria de fluxo para determinar a densidade de CR1/E. Utilizando três sujeitos cuja densidade CR1/E é conhecida, expressando um nível de baixa densidade (180 CR1/E), um nível de densidade média (646 CR1/E) e um nível de alta densidade (966 CR1/E), é fácil medir a intensidade média de fluorescência (Fi) de seus eritrócitos ou glóbulos vermelhos (RBC), ou RBC MFI, após imunocoloração anti-CR1 usando um citometro de fluxo. Pode-se então traçar uma linha padrão representando o MFI em função da densidade CR1/E. Medindo o FI de sujeitos cuja densidade CR1/E não é conhecida e comparando-a a esta linha padrão, é possível determinar a densidade cr1/E dos indivíduos. Esta técnica tem sido utilizada há muitos anos em laboratório, e nos permitiu detectar uma redução na expressão do eritrócito CR1 em muitas patologias como lúpus eritematoso sistêmico (SLE)23, Síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS)24, malária25, e recentemente doença de Alzheimer (AD)26,27. O desenvolvimento de medicamentos voltados para CR1 para acoplamento com eritrócitos, como no caso de drogas antitrombóticas28 requer a avaliação da densidade cr1/E, e a disponibilidade de uma técnica robusta para quantificar CR1.

O protocolo apresentado funciona em singlicato. É adaptável para determinar a densidade de CR1/E em muitos indivíduos que utilizam 96 placas de poços disponíveis comercialmente específicas (ver Tabela de Materiais). Para isso, é fácil adaptar nosso método a qualquer placa de poço 96. Para cada amostra, uma suspensão celular de eritrócitos (0,5 x 106–1 x 106 eritrócitos) é distribuída por poço. Para cada poço, primeiro é adicionado o anticorpo anti-CR1 primário, depois a streptavidin PE, o anticorpo anti-streptavidin secundário, e novamente streptavidin PE, usando as mesmas diluições que as do nosso método, mas adaptando volumes e respeitando a proporcionalidade.

As amostras de sangue dos sujeitos da faixa e dos sujeitos a serem quantificados para CR1 devem ser colhidas ao mesmo tempo, armazenadas na geladeira a 4 °C e manuseadas a 4 °C (no gelo e/ou na geladeira).

Protocolo

O protocolo de coleta e manuseio de sangue humano foi revisado e aprovado pelo Comitê Regional de Ética (CPP Est II), e o número do protocolo é 2011-A00594-37. Como o protocolo a seguir descreve o manuseio do sangue humano, devem ser seguidas as diretrizes institucionais para o descarte de material bioperigoso. Equipamentos de segurança de laboratório, como jalecos e luvas, devem ser usados.

1. Lavagem de eritrócitos

NOTA: Um dia antes do manuseio, prepare um tampão PBS-BSA com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,15% de albumina de soro bovino (BSA) e coloque-o na geladeira a 4 °C. Este tampão será usado como um tampão de lavagem e como um tampão de diluição.

  1. Pipeta 20 mL de PBS-BSA em um tubo de 50 mL.
  2. Aspirar 250 μL de ácido tetraacético de etilenodiamina de sódio (EDTA) anticoagulado sangue inteiro de tubos de armazenamento de sangue e adicionar ao tubo contendo os 20 mL de PBS-BSA. Feche o tubo enroscando a tampa. Misture suavemente invertendo o tubo 2x.
  3. Centrifugar o tubo por 10 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL. Reconsidere a pelota no volume residual de sobrenadante por pipetting suave e cuidadoso.
  4. Adicione 20 mL de PBS-BSA frio (4 °C) no tubo que contém a pelota. Centrifugar o tubo por 10 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante usando uma pipeta de 10 mL.
  5. Adicione 20 mL de PBS-BSA frio (4 °C) no tubo que contém a pelota. Centrifugar o tubo por 10 min a 4 °C a 430 x g. Deixe o tubo na centrífuga a 4 °C e vá para a seção 2.

2. Diluição de eritrócitos

  1. Pipeta 3 mL de PBS-BSA frio em um tubo de 50 mL e armazene-o a 4 °C em um rack no gelo.
  2. Coloque o tubo centrífuga contendo os eritrócitos (passo 1.4) em um rack colocado no gelo.
  3. Pipeta 8 μL de eritrócitos pelleted usando a pipeta e adicionar ao tubo de 50 mL contendo o 3 mL de PBS-BSA para obter a diluição eritrócito. Misture o tubo suavemente à mão para obter uma suspensão celular homogênea de eritrócitos.

3. Imunocoloração eritrócito

  1. Pipeta 100 μL de diluição eritrócito (obtida na seção 4) e adicionar a tubos de 1,4 mL.
  2. Centrifugar os tubos por 5 min a 4 °C a 430 x g. Durante a centrifugação, prepare uma diluição do anticorpo biotinylado anti-CR1 J3D3 a uma concentração de 0,05 μg/μL no tampão PBS-BSA.
  3. Uma vez feita a centrifugação, remova e descarte o sobrenadante.
  4. Adicione 20 μL de biotinylado anti-CR1 J3D3 diretamente à pelota. Para preparar o controle negativo, adicione 20 μL de tampão PBS-BSA. Misture os tubos suavemente e incubar por 45 min a 4 °C.
  5. Após 45 min de incubação, adicione 750 μL de PBS-BSA aos tubos. Centrifugar os tubos por 5 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante. Repetir.
  6. Enquanto isso, prepare uma diluição de 1:10 de streptavidin-phycoeryrin diluído em tampão PBS-BSA. Pipeta 20 μL da diluição 1:10 de streptavidin-phycoeryrin e adicionar aos tubos. Misture os tubos suavemente e incubar por 45 min a 4 °C.
  7. Adicione 750 μL de tampão PBS-BSA nos tubos. Misture bem e centrífuga por 5 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante. Repetir.
  8. Durante a centrifugação, prepare uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-streptavidin biotinylado diluído em tampão PBS-BSA.
  9. Uma vez feita a centrifugação, remova e descarte o sobrenadante.
  10. Pipeta 20 μL da diluição 1:100 de anti-streptavidin biotinylated nos tubos. Misture os tubos suavemente. Incubar os tubos por 45 min a 4 °C.
  11. Após 45 min de incubação, pipeta 750 μL de tampão PBS-BSA e adicionar nos tubos. Centrifugar os tubos por 5 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante. Repetir.
  12. Pipeta 20 μL da diluição 1:10 de streptavidin-phycoeryrin e adicione nos tubos. Misture os tubos suavemente. Incubar os tubos por 45 min a 4 °C.
  13. Pipeta 750 μL de tampão PBS-BSA e adicione nos tubos. Misture bem e centrifugue os tubos por 5 min a 4 °C a 430 x g. Remova e descarte o sobrenadante. Repita este passo 2x.

4. Fixação de eritrócitos imunosmacuados

  1. Durante a última centrifugação, prepare o tampão de fixação, uma diluição de 1:100 de 37% de formaldeído usando o tampão de lavagem PBS-BSA.
  2. Pipeta 450 μL de tampão de fixação e adicionar em tubos eritrócitos imunomanchados (a partir do passo 3.13) enquanto vórtica para 5 s.
  3. Pipeta todas as células fixas em tubos traseiros redondos de 5 mL e armazene na geladeira.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por até 48 h.

5. Análise de citometria de fluxo de eritrócitos manchados

NOTA: É aconselhável consultar o manual do operador para o citómetro (ver Tabela de Materiais)para saber como realizar as leituras citométricas. Os parâmetros sugeridos abaixo aplicam-se ao instrumento utilizado e devem ser otimizados para cada citómetro.

  1. Ligue o citómetro de fluxo e ligue o computador. Deixe a temperatura do sistema óptico estabilizar deixando-a ligada por 30 min. Verifique a janela do citómetro no software para garantir que o citómetro esteja conectado à estação de trabalho (a mensagem Citometro Conectado é exibida).
  2. Verifique se o recipiente tampão está cheio e se o recipiente de lixo está vazio. Remova as bolhas de ar no filtro tampão e na linha tampão usando o sistema de purga. Primorito do sistema fluido pressionando o botão Prime no console do citómetro. Aguarde até que a luz do indicador mude de vermelho para verde.
  3. Para limpar a fluido, instale um tubo contendo 3 mL de uma solução de limpeza na porta de injeção da amostra e permita que a solução de limpeza seja executada por 5 min com uma alta vazão de amostra. Repita isso com a solução de enxágüe com água destilada. Deixe o tubo contendo água na porta de injeção da amostra.
  4. Para preparar as contas calibradoras, pipeta 400 μL de PBS na parte inferior de um tubo traseiro redondo. Misture fortemente as ações de esferas, vórticando por 30 s. Adicione uma gota ao tubo inferior redondo contendo PBS. Misture cuidadosamente, vórticepor 30 s.
  5. Faça a verificação de desempenho. Abra o módulo de configuração e rastreamento do citómetro no software(Figura 1A). Verifique se a configuração do citómetro está correta para o experimento usando imunocoloração PE. Verifique se o lote de vigas calibrantes está correto com a configuração.
  6. Instale o tubo de tala na porta de injeção da amostra e deixe-o funcionar com uma baixa vazão de amostra. Execute a verificação de desempenho, que leva aproximadamente 5 min para ser concluída). Uma vez concluída a verificação de desempenho, verifique se o desempenho do citómetro é satisfatório(Figura 1B). Feche o módulo de configuração e rastreamento do citómetro no software.
  7. Para configurar um experimento e criar configurações de aplicativos, clique no botão Novo Experimento na barra de ferramentas do navegador e abra o novo experimento. Especifique os parâmetros selecionando as configurações apropriadas do citómetro: Dispersão para frente (FSC), Dispersão lateral (SSC) e PE no menu suspenso do experimento(Figura 1C). Selecione Modo Linear para parâmetros FSC e Modo Logaritmo para parâmetros SSC e PE.
  8. No experimento aberto, selecione Configurações do Citómetro (Figura 1D),selecione Configurações de aplicativoe crie uma planilha global(Figura 1E). Use as caixas cinzas e a mira para orientar a otimização.
  9. Carregue o tubo de controle não manchado no citómetro e execute a Aquisição. Certifique-se de que a população de interesse (ou seja, RBCs) esteja em escala, otimizando as tensões FSC e SSC. Otimize o valor do limiar do FSC para eliminar os detritos sem interferir na população de interesse.
  10. Desenhe um portão ao redor dos RBCs no enredo FSC vs. SSC. Exibir a população rbc no gráfico de tamancos de fluorescência pe. Se necessário, aumente a fluorescência das tensões do tubo fotomultiplicador (PMT) para colocar a população negativa dentro das caixas cinzas. Descarregue o tubo de controle não manchado do citómetro.
  11. Verifique se as populações positivas estão em escala. Carregue o tubo de controle manchado no citómetro e execute a aquisição. Diminua a tensão do PmT para a população positiva se estiver fora de escala até que a população positiva possa ser vista inteiramente em escala. Em seguida, descarregar a amostra manchada.
  12. Para gravar e analisar amostras, em uma nova planilha global, crie os seguintes lotes para visualizar os dados: 1) FSC vs. SSC e 2) Histograma de fluorescência PE. Carregue a primeira amostra no citómetro e execute a Aquisição.
  13. Desenhe um portão RBC em torno dos eritrócitos no enredo FSC vs. SSC. Exibir a população de RBC no histograma de fluorescência pe. Na visão Estatística, selecione a média para parâmetros de fluorescência de PE em populações de CGr (Figura 1F).
  14. No painel de aquisição, selecione todos os eventos no portão de parada e 10.000 eventos para registrar (Figura 1G). Clique em Dados de registro. Quando a gravação do evento estiver concluída, remova o primeiro tubo do citómetro. As parcelas globais da planilha devem ser pareadas com as da Figura 2.
  15. Carregue as seguintes amostras e grave-as.

6. Determinação da densidade do eritrócito CR1

  1. Pegue os valores das intensidades médias de fluorescência das amostras correspondentes ao sujeito "baixo"(Figura 3, Tabela I, RBC MFI), sujeito "médio"(Figura 4, Tabela D, RBC MFI), sujeito "alto"(Figura 4, Tabela I, RBC MFI) e à amostra de controle negativo(Figura 3, Tabela I, RBC MFI).
  2. Em um gráfico representando a intensidade média de fluorescência em função da densidade de CR1, coloque os quatro pontos correspondentes ao controle negativo, sujeito "baixo", "médio" e "alto" sujeito (pontos azuis, Figura 6).
  3. Desenhe a linha de regressão para obter a linha de calibração e sua equação.
  4. Tome-se os valores da intensidade média de fluorescência das amostras correspondentes aos sujeitos cuja densidade deve ser determinada. (Figura 5, Tabelas D e I, RBC MFI).
  5. Obter a equação substituindo "Y" utilizando os valores das intensidades médias de fluorescência, e calcular a densidade de CR1/E (Figura 6).
  6. Verifique no gráfico que os valores médios de intensidade de fluorescência e a densidade de CR1/E determinada correspondem a um ponto na linha de calibração(Figura 6).

Resultados

Os eritrócitos de três sujeitos cuja densidade de CR1 é conhecida (sujeito "baixo" [180 CR1/E], sujeito "médio" [646 CR1/E], e "alto" sujeito [966 CR1/E]), e de dois sujeitos cuja densidade cr1 precisava ser determinada foram imunostados por um anticorpo anti-CR1 acoplado a um sistema de amplificação usando o ficoeritrinor No início, a densidade cr1 dos sujeitos da faixa baixa-alta foi determinada pelo método Scatchard29 usando anticorpos rotulados por radiorótulo. As normas (baixa, médi...

Discussão

Várias técnicas estão disponíveis para determinar a densidade do eritrócito CR1 (CR1/E). As primeiras técnicas utilizadas foram a aglutinação de glóbulos vermelhos por anticorpos anti-CR131 e a formação de rosetas na presença de eritrócitos revestidos com C3b32. Estas técnicas rudimentares foram rapidamente substituídas por métodos de imunocoloração usando anticorpos anti-CR1 radiorotulados1,33. Ta...

Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Agradecemos a todos os membros da URCACyt, plataforma técnica de citometria de fluxo, equipe do Departamento de Imunologia, e a equipe do Departamento de Medicina Interna e Geriatria, que contribuíram para otimizar e validar o protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Reims University Hospitals (número de subvenção AOL11UF9156).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

Referências

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