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要約

この方法の目的は、赤血球CR1密度が知られている3人の被験者と比較することによって、任意の被験体の赤血球中のCR1密度を決定することである。この方法は、フィコエリスリン(PE)を用いて増幅系に結合した抗CR1モノクローナル抗体による被験者の赤血球の免疫染色後のフローサイトメトリーを使用する。

要約

CR1(CD35、C3b/C4b用補体受容体1型)は、約200kDaの高分子膜糖タンパク質であり、補体活性化を制御し、免疫複合体を輸送し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。CR1は、赤血球を含む多くの細胞型の表面に存在し、長さ、構造(Knops、またはKN、血液群)、および密度において多型を示す。赤血球当たりのCR1(CR1/E)の平均密度は、赤血球当たり500分子である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。ここでは、増幅免疫染色システムの助けを借りて、低密度を発現する被験者を含むCR1/Eの密度を測定する堅牢なフローサイトメトリー法を提示する。この方法により、アルツハイマー病(AD)、全身性エリテマトーシス(SLE)、エイズ、マラリアなどの疾患におけるCR1赤血球発現の低下を示す。

概要

CR1(補体受容体型1、CD35)は、赤血球1、Bリンパ球2、単球細胞、一部のT細胞、濾胞樹状細胞3、胎児アストロサイト4、および糸球体ポドサイト5のような多くの細胞型の表面に存在する200kDa膜貫通糖タンパク質である。CR1は、そのリガンドC3b、C4b、C3bi6、7、8、9、第1の補体成分のサブユニット、C1q6,7,8,910およびMBL(マンナン結合レクチン)11は、補体の活性化を阻害し、体液性および細胞性免疫応答に関与する。

ヒトを含む霊長類において、赤血球CR1は、肝臓および脾臓への免疫複合体の輸送に関与し、血液を浄化し、皮膚または腎臓12、13、14,13,14などの脆弱な組織に蓄積するのを防ぐ。免疫複合体と赤血球との間の免疫接着のこの現象は、CR1分子15の数に依存する。ヒトでは、CR1/Eの平均密度はわずか500(すなわち、赤血球当たりCR1の500分子)である。この密度は、ある個体(100~1,200 CR1/E)、同一個体の赤血球から別の赤血球へと変化する。"null" 表現型の一部の個体は、20 CR1/E16未満を表現する。

CR1/Eの密度は、CR1*117、18,18に対してコードする遺伝子のイントロン27における点突然変異に結合した2つの共支配性常染色体対立遺伝子によって調節される。この変異は、HindIII酵素に対する追加の制限部位を生成する。この場合のHindIIIでの消化後に得られた制限フラグメントは、CR1(H:高アレル)の強い発現にリンクされたアレルの7.4kb、低CR1発現にリンクされたアレルの6.9kb(L:低アレル)である。このリンクは白人やアジア人に見られますが、アフリカ系の人々には見られません19.

赤血球CR1の発現レベルは、SCR10をコードするエキソン13(I643T)およびExON 19コードSCR16(Q981H)におけるポイントヌクレオチド突然変異の存在とも相関している。ホモ接合643I/981Qでは高く、ホモ接合体643T/981H個体20では低い。したがって、「低い」個体は約150 CR1/Eを表現し、「中程度」の個体は約500のCR1/Eを表現し、「高い」個体は約1,000 CR1/Eを表現する。

この赤血球密度多型に加えて、CR1は、異なるサイズの4つの異なる異形型に対応する長さの多形によって特徴付けられる:CR1*1(190 kDa)、CR1*2(220kDa)、CR1*3(160kDa)、およびCR1*4(250 kDa)21と抗原多型の22に対応する。21

CR1/Eの密度が既知の3つの被験者を用いて、CR1/Eの密度を決定するためのフローサイトメトリーに基づく方法を提示します。 低密度レベル(180 CR1/E)、中密度レベル(646 CR1/E)、高密度レベル(966 CR1/E)を発現し、赤血球または赤血球(RBC)の平均蛍光強度(MFI)、またはRBC MFIを測定することは容易です。その後、MFI を CR1/E 密度の関数として表す標準線をプロットできます。CR1/E密度が知られていない被験者のMFIを測定し、これをこの標準線と比較して、個人のCR1/E密度を決定することができる。この技術は、研究室で長年使用されており、全身性エリテマトース(SLE)23、後天性免疫不全症候群(AIDS)24、マラリア25、および最近アルツハイマー病(AD)26、27など多くの病態において、赤血球CR1の発現の低下を検出することを可能26に27している。23抗血栓薬28の場合のように、赤血球と結合するCR1を標的とする薬物の開発は、CR1/E密度の評価、およびCR1を定量化するための堅牢な技術の入手可能性を必要とする。

提示されたプロトコルは、1回で実行されます。特定の市販の96ウェルプレートを使用して多くの個人のCR1/Eの密度を決定するために適応可能です(材料表を参照)。この上で、それは任意の96ウェルプレートに私たちの方法を適応させることは容易です。各サンプルについて、赤血球の細胞懸濁液(0.5 x 106-1 x 106赤血球)がウェルごとに分布する。各井戸に対して、最初の一次抗CR1抗体を添加し、次にストレプトアビジンPE、二次抗ストレプトアビジン抗体、および再びストレプトアビジンPEを、我々の方法のものと同じ希釈を用いるが、体積を適応させ、比例性を尊重することによって。

CR1の範囲の被験者および被験者から採検される被験者からの血液サンプルは、同時に採取し、4°Cの冷蔵庫に保存し、4°C(氷上および/または冷蔵庫)で取り扱う必要があります。

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プロトコル

ヒトの採血と取り扱いの議定書は、地域倫理委員会(CPP Est II)によって審査され、承認され、プロトコル番号は2011-A00594-37です。以下のプロトコルは、ヒトの血液の取扱いについて説明しているので、生体有害物質の廃棄に関する制度上のガイドラインに従うべきである。ラボコートや手袋などの実験室の安全装置を着用する必要があります。

1. 赤血球洗浄

注意:取り扱い前日に、ウシ血清アルブミン(BSA)の0.15%を含むリン酸緩衝生理食塩分(PBS)を用いてPBS-BSAバッファーを調製し、4°Cで冷蔵庫に入れます。このバッファーは、洗浄バッファーとして、希釈バッファーとして使用されます。

  1. ピペット20 mLのPBS-BSAを50 mLチューブにします。
  2. 250μLのナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の吸入体は、血液貯蔵管から全血を抗凝固し、20mLのPBS-BSAを含むチューブに添加した。キャップをねじ込んでチューブを閉じます。管2倍を反転してやさしく混ぜます。
  3. 430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。優しく慎重なピペット処理により、上清の残留体積中のペレットを再懸濁します。
  4. ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。10 mLピペットを使用して上清を取り出し、廃棄します。
  5. ペレットを含むチューブに20 mLの冷たいPBS-BSA(4°C)を加えます。430 x gで4°Cで10分間チューブを遠心分離します。チューブを遠心分離機の4°Cに残し、セクション2に進みます。

2. 赤血球希釈

  1. 50 mLチューブに冷たいPBS-BSAのピペット3 mLを、氷の中のラックに4°Cで保管します。
  2. 赤血球を含む遠心チューブ(ステップ1.4)を氷の中に置かれたラックに置きます。
  3. ピペットを用いたペレット赤血球のピペット8μLを、PBS-BSAの3mLを含む50mLチューブに加え、赤血球希釈液を得た。チューブを手で軽く混ぜて、赤血球の均質な細胞懸濁液を得る。

3. 赤血球免疫染色

  1. ピペット100μLの赤血球希釈液(セクション4で得られる)を1.4 mLチューブに加える。
  2. 430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。遠心分離の間、PBS-BSAバッファー内の0.05 μg/μLの濃度でビオチン化抗CR1 J3D3抗体の希釈を調製します。
  3. 遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。
  4. 20 μLのビオチン化抗CR1 J3D3をペレットに直接加えます。陰性制御を準備するには、代わりに20 μLのPBS-BSAバッファを追加します。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。
  5. 45分のインキュベーションの後、750 μLのPBS-BSAをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
  6. その間、PBS-BSAバッファーで希釈したストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈を調製する。ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加える。チューブを軽く混ぜ、4°Cで45分間インキュベートします。
  7. 750 μL の PBS-BSA バッファーをチューブに追加します。430 x g で 4 °C で 5 分間、よく遠心分離機を混ぜます。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
  8. 遠心分離の間、PBS-BSAバッファーで希釈したビオチン化抗ストレプトアビジン抗体の1:100希釈を調製する。
  9. 遠心が終わったら、上清を取り除いて捨てます。
  10. ピペット20 μLのビオチン化抗ストレプトアビジンをチューブに1:100希釈した。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。
  11. 45分のインキュベーションの後、ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。繰り返します。
  12. ストレプトアビジン-フィコエリスリンの1:10希釈のピペット20 μLをチューブに加えます。チューブを軽く混ぜます。4°Cで45分間チューブをインキュベートします。
  13. ピペット750 μLのPBS-BSAバッファーをチューブに加えます。430 x gで 4 °C で 5 分間よく混合し、遠心分離チューブ.上清を取り除き、捨てます。この手順を 2x 繰り返します。

4. 免疫染色赤血球固定

  1. 最後の遠心分離の間、1:100の固定バッファーを調製し、洗浄バッファーPBS-BSAを用いて37%ホルムアルデヒドの希釈液を調製する。
  2. ピペット450μLの固定バッファーを、5秒のボルテックス中に免疫染色赤血球チューブ(ステップ3.13から)に加えます。
  3. ピペットは5 mLの丸い底の管に全ての固定された細胞を、冷蔵庫に保管する。
    注: プロトコルは、ここで最大 48 時間一時停止できます。

5. 染色赤血球のフローサイトメトリー解析

注意:サイトメトリックの読み取り値を実行する方法を知ってお勧めします。. Table of Materials以下の推奨パラメータは使用する計測器に適用され、各サイトメーターに最適化する必要があります。

  1. フローサイトメーターの電源を入れ、コンピュータの電源を入れます。光学系の温度を30分間オンにしたままにして安定させます。 Cytometer Connected
  2. バッファー コンテナーがいっぱいであり、廃棄物コンテナーが空であることを確認します。パージシステムを使用して、バッファフィルタとバッファラインの気泡を取り除きます。サイトメーターのコンソール上のPrimeボタンを押して流体システムをプライムします。インジケータランプが赤から緑に変わるまで待ちます。
  3. 流体を洗浄するには、3 mLの洗浄液を含むチューブをサンプル注入口に取り付け、洗浄液を高いサンプル流量で5分間実行させます。蒸留水でリンス溶液でこれを繰り返します。サンプル注入口に水を含む管を残します。
  4. キャリブレーションビーズを調製するために、PBSのピペット400 μLを丸底管の底部に入れた。30 sの渦を巻いてビーズストックを強く混ぜます。30sの渦で慎重に混ぜます。
  5. パフォーマンス チェックを実行します。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを開きます(図1A)。細胞メーター構成がPE免疫染色を用いた実験に適していることを確認します。構成に合った調整ビード バッチが正しいことを確認します。
  6. サンプルインジェクションポートにビーズチューブを取り付け、低サンプル流量で動かします。パフォーマンスチェックを実行します(所要時間は約5分)。パフォーマンスチェックが完了したら、サイトメーターのパフォーマンスが満足であることを確認します(図1B)。ソフトウェアのサイトメーターのセットアップとトラッキングモジュールを閉じます。
  7. 実験を設定してアプリケーション設定を作成するには、ブラウザーのツール バーの[新しい実験] ボタンをクリックし、新しいテストを開きます。実験のドロップダウン メニューから適切なサイトメーター設定(フォワード スキャッタ(FSC)、サイド スキャッタ(SSC)、および PEを選択して、パラメータを指定します (図 1C)。SSC および PE パラメータの場合は[FSC パラメータ]に[線形モード]を、パラメータの[対数モード]を選択します。
  8. 開いた実験で、[サイトメーターの設定] ( 図1D) を選択し、[アプリケーション設定]を選択して、グローバル ワークシートを作成します (図 1E)。最適化をガイドするには、グレーのボックスと十字線を使用します。
  9. 染色されていないコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。FSC および SSC 電圧を最適化することにより、関心のある人口(つまり、RMC)が拡大縮小されていることを確認します。FSCしきい値を最適化して、関心のある人口に干渉することなく、デブリを排除します。
  10. FSC と SSC プロットの RMC の周囲にゲートを描画します。PE蛍光のドットプロットでRBC集団を表示する。必要に応じて、光増倍管(PMT)電圧の蛍光を上げ、グレーのボックス内に負の母集団を配置します。染色されていないコントロールチューブをサイトメーターからアンロードします。
  11. 正の母集団がスケールであることを確認します。染色されたコントロールチューブをサイトメーターにロードし、取得を実行します。正の母集団が完全にスケールで見られるまで、プラス集団がスケールから外れている場合は、正の母集団のPMT電圧を下げます。その後、染色されたサンプルをアンロードします。
  12. サンプルを記録して分析するには、新しいグローバルワークシートで、データをプレビューするための次のプロットを作成します: 1) FSC 対 SSC, および 2) PE蛍光ヒストグラム.最初のサンプルをサイトメーターにロードし、取得を実行します。
  13. FSC対SSCプロットの赤血球の周りにRBCゲートを描きます。PE蛍光ヒストグラムでRBC集団を表示する。統計ビューで、GR 集団の PE 蛍光パラメータの平均を選択します (図 1F)。
  14. 取得ダッシュボードで、停止ゲート内のすべてのイベントと記録する 10,000 イベントを選択します (図 1G)。[レコード データ ]をクリックします。イベント記録が完了したら、サイトメーターから最初のチューブを取り外します。グローバル ワークシートのプロットは、図 2のようになります。
  15. 以下のサンプルをロードして記録します。

6. 赤血球CR1の密度の決定

  1. 「低」被験者(図3、表I、RBCMFI)、中型の被験者(図4、表D、RBCMFI)、高い」被験者(図4、表I、RBCMFI)、およびFigure 4陰性対照サンプル(図3、表I、RBCMFI)に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。
  2. 平均蛍光強度をCR1の密度の関数として表すグラフ上に、負の対照に対応する4点を配置し、「低」被験者、「中」の被験者、および「高」対象(青色点、図6)を配置する。
  3. 回帰直線を描画して、キャリブレーションラインとその方程式を取得します。
  4. 密度が決定される被験者に対応するサンプルの平均蛍光強度の値を取る。(図 5、表 D および I、RBC MFI)。
  5. 平均蛍光強度の値を用いて「Y」を置換して式を得て、CR1/Eの密度を算出する(図6)。
  6. グラフ上で、平均蛍光強度値と決定されたCR1/E密度がキャリブレーションライン上の点に対応していることを確認します(図6)。

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結果

CR1の密度が知られている3人の被験者の赤血球("低"被験者[180 CR1/E]、中型の被験者[646 CR1/E]、および「高」被験者[966 CR1/E])、およびCR1密度を決定する必要がある2つの被験者の赤血球は、フィロクロム系を用いて免疫染色された。初めに、低い高い範囲からの被験者のCR1密度は、放射線標識抗体を用いてScatchard法29によって決定された。測定された基準(低、中、高)は、較正曲線...

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ディスカッション

赤血球CR1(CR1/E)の密度を決定するためにいくつかの技術が利用可能です。第1の技術は、抗CR1抗体31による赤血球の凝集と、C3b32でコーティングされた赤血球の存在下でのロゼットの形成であった。32これらの初歩的な技術は、放射性標識抗CR1抗体11、3333を用いた免疫染色法によって迅速に置換された。また、酵素結...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

URCACyt、フローサイトメトリー技術プラットフォームのメンバー、免疫学科のスタッフ、およびプロトコルの最適化と検証に貢献した内科学・老年医学省のスタッフに感謝します。この研究はランス大学病院(助成金番号AOL11UF9156)によって資金提供されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1000E Barrier TipThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France2079Esample pipetting
1-100 µL Bevelled, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1120-1840sample pipetting
Biotinylated anti-CR1 monoclonal antibody (J3D3)Home production of non-commercial monoclonal antibody, courtesy of Dr J. Cookimmunostaining
Blouseprotection
Bovin serum albumin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France15260037cytometry
CentrifugeThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France11176917centrifugation
Clean SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340345cytometry
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060Prack
Cytometer Setup & Tracking Beads KitBD, F-38801 Le Pont de Claix, France655051cytometry
Formaldehyde solution 36.5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FranceF8775-25MLFixation
10 µL Graduated, filter tipStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermanyS1121-3810sample pipetting
LSRFORTESSA Flow CytometerBD, F-38801 Le Pont de Claix, France647788cytometry
Microman Capillary PistonsDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494sample pipetting
Micronic 1.40 mL round bottom tubesDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Micropipette Microman - type M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379sample pipetting
Phosphate buffered Saline (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10010031cytometry
Pipette PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952sample pipetting
powder-free Nitrile Exam glovesMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802sample protection
Reference 2 pipette, 0,5-10 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000024sample pipetting
Reference 2 pipette, 20-100 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000059sample pipetting
Reference 2 pipette, 100-1000 µLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France4920000083sample pipetting
Rinse SolutionBD, F-38801 Le Pont de Claix, France340346cytometry
Round bottom tubeSarstedt, F-70150 Marnay, France55.1579cytometry
Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, France0030120086mix
streptavidin R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FranceAS-60669immunostaining
Tapered Centrifuge Tubes 50 mLThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, France10203001mix
Vector anti streptavidin biotinEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FranceBA-0500immunostaining
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix

参考文献

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