Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا هو إجراء متدرج لتمايز في المختبر من keratinocytes الإنسان الأولية عن طريق تثبيط الاتصال تليها توصيف على المستوى الجزيئي من قبل تحليل الحمض النووي الريبي- seq.

Abstract

وغالبا ما تستخدم keratinocytes الإنسان الأولية ونماذج في المختبر للدراسات على التمايز البشرة والأمراض ذات الصلة. وقد تم الإبلاغ عن أساليب لتمايز في المختبر من keratinocytes المستزرعة في ثنائية الأبعاد (2D) آداب مغمورة باستخدام ظروف الحث المختلفة. هو موضح هنا هو إجراء ل2D في طريقة تمايز keratinocyte في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال والتوصيف الجزيئي اللاحقة من قبل RNA-seq. باختصار, تزرع keratinocytes في تعريف keratinocyte المتوسطة تكملها عوامل النمو حتى تكون التقاء تماما. ويُستحث التمايز عن طريق الاتصالات الوثيقة بين الخلايا الكيراتينية ويُحفَّز كذلك باستبعاد عوامل النمو في الوسط. باستخدام التحليلات RNA-seq، يظهر أن كلا 1) keratinocytes متباينة المعرض التوقيعات الجزيئية متميزة أثناء التمايز و 2) نمط التعبير الجيني الديناميكي يشبه إلى حد كبير الخلايا خلال الطبقات البشرة. بالمقارنة مع التمايز keratinocyte العادي، keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 معرض تغيير مورفولوجيا والتوقيعات الجزيئية، بما يتفق مع عيوب التمايز الخاصة بهم. في الختام، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات ل2D في المختبر keratinocyte التمايز وتوصيف الجزيئية، مع التركيز على تحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات RNA-seq. لأن RNA استخراج و RNA- إجراءات ني- ا موثقة جيدا، فإنه ليس محور هذا البروتوكول. الإجراء التجريبي للتمايز في الكيراتينوسيات في المختبر الحيوي وخط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز الجلدي في خلايا الكيراتينوسيات صحية والمُرَضَّة.

Introduction

غالباً ما تستخدم keratinocytes الإنسان المشتقة من الجلد البشري كنموذج الخلوية لدراسة بيولوجيا البشرة1,2,3,4. يمكن أن تكون على غرار الطبقات من البشرة من قبل التمايز keratinocyte، إما في 2D مغمورة monolayer أزياء أو 3D الهواء رفع organotypic نموذج2،3،5،6،7. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد أصبحت ذات أهمية متزايدة لتقييم بنية الجلد ووظيفته ، فإن نماذج التمايز 2D لا تزال تستخدم على نطاق واسع ، بسبب راحتها وإمكانية توليد أعداد كبيرة من الخلايا للتحليلات.

وقد طبقت شروط مختلفة لحفز التمايز keratinocyte في 2D، بما في ذلك إضافة المصل، وارتفاع تركيز الكالسيوم، وانخفاض درجة الحرارة وتثبيط مستقبلات عامل النمو البشرة2،3. وقد تم التحقق من صحة كل من هذه الطرق من قبل عدد من الجينات علامة التمايز keratinocyte وتبين أن تكون فعالة في تقييم تمايز keratinocyte, بما في ذلك في ظل الظروف المرضية. ومع ذلك ، فإن هذه الظروف التعريفية تظهر أيضا اختلافات في كفاءة التمايز والحركية عند فحص لوحات محددة من الجينات علامة2،3.

واحدة من هذه الأساليب ينطوي keratinocyte منع الاتصال واستنفاد عوامل النمو في الثقافة المتوسطة8. وقد تبين أن الكيراتينوسيات يمكن أن تفرق تلقائيا عندما الخلايا تصل إلى كثافة كاملة.  ويمكن أن يؤدي استبعاد عوامل النمو في الوسط الثقافي إلى زيادة تعزيز التمايز. وقد تبين أن الأسلوب الذي يجمع بين تثبيط الاتصال وعوامل النمو المستنفدة لتوليد خلايا الكيراتينوسيات المتمايزة مع أنماط التعبير الجيني مماثلة للبشرة الطبقية الطبيعية عند استخدام العديد من علامات البشرة3، مما يشير إلى أن هذا النموذج مناسب لدراسة تمايز الكيراتينوسيت العادي. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن تحليلين شاملين للتعبير الجيني للتمايز الكيراتينوتي باستخدام هذا النموذج9،10. وقد قام الباحثون بالتحقق من صحة هذا النموذج على المستوى الجزيئي وأظهروا أنه يمكن استخدامه لدراسة تمايز الكيراتينوسيات العادي والمُرَض.

يصف هذا البروتوكول الإجراء الخاص بطريقة التمايز في المختبر والتحليل الجزيئي للخلايا المتمايزة باستخدام الحمض النووي الريبي الريبي-الصد. كما يوضح توصيف نسخة الخلايا في يوم التمايز 0 (مرحلة الانتشار)، واليوم 2، واليوم 4، واليوم السابع (التمايز المبكر والمتوسط والمتأخر على التوالي). وتبين أن الكيراتينوسيات المختلفة تعرض أنماط التعبير الجيني التي تشبه إلى حد كبير الخلايا أثناء التقسيم الطبقي البشرة. لدراسة ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة أمراض الجلد، قمنا بتطبيق نفس خط الأنابيب التجريبية والتحليلية للتحقيق في keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 التي هي مستمدة من المرضى الذين يعانون من ectrodactyly، التفكيك وشقوق الشفة / الحنك متلازمة11،12. ويركز هذا البروتوكول على التمايز في المختبر من keratinocytes وكذلك التحليل الحيوي اللاحقة من الحمض النووي الريبي- سيك. خطوات أخرى في الإجراء الكامل مثل استخراج الحمض النووي الريبي، وإعداد عينة RNA-seq وبناء المكتبة، هي موثقة جيدا ويمكن اتباعها بسهولة، وخصوصا عند استخدام العديد من مجموعات تجارية شائعة الاستخدام. لذلك، يتم وصف هذه الخطوات باختصار فقط في البروتوكول. وتظهر البيانات أن هذا خط الأنابيب هو مناسبة لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز البشرة في الكيراتينوسيات صحية والمُرَكَّرة.

Protocol

تم أخذ خزعات الجلد من جذع المتطوعين الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من طفرات p63 ، لإعداد ثقافة الكيراتينوسيت الأولية. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية التابعة لمركز نيجمين الطبي التابع لجامعة رادبود على جميع الإجراءات المتعلقة بإنشاء الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen). وتم الحصول على الموافقة المستنيرة.

1. الإنسان keratinocyte التمايز عن طريق تثبيط الاتصال

  1. إعداد keratinocyte متوسطة النمو (KGM) من Keratinocyte بازل المتوسطة (جدول المواد) عند الضرورة.
  2. جعل 500 مل لانتشار المتوسطة باستخدام الأرصدة المعدة مسبقا (KGM-pro؛ انظر الجدول 1).
  3. جعل 500 مل تمايز المتوسطة (KGM-dif؛ انظر الجدول 2).
    ملاحظة: KGM مع المكملات الغذائية يمكن أن تبقى في 4 درجة مئوية لمدة أسبوعين. للتخزين لفترة أطول، يمكن أن تكون على الاقتباس وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. بذور keratinocytes الأولية في كثافة 5.0-20 × 103 الخلايا / سم2، اعتمادا على قدرة الخلايا التكاثرية. إضافة كافية KGM-الموالية المتوسطة لتغطية الخلايا.
    ملاحظة: 1) يمكن الاطلاع على تفاصيل ثقافة الخلايا العادية داخل KGM المتوسطة في موقع لLonza13. 2) ينبغي اختبار كثافة البذر لكل خط الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن يكون خط keratinocyte الأساسي العادي مبذراً بكثافة 5.0 × 103 خلايا/سم2، في حين أن الخط الذي يحمل الطفرات في عامل النسخ p63 الأقل تكاثراً يجب أن يكون بذراً بكثافة 20 × 103 خلايا/سم2. 3) اعتمادا على مجموعة تجريبية، وينبغي أن بذور عدة أطباق أو آبار من الخلايا للسماح لجمع العينات في أيام مختلفة التمايز في النسخ المتماثلة.
  5. تحديث الخلايا مع متوسطة KGM-pro لمدة يومين بعد البذر (البذر في اليوم 0، منعشة للوقت 1في اليوم 3). بعد ذلك، تحديث مع KGM-الموالية المتوسطة كل يومين. تحقق من الخلايا بانتظام، على الأقل كل يومين.
  6. الحث على تمايز الخلايا عندما تكون الخلايا أكثر من 90٪ التقاء عن طريق تغيير المتوسطة إلى KGM-dif. ويعرف يوم تغيير الوسط إلى KGM-dif بأنه يوم التمايز 0. جمع الخلايا لمزيد من التحليلات RNA عن طريق غسل أول 2x مع DPBS، بعد ذلك إضافة في العازلة تحلل (من طقم استخراج الحمض النووي الريبي).
    ملاحظة: مع كثافة البذر المذكورة أعلاه، يجب أن تصل الخلايا إلى التقاء في غضون 7-10 أيام. يمكن أن تكون الخلايا مبذرة مع كثافة أولية أعلى للوصول إلى التقاء عاجلا. إذا لم تكن الخلايا تكاثرية، فإن الانتظار الأطول قد لا يؤدي إلى خلايا التقاء كاملة. قد تكون هناك حاجة إلى كثافة البذر أعلى.
  7. تحديث الخلايا مع متوسطة KGM-dif كل يوم وجمع الخلايا في يوم التمايز 2، 4. و7 لمزيد من استخراج الحمض النووي الريبي.

2. RNA استخراج

  1. عزل الجيش الملكي النيبالي الكلي. ويمكن تنفيذ هذا باستخدام RNA التجارية طقم العزل (مثل Zymo سريعة RNA MicroPrep RNA)، أو باستخدام الفينول14. ومع ذلك، يوصى بشدة بمجموعة العزل التي تحتوي على علاج DNAse لعينات رنا-seq لمنع تلوث الحمض النووي والفينول. مثال على RNA التجارية العزل وترد في جدول المواد.
  2. قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع مطياف. كل من الحمض النووي والRNA ذروة امتصاص في 260 نانومتر.
    ملاحظة: 1) يتم استخدام نسبة بين امتصاص في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتقييم نقاء الجيش الملكي النيبالي. نسبة حوالي 2.0 هو مقبول عموما باسم الجيش الملكي النيبالي 'نقية'. وإذا كانت النسبة أقل بكثير من 2.0، فقد تكون العينة ملوثة بالملوثات التي تمتص 280 نانومتر مثل البروتينات أو الفينولات أو غيرها من المواد. 2) النسبة بين امتصاص في 260 نانومتر و 230 نانومتر يقيس نقاء الحمض النووي. ومن المتوقع أن تكون النسبة بين 2.0 و 2.2. وإذا كانت النسبة أقل بكثير، فقد تكون العينة ملوثة بالملوثات التي تمتص 230 نانومتر مثل EDTA أو الإيثانول أو غيرها من المواد.

3. RNA فحص الجودة

  1. تشغيل RNA إما على رقاقة بيورليتزر RNA بيكو للتحقق من صحة RNA سلامة عدد (RIN) كميا، أو على هلام لقياس نوعي. بشكل عام، RIN من ثمانية على الأقل من المستحسن للغاية. ومع ذلك، عند استخراج RNA من الأنسجة قد يكون أقل RIN.
    ملاحظة: اختياريا، يمكن إجراء مراقبة الجودة من قبل qPCR على المواد RNA.

4- إعداد مكتبة RNA-seq

ملاحظة: غالباً ما يتم تنفيذ إعداد مكتبة RNA-seq مع مجموعة تجارية أو تحت إعدادات تجارية. يتم تكييف البروتوكول الموصوف من مجموعة تجارية، KAPA RNA HyperPrep Kit مع RiboErase (Illumina)، مع وصف موجز لجميع الخطوات المطلوبة: استنفاد الرنا مع تهجين الأوليغو إلى RNAAs الريبوسومي البشري، تفتيت الحمض النووي الريبي، أول تخليق حبلا، ثاني تركيب حبلا وذيل A- ، وتنظيف بعد كل خطوة15. ويمكن أيضاً استخدام مجموعات أخرى لإعداد المكتبات لهذا الغرض. من المستحسن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة متوفرة تجارياً، حيث أن جودة مكتبة cDNA التي تم إنشاؤها غالباً ما تكون أكثر تناسقاً. 2) يتم وصف الخطوات التالية لإعداد مكتبة 1x. إذا كان إعداد عدة عينات، وجعل ماجستير يمزج مع حجم إضافي 10٪.

  1. تهجين أوليغو واستنزاف الرنا
    1. إعداد أوليغو التهجين مزيج رئيسي (المجموع = 11 ميكرولتر، مع 4.4 ميكرولتر من العازلة التهجين، 4.4 ميكرولتر من أليغوس التهجين، و 2.2 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase) ومزيج سيد استنفاد (المجموع = 5.5 ميكرولتر، مع 3.3 ميكرولتر من العازلة استنزاف و 2.2 μL من RNase HNase).
    2. إعداد برنامج تفاعل PCR على ثيرسيكلر: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ منحدر إلى 45 درجة مئوية عند -0.1 درجة مئوية / س؛ 45 درجة مئوية وقفة؛ 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ 4 درجة مئوية إلى الأبد.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك البدء بمضاعفة مقدار الحمض النووي الريبي من الضروري للتضخيم. في المحاولة الأولى، استخدم نصف المبلغ للمتابعة مع الخطوات التالية. هذا هو للتأكد من أن هناك مادة لا تزال لتكرار هذه الخطوات مع عدد مختلف من دورات (انظر الخطوة 4.7.2)، إذا كانت دورات التضخيم تتحول إلى أن تكون غير كافية أو overamplified.
    3. استخدام بين 25 نانوغرام و 1 ميكروغرام من مجموع RNA في 10 ميكرولتر من المياه RNAse خالية، إضافة 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي التهجين oligo. ضع عينات في ثيرسيكلولر مبرمجة مسبقا وبدء البرنامج.
    4. عندما يصل البرنامج إلى خطوة الإيقاف المؤقت عند 45 درجة مئوية، أضف 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للاستنفاد إلى تفاعل التهجين 20 ميكرولتر دون إزالته من الدراجات الحرارية. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    5. استئناف برنامج الدراجات الحرارية لمواصلة مع الخطوة استنفاد (45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة).
      ملاحظة: 1) وضع الخرز لاستنفاد RRNA (على سبيل المثال، الخرز النقي KAPA) في درجة حرارة الغرفة (RT) أثناء خطوة استنفاد للجزء التالي من البروتوكول. 2) النظر في إعداد مزيج DNase الهضم الرئيسي (للقسم 4.2)، منذ هناك حاجة إلى الكواشف مباشرة بعد تنظيف استنفاد RRNA.
    6. تنفيذ 2.2x الخرز القائم على تنظيف الخرز النقي KAPA: الجمع بين مزيج RNA (25 ميكرولتر) والخرز النقي كابا (55 ميكرولتر), عن طريق resuspend تماما الخرز في مزيج RNA عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    7. احتضان في RT لمدة 5 دقائق للسماح للرنا ملزمة الخرز، ووضع أنبوب (ق) على رف المغناطيس لالتقاط الخرز حتى السائل هو واضح، وإزالة بعناية وتجاهل 60 ميكرولتر من افر.
    8. حفظ أنبوب (ق) على المغناطيس، وغسل 2x مع 200 ميكرولتر من 80٪ الإيثانول عن طريق احتضان الخرز مع الإيثانول لمدة ≥30 s والتخلص من الإيثانول. في محاولة لإزالة كل الإيثانول المتبقية دون إزعاج الخرز بعد غسل الثانية.
    9. جففي الخرز في RT لمدة 3-5 دقائق أو حتى يتبخر كل الإيثانول.
      ملاحظة: قد يؤدي الإفراط في تجفيف الخرز إلى انخفاض الغلة.
  2. هضم الدناس
    1. إعداد DNase الهضم مزيج ماجستير (المجموع = 22 ميكرولتر، مع 2.2 ميكرولتر من العازلة DNase، 2 ميكرولتر من DNase، و 17.8 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase) .
    2. Resuspend الخرز في DNAse مزيج ماجستير الهضم (20 ميكرولتر) عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان الأنبوب (ق) في RT لمدة 3 دقائق لteute الجيش الملكي النيبالي قبالة الخرز.
    3. ضع الأنبوب (الأنفاق) على رف مغناطيس لالتقاط الخرز ، حتى يصبح السائل واضحًا ، ونقل 20 ميكرولتر من المابير إلى أنبوب نظيف.
    4. احتضان الأنبوب (ق) مع سوبرنات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: النظر في إعداد elution RNA, تجزئة, وخلطات رئيسية فتيلة (للقسم 4.3), منذ الكواشف هي الحاجة مباشرة بعد تنظيف الهضم DNase.
    5. قم بإجراء تنظيف 2.2x على أساس الخرز باتباع 4.1.6-4.1.9.
  3. رنا elution، والتجزئة، والتشمير
    1. إعداد جزء، رئيس و Elute العازلة (1x) مزيج الرئيسي مع 11 ميكرولتر من جزء، رئيس والعازل العازلة (2x) و 11 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase.
    2. resuspend بدقة الخرز مع تنقية، DNase المعالجة RNA في 22 ميكرولتر من التشرذم، رئيس والعزلة Elute (1x) عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لsteute RNA قبالةق حبة، ثم وضع أنبوب (ق) على المغناطيس لالتقاط الخرز حتى السائل هو واضح.
    4. نقل بعناية 20 ميكرولتر من افرات في أنبوب (ق). تجاهل الأنبوب (ق) مع الخرز.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة، حيث يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية مقابل ≤24 ساعة.
    5. ضع الأنبوب (الانابيب) في ثيرموسيفير و نفذ التفتيت و التشظي عند 94 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. ينتج عنه شظايا 200-300 بريتيش في المدى التقريبي.
      ملاحظة: احتضان لمدة 8 دقائق في 94 درجة مئوية لشظايا 100-200 bp. عند استخدام الحمض النووي الريبي المتدهورة جزئيا، تجزئة بين 1-6 دقيقة في 85 درجة مئوية اعتمادا على شدة التدهور.
    6. وضع أنبوب (ق) على الجليد والمضي قدما على الفور إلى التوليف حبلا الأولى.
  4. أول تخليق حبلا
    1. إعداد أول تخليق التوليف مزيج ماجستير (المجموع = 12 ميكرولتر، مع 11 ميكرولتر من أول مخزن توليف حبلا و 1 ميكرولتر من الكتابة الكابا).
    2. إعداد برنامج تفاعل PCR على ثيرسيكلر: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛ 4 درجة مئوية إلى الأبد.
    3. على الجليد، والجمع بين 20 ميكرولتر من رنا مُفَجَّر مُفَتَجَّر مع 10 ميكرولتر من أول مزيج رئيسي توليفي. الحفاظ على أنبوب (ق) على الجليد، مزيج جيدا عن طريق الأنابيب بلطف رد فعل صعودا وهبوطا عدة مرات.
    4. ضع الأنبوب (الانابيب) في الدراجات الحرارية المبرمجة مسبقاً وابدأ البرنامج.
  5. توليف حبلا الثاني وذيل A
    1. إعداد التوليف حبلا الثاني و A-ذيل مزيج الماجستير على الجليد (المجموع = 33 ميكرولتر، مع 31 ميكرولتر من العازلة التوليف حبلا الثاني و 2 ميكرولتر من توليف حبلا الثاني و A-ذيل مزيج انزيم).
    2. إعداد برنامج تفاعل PCR على ثيرسيكلر: 16 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ 62 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 4 درجة مئوية إلى الأبد.
    3. الجمع بين 30 ميكرولتر من أول منتج التوليف حبلا مع 30 ميكرولتر من التوليف حبلا الثانية ومزيج الماجستير A-الذيل، ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات على الجليد.
    4. ضع الأنبوب (الانابيب) في الدراجات الحرارية المبرمجة مسبقاً وابدأ البرنامج.
  6. ربط المحول وتنظيف ما بعد الربط
    1. محوّلات الأسهم المخففة (الباركود الحمض النووي NEXTflex، 25 ميكرومتر) 3.57x في مياه خالية من RNase إلى 7 ميكرومتر.
    2. إعداد محول الربط مزيج ماجستير (المجموع = 50 ميكرولتر، مع 40 ميكرولتر من العازلة الربط و 10 ميكرولتر من الحمض النووي ligase).
    3. الجمع بين 60 ميكرولتر من المنتج التوليف حبلا الثاني، 45 ميكرولتر من محول مزيج رئيسي الربط، و 5 ميكرولتر من المحولات المخففة. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات على الجليد.
    4. احتضان الأنابيب في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتستمر على الفور مع تنظيف بعد الربط الأول.
    5. إجراء تنظيف 0.63x على أساس الخرز من خلال الجمع بين الحمض النووي المهايئ (110 ميكرولتر) والخرز النقي KAPA (70 ميكرولتر) ، ثم إعادة ربط حبات في مزيج الحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    6. كرر الخطوات 4.1.7-4.1.9.
    7. إزالة الأنابيب من المغناطيس. إعادة بناء جيدا الخرز في 50 ميكرولتر من 10 mM تريس HCL (PH = 8.0-8.5) واحتضان الخرز في RT لمدة 2 دقيقة.
    8. ضع اللوحة على المغناطيس وانتظر حتى يصبح السائل واضحًا. نقل 50 ميكرولتر من اضحة فائقة إلى أنبوب جديد.
      ملاحظة: نقطة توقف آمنة لأقل من 24 ساعة عند 4 درجة مئوية.
    9. قم بإجراء تنظيف قائم على الخرز 0.7x من خلال الجمع بين 50 ميكرولتر من الخرز مع الحمض النووي المنقى للمحوّل مع محلول PEG/NaCL 35 ميكرولتر. اخلطي جيداً عن طريق الدوامة.
    10. تنفيذ خطوات التنظيف 4.1.7-4.1.9. إعادة بناء حبات بدقة في 20 ميكرولتر من 10 mM تريس HCL (PH = 8.0-8.5)، واحتضان الخرز في RT لمدة 2 دقيقة.
    11. وضع لوحة على المغناطيس؛ انتظر حتى يصبح السائل واضحاً. نقل 20 ميكرولتر من اضحة فائقة إلى أنبوب جديد والمضي قدما في القسم 4.7.
      ملاحظة: نقطة توقف آمنة لأقل من أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية أو أقل من شهر واحد عند -20 درجة مئوية.
  7. تضخيم المكتبة وتنظيفها
    1. إعداد المكتبة المزيج الرئيسي التضخيم (المجموع = 33 ميكرولتر، مع 27.5 ميكرولتر من 2x كابا هاي فاي HotStart ReadyMix و5.5 ميكرولتر من 10x مكتبة المزيج التمهيدي التضخيم).
    2. قم بإعداد برنامج تفاعل PCR على دراجة حرارة باستخدام المعلمات التالية. 98 درجة مئوية لـ 45 s؛ N دورات (انظر الملاحظة أدناه) من: 98 درجة مئوية لمدة 15 s; 60 درجة مئوية لمدة 30 s؛ 72 درجة مئوية لمدة 30 s؛ 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة؛ و 4 درجة مئوية إلى الأبد.
      ملاحظة: تعتمد دورات تضخيم المكتبة على مواد الإدخال. ويمكن تقديرها تقريبا على هذا النحو: بدءا من RNA = 25-100 نانوغرام، N = 11-15 دورات؛ 100-250 نانوغرام، N = 9-12 دورات؛ 250-500 نانوغرام، N = 7-10 دورات.
    3. إجراء تنظيف 0.8x القائم على الخرز من خلال الجمع بين الحمض النووي مكتبة تضخيم (50 ميكرولتر) والخرز النقي KAPA (40 ميكرولتر)، ثم إعادة حفظ جيدا الخرز في مزيج الحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    4. تنفيذ خطوات التنظيف 4.1.7-4.1.9. بدقة إعادة تعليق الخرز في 50 ميكرولتر من 10 mM تريس HCL (PH = 8.0-8.5)، واحتضان الخرز في RT لمدة 2 دقيقة.
    5. نقل 50 ميكرولتر من اضحة فائقة إلى أنبوب جديد والمضي قدما في تنظيف تضخيم المكتبة الثانية.
    6. إجراء تنظيف 1x على أساس حبة من خلال الجمع بين الحمض النووي مكتبة مكبرة (50 ميكرولتر) والخرز النقي KAPA (50 ميكرولتر)، ثم إعادة تجميع جيدا الخرز في مزيج الحمض النووي عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
    7. تنفيذ خطوات التنظيف 4.1.7-4.1.9. إعادة بناء حبات بدقة في 22 ميكرولتر من 10 mM تريس HCL (PH = 8.0-8.5)، واحتضان الخرز في RT لمدة 2 دقيقة.
    8. نقل 20 ميكرولتر من نابيرانت واضحة إلى أنبوب جديد المضي قدما إلى قياسات Qbit وbioanalyzer.
  8. تركيز وتجزئة حجم
    1. قياس تركيزات الحمض النووي للعينات. باستخدام مجموعة صبغ الفلورسنت عالية الحساسية (على سبيل المثال، Denovix Qbit، انظر جدول المواد)،أو إذا كان التركيز يبدو أقل من 0.5 نانوغرام/ميكرولتر، requantify باستخدام نهج qPCR أكثر حساسية (على سبيل المثال، كابا الكم، انظر جدول المواد).
    2. تحديد حجم جزء المكتبة، باستخدام الكهرباء الحساسة العالية (على سبيل المثال، التحليل الحيوي).
      ملاحظة: اختيارياً، يمكن إجراء مراقبة الجودة بواسطة qPCR قبل التسلسل (الملحق) باستخدام مكتبة معدة مخففة بدلاً من cDNA.
  9. التسلسل
    1. إرسال المكتبة لتسلسل. بالنسبة لتحليل التعبير الجيني التفاضلي للرنا- seq، يكون عمق تسلسل القراءات بين 10-25 مليون لكل عينة كافياً بشكل عام.

5- المعالجة المسبقة للبيانات

  1. جودة الاختيار الملفات Fastq
    1. تحميل وتثبيت تريمغالور16 لإزالة أزواج قاعدة منخفضة الجودة وفارغة يقرأ داخل الملفات Fastq.
      ملاحظة: 1) معظم البرامج المذكورة هنا يعمل فقط في لينكس. إذا كان مقصورا على جهاز كمبيوتر ويندوز ، فمن الممكن لتشغيل التحليلات على خادم لينكس باستخدام برنامج MobaXterm أو المعجون. ضع في اعتبارك أن لفهرسة الجينوم الكثير من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) مطلوب (حوالي 64 غيغابايت). 2) من المستحسن للغاية تثبيت جميع البرامج المطلوبة في بيئة conda. وهذا سيسمح سهلة تثبيت البرامج وإدارة الحزمة. لمزيد من المعلومات حول كوندا، قم بزيارة .
    2. إنشاء دليل (مجلد) للبيانات على سبيل المثال المجلد 'RNA_seq_KC_diff'. تعيين هذا الدليل دليل العمل بكتابة: "القرص المضغوط /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      ملاحظة: للحصول على نظرة عامة حول بنية المجلد راجع 'folder_structure.txt' في ملفات الترميز التكميلية.
    3. إنشاء مجلدات متعددة في دليل العمل مع أسماء محددة: 'Fastq'، 'CRCh38_fasta'، 'CRCh38'، 'البرامج النصية'، و 'تعيين'.
    4. نقل الملفات fasta من البيانات المتسلسلة إلى المجلد fastq. بدلاً من ذلك، إنشاء ارتباطات ناعمة باستخدام الأمر: "ln -s المنزل/ المستخدم/ old_location_fastq/ FastqFile المنزل / المستخدم / RNAseq_KC_diff / Fastq / Fastqfile" إلى ملفات Fastq لتوفير مساحة القرص.
    5. تشغيل وافر تريم على الملفات Fastq، راجع الملف TrimGalore.txt للتعليمات البرمجية لنسخ لصق في bash. تغيير أسماء المجلدات والإعدادات داخل الأمر عند الضرورة.
  2. تعيين
    1. تحميل الجينوم لرسم خريطة القراءة إلى, على سبيل المثال, hg38 ensembl الإفراج 97 (نسخة غير مقن]): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz; والمقابلة ملف التعليقات التوضيحية الجينية: hg 38 الجينات التعليق ensembl الإفراج 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. نقل كلا الملفين إلى المجلد CRCh38_fasta.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك استخدم نسخة مختلفة من الجينوم، على سبيل المثال، إصدار UCSC hg38، إذا كان التخطيط لمذكّرات النص بدلاً من الذّاتر مُفضّل.
    2. تثبيت STAR 2.7.117.
    3. توليد الجينوم المرجعية في المنزل باستخدام STAR 2.7.1 بواسطة برنامج الجينوم توليد (انظر ملفات التشفير التكميلي). تغيير مقدار مؤشرات الترابط إلى ما لدى processer (--runThreadN X). تغيير أسماء المجلدات والإعدادات في هذا البرنامج النصي عند الضرورة. تشغيله عن طريق نسخ / لصق في باش.
    4. تثبيت samtools 1.918 لفهرسة ملفات بام وgzip لضغط الملفات تذبذب.
    5. محاذاة تريم جالور التحقق من صحة تسلسل يقرأ إلى الجمعية الجينوم البشري hg38 (ensembl الإصدار 97) باستخدام STAR 2.7.1 تليها فهرسة باستخدام samtools وgzip. يجب أن يتم ذلك باستخدام map_fastq.txt البرنامج النصي (انظر ملفات التشفير التكميلية). تغيير أسماء المجلدات والإعدادات في هذا البرنامج النصي عند الضرورة. تشغيله عن طريق نسخ / لصق في باش.
      ملاحظة: ينشئ تعيين STAR ملفات الإخراج العديدة بما في ذلك ملف bam وملف تذبذب و جدول عدد القراءة المسمى * _ReadsPerGene.out.tab، والتي يمكن استخدامها مباشرةً من قبل R لاستخدامها كمدخلات لـ Deseq2.
  3. التصور الجينوم المستعرض
    1. تثبيت wigToBigWig من أدوات متصفح الجينوم UCSC لتوليد ملفات bigwig مع السيناريو big2bw19.
    2. نقل الملفات 'convertBigWigChroms.py' و 'CRCH38_ensembl2UCSC.txt' من ملفات الترميز التكميلية إلى مجلد 'البرامج النصية' في دليل العمل.
    3. جعل convertBigWigChroms.py قابل للتنفيذ (باستخدام الأمر: 'chmod + x مخطوطات / تحويلBigWigChroms.py' على جهاز لينكس).
    4. إنشاء ملفات bigWig من ملفات Wiggle، باستخدام البرنامج النصي wig2bw.txt (انظر ملفات التشفير التكميلية). تشغيله عن طريق نسخ / لصق في باش.
    5. إدخال ملفات BigWig على مستعرض الجينوم UCSC أو عارض الجينوم التكاملي (IGV) للتصور.

6 - تحليل بيانات الحمض النووي الريبي -seq

  1. إدخال بيانات عينة في Deseq2
    1. تحميل وتثبيت Rstudio (الإصدار 1.1.456) و R (الإصدار 3.6).
    2. تثبيت كافة حزم R المطلوبة (انظر ملفات التشفير التكميلية).
      ملاحظة: للحصول على ملف R-markdown مفصلة تظهر كافة التعليمات البرمجية و الإخراج، راجع الملفات المرفقة: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" و "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". ويرد أدناه وصف عام لجميع الخطوات.
    3. إنشاء جدول عدد من الملفات ReadsPerGene.out.tab.
    4. اكتب نموذج ملف بيانات يحتوي على كافة أسماء الملفات يوم التمايز و بيانات أخرى ذات صلة. للحصول على مثال على نموذج الملف، راجع "sample_data_example.csv" في ملفات التشفير التكميلية.
    5. استخدام جدول عدد و عينات البيانات لإنشاء كائن Deseq220 يحتوي على كل من بيانات قابل للعد و نموذج.
  2. تطبيع التعبير الجيني، مسافة العينة والأنيسول الخماسي الكلور
    1. تطبيع جدول العد في Deseq2 الكائن، باستخدام إما Deseq2 rld أو vst البسط. ويفضل التطبيع RLD، ولكن مع العديد من العينات، التطبيع VST هو أسرع بكثير.
    2. رسم عينة المسافة على أساس كثافة عدد قراءة تطبيع باستخدام"dist"وظيفة في R وبعد ذلك تنفيذ"hclust"التجمع على أساس مسافة العينة. رسم خريطة الحرارة نفسها باستخدام حزمة فياتاب.
    3. إنشاء مؤامرة PCA من كثافة عدد قراءة تطبيع باستخدام الدالة plotPCA Deseq2.
      ملاحظة: يعمل PCA كأداة في تحليل البيانات الاستكشافية ويمكن استخدامه لتصور المسافة والتعلق بين عينات مختلفة.
  3. تحليل التعبير الجيني التفاضلي/المتغير بدرجة عالية
    1. حساب إما الجينات التفاضلية باستخدام دالة النتيجة Deseq2. ومع ذلك، عند تقييم التغيرات عبر عدة نقاط زمنية لا تنطبق فيها المقارنات الزوجية، استخدم جينات شديدة التغير. في هذه الحالة، استخراج أعلى 500 الجينات متغير للغاية عن طريق ترتيب على التباين بين العينات من نقاط زمنية مختلفة مع وظيفة rowVars.
      ملاحظة: في تحليلنا، بالنسبة لعينات التحكم، تم استخدام أعلى 500 جينات متغيرة للغاية (الجينات ذات الانحراف المعياري الأعلى لشدة المعتادة عبر أيام التمايز) لمزيد من التحليل. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل مكافحة المرضى مقابل الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي بين المرض والضوابط الصحية مع مرور الوقت تم حسابها بواسطة Deseq2 باستخدام اختبار متعددة تصحيح قيمة ف من 1 × 10-4 كقطع. آخر خطوة ممكنة تصفية هو استبعاد الجينات التفاضلية تغيير أقل من قطع تغيير أضعاف معينة.
    2. تنفيذ kmeans التجمع على الجينات التفاضلية أو عالية المتغيرة لتجميع لهم أنماط التعبير المختلفة.
    3. تصور الجينات التفاضلية أو المتغيرة للغاية في خريطة الحرارة باستخدام حزمة فياتماب. الكثافة المرسومة في خريطة الحرارة هي كثافة Deseq2 تطبيع مع القيمة الوسيطة المطروحة.
  4. تحليل إثراء التعليق التوضيحي (GO) الجيني (GO)
    1. إنشاء قائمة من الجينات الخلفية أعرب عن طريق اتخاذ جميع الجينات مع أكثر من 10 العد في عينة واحدة.
    2. إجراء التحليل GO باستخدام أدوات على الانترنت مثل GOrilla21. استخدام قوائم الجينات التفاضلية /عالية التغير في مجموعات "قائمة الجينات"، وجينات الخلفية كخلفية للمقارنة.
      ملاحظة: أكثر متقدمة R-المستخدمين يمكن استخدام حزمة clusterProfiler22 لأتمتة تحليل الإثراء Go-term.

النتائج

التمايز العادي في الكيراتينوسيت وتحليل الحمض النووي الريبي -seq
في هذه التجربة، استخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز وتحليلات الحمض النووي الريبي- الصد. ويلخص الشكل 1 الإجراء التجريبي للتمايز ونتائج تحليل الحمض النووي الريبي -seq. ويتضح في

Discussion

يصف هذا العمل طريقة لحفز تمايز الكيراتينوسيت البشري والتوصيف اللاحق باستخدام تحليلات الحمض النووي الريبي الريبي. في الأدب الحالي، العديد من الدراسات على تمايز الكيراتينوسيت البشري استخدام طريقتين آخرين، مع تركيز الكالسيوم عالية أو مع المصل كأساليب للحث على التمايز2,<...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا البحث من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010، H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); زمالة جامعة رادبود (H.Z.); ومنحة مجلس المنح الدراسية الصينية 201406330059 (J.Q.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)LonzaPart of the bulletKit
CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaPart of the bulletKit
InsulinLonzaPart of the bulletKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA synthesisBio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

References

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
  13. . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
  14. Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
  15. . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
  16. . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
  34. . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159 keratinocytes 2D RNA eq p63

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved