Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן הוא הליך צעד צעד עבור הבידול במבחנה של keratinocytes האדם העיקרי על ידי עיכוב מגע ואחריו אפיון ברמה המולקולרית על ידי ניתוח RNA-seq.

Abstract

keratinocytes האדם העיקרי משמשים לעתים קרובות כמו מודלים חוץית עבור מחקרים על בידול אפידרמיס ומחלות קשורות. שיטות דווחו עבור בידול במבחנה של keratinocytes תרבות דו מימדי (2D) נימוסים שקועים באמצעות תנאי אינדוקציה שונים. מתואר כאן הוא הליך עבור 2D בשיטת בידול קרבינוציט במבחנה על ידי עיכוב מגע ואפיון מולקולרי הבאים על ידי RNA-seq. בקצרה, keratinocytes גדלים במדיום keratinocyte מוגדר בתוספת עם גורמי גדילה עד שהם confluent באופן מלא. בידול מושרה על ידי מגעים קרובים בין keratinocytes מגורה עוד יותר על ידי הוצאת גורמי גדילה במדיום. באמצעות ניתוחי RNA-seq, הוא מוצג כי שניהם 1) keratinocytes מובדל להפגין חתימות מולקולריות נפרדות במהלך בידול ו 2) דפוס ביטוי גנים דינמי דומה במידה רבה תאים במהלך ריבוד אפידרמיס. באשר להשוואה להבדיל keratinocyte נורמלי, keratinocytes נושא מוטציות של גורם שעתוק p63 התערוכה מורפולוגיה שונה וחתימות מולקולריות, עולה בקנה אחד עם פגמי הבידול שלהם. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את השלבים עבור בידול 2D במבחנה keratinocyte ואת האפיון המולקולרי שלה, עם דגש על ניתוח ביואינפורמטיק של נתוני RNA-seq. מכיוון שהליכי החילוץ וה-RNA-seq תועדו היטב, אין זה המוקד של פרוטוקול זה. ההליך הניסיוני של בידול קרבטינוציט במבחנה וצינור ניתוח ביואינופורמטי יכול לשמש כדי ללמוד אירועים מולקולריים במהלך בידול אפידרמיס ב keratinocytes בריא וחולה.

Introduction

keratinocytes האדם העיקרי נגזר העור האנושי משמשים לעתים קרובות כמודל סלולרי כדי ללמוד את הביולוגיה שלהאפידרמיס 1,2,3,4. השכבות של האפידרמיס יכול להיות מודל על ידי בידול keratinocyte, או באופן מונודאלי שקוע 2D או 3D אוויר הרמת organotypic מודל2,3,5,6,7. למרות מודלים 3D הפכו חשובים יותר ויותר כדי להעריך את המבנה האפידרמי ואת הפונקציה, מודלים בידול 2D עדיין בשימוש נרחב, בשל הנוחות שלהם ואת האפשרות ליצור מספר גדול של תאים לניתוחים.

תנאים שונים הוחלו על גורם בידול keratinocyte ב 2D, כולל תוספת של סרום, ריכוז גבוה של סידן, טמפרטורה נמוכה יותר ועיכוב של קולטני גורם גדילהאפידרמיס 2,3. כל אחת משיטות אלה אומתה על ידי מספר גנים סמן בידול keratinocyte והוצג להיות יעיל בהערכת בידול keratinocyte, כולל בתנאים פתולוגיים. עם זאת, תנאי אינדוקציה אלה גם מראים הבדלים ביעילות ההבידול שלהם קינטיקה כאשר לוחות ספציפיים שלגנים סמן נבחנים 2,3.

אחת השיטות האלה כרוכה עיכוב מגע keratinocyte ודלדול של גורמי גדילה במדיום התרבות8. זה כבר הראה כי keratinocytes יכול להבדיל באופן ספונטני כאשר תאים מגיעים לצפיפות מלאה.  לא כולל גורמי גדילה במדיום התרבות יכול לשפר עוד יותר את ההבידול. השיטה המשלבת עיכוב מגע ומרוקן גורמי גדילה כבר הראו לייצר keratinocytes מובדיל עם דפוסי ביטוי גנים דומים אפידרמיס מרובד נורמלי בעת שימוש במספר סמניםאפידרמיס 3, המצביע על כך מודל זה מתאים ללימוד בידול keratinocyte נורמלי. לאחרונה, שני ניתוחי ביטוי גנים מקיפים של בידול keratinocyte באמצעות מודל זהדווחו 9,10. החוקרים אימתו מודל זה ברמה המולקולרית והראו כי ניתן להשתמש בו כדי ללמוד בידול קרטינוציט נורמלי וחולה.

פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור שיטת הבידול במבחנה וניתוח מולקולרי של תאים מובדילים באמצעות RNA-seq. היא גם ממחישה את האפיון של התמלילים של תאים ביום הבידול 0 (שלב ההתפשטות), היום השני, היום 4 ויום 7 (מוקדם, אמצע, ואיחור בבידול, בהתאמה). הוא מוצג כי keratinocytes מובדיל להציג דפוסי ביטוי גנים הדומים במידה רבה לתאים במהלך ריבוד אפידרמיס. כדי לבחון אם שיטה זו יכולה לשמש לחקר פתולוגיה של העור, יינו את אותו צינור ניסיוני וניתוח לחקור keratinocytes נושא מוטציות של גורם שעתוק p63 הנגזרים מחולים עם ectrodactyly, דיספלזיה אקטודרמלית ושסוע שפה / חיך (EEC)תסמונת 11,12. פרוטוקול זה מתמקד בבידול המבחנה של keratinocytes, כמו גם ניתוח ביואינפורמטיק עוקבות של RNA-seq. שלבים אחרים בהליך המלא כגון חילוץ RNA, הכנת מדגם RNA-seq ובניית ספרייה, מתועדים היטב ותועדים בקלות, במיוחד בעת שימוש ערכות מסחריות נפוצות רבות. לכן, שלבים אלה מתוארים לזמן קצר בלבד בפרוטוקול. הנתונים מראים כי צינור זה מתאים לחקר אירועים מולקולריים במהלך בידול אפידרמיס בkeratinocytes בריא וחולה.

Protocol

ביופסיות העור נלקחו מתא המטען של מתנדבים בריאים או חולים עם מוטציות p63, כדי להגדיר את התרבות keratinocyte העיקרית. כל ההליכים בנוגע להקמת קרטינוציטים עיקריים אנושיים אושרו על ידי הוועדה האתית של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רדבוד ניימכן ("קומיסי מנזגבונדן אונדרזוק ארנהם-ניימכן"). הושגה הסכמה מדעת.

1. בידול keratinocyte העיקרי האנושי על ידי עיכוב מגע

  1. הכן keratinocyte צמיחה בינונית (KGM) מ Keratinocyte באסל בינוני(טבלת חומרים) בעתהצורך.
  2. הפוך 500 מ"ל התפשטות בינוני באמצעות מניות מוכנות מראש (KGM-pro; ראה טבלה 1).
  3. הפוך את הבדיל של 500 מ"ל למדי (KGM-dif; ראה טבלה 2).
    הערה: KGM עם תוספי מזון ניתן לשמור ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועיים. לאחסון ארוך יותר, ניתן לצטט אותו ולאחסן אותו ב- -20°C.
  4. זרע keratinocytes הראשי בצפיפות של 5.0–20 x 103 תאים / ס"מ 2 ,בהתאםלקיבולת התפשטות התא. הוסף מספיק KGM-pro בינוני כדי לכסות את התאים.
    הערה: 1) פרטים על תרבות תא רגילה בתוך KGM בינוני ניתן למצוא באתר האינטרנט של Lonza13. 2) צפיפות זריעה צריך להיבדק עבור כל קו תא. לדוגמה, קו keratinocyte ראשי רגיל ניתן לזרוע בצפיפות של 5.0 x 103 תאים / ס"מ2, ואילו קו נושא מוטציות בגורם שעתוק p63 כי הוא פחות proliferative יש לזרוע בצפיפות של 20 x 103 תאים / ס"מ2. 3) בהתאם להגדיר ניסיוני, מספר כלים או בארות של תאים צריך להיות זריעה כדי לאפשר איסוף דגימות על ימי בידול שונים בהעתקים.
  5. רענן תאים עם KGM-pro מדיום במשך יומיים לאחר זריעה (זריעה ביום 0, מרענן עבור1 בפעם הראשונה ביום 3). לאחר מכן, רענן עם KGM-pro מדיום כל יומיים. בדוק תאים באופן קבוע, לפחות בכל יום אחר.
  6. לגרום בידול תאים כאשר תאים הם יותר מ 90% confluent על ידי שינוי המדיום כדי KGM-dif. יום החלפת המדיום ל-KGM-dif מוגדר כיום בידול 0. לאסוף תאים לניתוחי RNA נוספים על ידי כביסה ראשונה 2x עם DPBS, לאחר מכן הוספת מאגר lysis (מתוך ערכת חילוץ RNA).
    הערה: עם צפיפות זריעה הנ"ל, תאים אמורים להגיע confluency בתוך 7-10 ימים. תאים יכולים להיות זרעים עם צפיפות ראשונית גבוהה יותר כדי להגיע confluency מוקדם יותר. אם תאים אינם משגשגים, המתנה ארוכה יותר לא יכול לגרום להועלת תאים confluent באופן מלא. ייתכן שתידרשו צפיפות זריעה גבוהה יותר.
  7. רענן תאים עם ה-KGM-dif medium מדי יום ואיסוף תאים ביום בידול 2, 4. ו-7 לחילוץ רנ"א נוסף.

2. חילוץ RNA

    3. בדיקת איכות RNA

    1. הפעל RNA או על שבב bioanalyzer RNA Pico כדי לאמת את מספר תקינות RNA (RIN) כמותי, או על ג'ל עבור מדד איכותי. באופן כללי, RIN של לפחות שמונה מומלץ מאוד. עם זאת, בעת חילוץ RNA מרקמות RIN עשוי להיות נמוך יותר.
      הערה: לחלופין, בקרת איכות יכולה להתבצע על-ידי qPCR בחומר RNA.

    4. הכנת ספריית RNA-seq

    הערה: הכנת ספריית RNA-seq מתבצעת לעתים קרובות עם ערכה מסחרית או תחת הגדרות מסחריות. הפרוטוקול המתואר מותאם מתוך ערכה מסחרית, KAPA RNA HyperPrep Kit עם RiboErase (Illumina), עם תיאור קצר של כל השלבים הנדרשים: דלדול rRNA עם הכלאה אוליגו RNAs ריבוזומלי אנושי, פיצול RNA, סינתזה גדיל ראשון, סינתזה גדיל שני ו- A-tailing, וניקוי לאחר כלשלב 15. ערכות הכנה אחרות לספרייה יכולות לשמש גם למטרה זו. מומלץ לבצע שלב זה באמצעות ערכה מסחרית זמינה, כמו האיכות של ספריית cDNA שנוצר הוא לעתים קרובות עקבי יותר. 2) השלבים הבאים מתוארים עבור הכנת ספריית 1x. אם מכינים מספר דוגמאות, בצע ערבובי אב עם 10% אמצעי אחסון נוספים.

    1. הכלאה אוליגו ודלדול RRNA
      1. להכין תערובת אב היברידית אוליגו (סה"כ = 11 μL, עם 4.4 μL של מאגר הכלאה, 4.4 μL של אוליגוס היברידית, ו 2.2 μL של מים ללא RNase) ותמהיל אב דלדול (סה"כ = 5.5 μL, עם 3.3 μL של מאגר דלדול ו 2.2 μL של RNase H).
      2. כוונן את תוכנית התגובה PCR על תרמוצ'יקלר: 95 °C במשך 2 דקות; רמפה עד 45 °C ב -0.1 °C / s; 45 °C הפסקה; 45 °C במשך 30 דקות; 4 מעלות צלזיוס לנצח.
        הערה: שקול להתחיל בכמות כפולה של RNA מהנדרש להגדלה. בניסיון הראשון, השתמש בחצי מהסכום כדי להמשיך בשלבים הבאים. זה כדי לוודא כי יש עדיין חומר לחזור על שלבים אלה עם מספר שונה של מחזורים (ראה שלב 4.7.2), אם מחזורי ההגדלה לבסוף להיות לא מספיק או יתר על כן.
      3. להשתמש בין 25 ng ו 1 μg של RNA הכולל ב 10 μL של מים ללא RNAse, להוסיף 10 μL של תערובת אב היברידית אוליגו. מקם דגימות בתרמוצ'יקלר המתוכנת מראש והתחיל את התוכנית.
      4. כאשר התוכנית מגיעה לשלב ההשהיה ב 45 °C, להוסיף 5 μL של תערובת אב דלדול לתגובה היברידית 20 μL מבלי להסיר אותו מן thermocycler. מערבבים היטב על ידי התפתלות למעלה ומטה מספר פעמים.
      5. חדש את תוכנית thermocycler כדי להמשיך עם שלב הדלדול (45 °C למשך 30 דקות).
        הערה: 1) לשים את החרוזים עבור דלדול rRNA (למשל, KAPA חרוזים טהורים) בטמפרטורת החדר (RT) במהלך שלב דלדול עבור החלק הבא של הפרוטוקול. 2) שקול להכין את תערובת תבנית העיכול DNase (עבור סעיף 4.2), שכן ריאגנטים נדרשים ישירות לאחר ניקוי דלדול rRNA.
      6. בצע ניקוי חרוזים טהורים מבוססי חרוז 2.2x KAPA: לשלב את תערובת RNA (25 μL) ו KAPA Pure חרוזים (55 μL), על ידי ביסודיות respend את החרוזים בתערובת RNA על ידי pipetting למעלה ו למטה מספר פעמים.
      7. דגירה ב RT במשך 5 דקות כדי לאפשר RNA מחייב את החרוזים, ולמקם את הצינור(ים) על מתלה מגנט כדי ללכוד את החרוזים עד הנוזל ברור, בזהירות להסיר ולזרוק 60 μL של supernatant.
      8. שמירה על הצינור(ים) על המגנט, לשטוף 2x עם 200 μL של 80% אתנול על ידי דגירה חרוזים עם אתנול עבור ≥30 s ולהיפטר את האתנול. נסה להסיר את כל שאריות האתנול מבלי להפריע לחרוזים לאחר השטיפה השנייה.
      9. מייבשים את החרוזים ב-RT למשך 3-5 דקות או עד שכל האתנול מתאדה.
        הערה: ייבוש יתר של החרוזים עלול לגרום לתשואה מופחתת.
    2. DNase עיכול
      1. להכין תערובת תבנית DNase מאסטר (סה"כ = 22 μL, עם 2.2 μL של מאגר DNase, 2 μL של DNase, ו 17.8 μL של מים ללא RNase) .
      2. תוסתה מחדש את החרוזים בתמהיל ראשי לעיכול DNAse (20 μL) על ידי התזת למעלה ומטה מספר פעמים. דגירה את הצינור(ים) ב RT במשך 3 דקות כדי לתגות את RNA את החרוזים.
      3. מניחים את הצינור על מדף מגנט כדי ללכוד את החרוזים, עד שהנוזל נקי, ולהעביר בזהירות 20 μL של supernatant לתוך צינור נקי.
      4. דגירה את הצינור עם supernatant ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
        הערה: שקול להכין את תערובות ההתפכחות, הפיצול וההתמרמרות הראשיות (עבור סעיף 4.3), מאחר שדרושים ישירות לריאגנטים לאחר ניקוי העיכול של DNase.
      5. בצע ניקוי מבוסס חרוזים של 2.2x על-ידי ביצוע 4.1.6-4.1.9.
    3. תסיסה, פיצול והתגנדרות RNA
      1. הכן את תערובת הבסיס של שבר, פריים ו-Elute Buffer (1x) עם 11 μL של שבר, מאגר פריים ו-Elute (2x) ו-11 μL של מים ללא RNase.
      2. ביסודיות resspend את החרוזים עם מטוהר, DNase שטופל RNA ב 22 μL של פיצול, פריים וחוצץ Elute (1x) על ידי pipetting למעלה ומטה מספר פעמים.
      3. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות כדי לזלג RNA אתהחרוזים, ואז מניחים את הצינור על מגנט כדי ללכוד את החרוזים עד הנוזל ברור.
      4. להעביר בזהירות 20 μL של supernatant לתוך צינור(ים). השליכו את הצינורות עם חרוזים.
        הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה, מכיוון שניתן לאחסן דגימות ב- -20 °C עבור ≤24 שעות.
      5. מניחים את הצינור בתרמוציקלר ומבצעים את הפיצול וההתגנדרות ב-94 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות. וכתוצאה מכך שברים ארוכים של כ-200-300 סיביות לדם.
        הערה: דגירה במשך 8 דקות ב 94 °C עבור 100-200 bp שברי. בעת שימוש ב- RNA מושפל חלקית, קטע בין 1-6 דקות ב- 85 °C בהתאם לחומרת ההשפלה.
      6. מניחים את הצינור על הקרח והמשיכו מיד לסינתזת הגדיל הראשונה.
    4. סינתזת גדיל ראשון
      1. להכין את הסינתזה הראשונה סינתזה מאסטר לערבב (סה"כ = 12 μL, עם 11 μL של מאגר סינתזת גדיל הראשון 1 μL של סקריפט KAPA).
      2. כוונן את תוכנית התגובה PCR על thermocycler: 25 °C עבור 10 דקות; 42 °C למשך 15 דקות; 70 °C למשך 15 דקות; 4 מעלות צלזיוס לנצח.
      3. על קרח, לשלב 20 μL של RNA מקוטע מוכן עם 10 μL של תערובת ראשית סינתזה גדיל. שמרו את הצינורות על הקרח, מערבבים היטב על ידי התזת התגובה בעדינות למעלה ומטה מספר פעמים.
      4. מקם את הצינורים בתרמוצ'יקלר המתוכנת מראש והתחיל את התוכנית.
    5. סינתזת גדיל שני ומעקב A
      1. להכין סינתזת גדיל שני ותערובת מאסטר A-tailing על קרח (סה"כ = 33 μL, עם 31 μL של מאגר סינתזת גדיל שני ו 2 μL של סינתזת גדיל שני & A-tailing אנזים לערבב).
      2. כוונן את תוכנית התגובה PCR על תרמוצ'יקלר: 16 °C במשך 30 דקות; 62 °C ל-10 דקות; 4 מעלות צלזיוס לנצח.
      3. שלב 30 μL של מוצר סינתזת גדיל הראשון עם 30 μL של סינתזת גדיל שני ותמהיל אב A-tailing, ולערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ומטה כמה פעמים על קרח.
      4. מקם את הצינורים בתרמוצ'יקלר המתוכנת מראש והתחיל את התוכנית.
    6. קשירה של מתאם וניקוי לאחר קשירה
      1. דילל מתאמי מלאי (NEXTflex DNA ברקודים, 25 μM) 3.57x במים RNase חינם כדי 7 μM.
      2. להכין מתאם קשירה אב תערובת (סך הכל = 50 μL, עם 40 μL של מאגר קשירה ו 10 μL של רצועות DNA).
      3. שלב 60 μL של מוצר סינתזת גדיל שני, 45 μL של תערובת אב קשירה מתאם, ו 5 μL של מתאמים מדוללים. מערבבים היטב על ידי התפתלות למעלה ו למטה מספר פעמים על קרח.
      4. דגירה את הצינורות ב 20 ° C במשך 15 דקות ולהמשיך מיד עם ניקוי לאחר הרצועה הראשונה.
      5. לבצע ניקוי מבוסס חרוז 0.63x על ידי שילוב של DNA עם רצועות מתאם (110 μL) וחרוזים טהורים KAPA (70 μL), ולאחר מכן ביסודיות respenpend את החרוזים בתערובת ה-DNA על ידי pipetting למעלה ומטה מספר פעמים.
      6. חזור על שלבים 4.1.7–4.1.9.
      7. הסר את הצינורות מהמגנט. ביסודיות resspends ב 50 μL של 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5) ולדגוע את החרוזים ב RT במשך 2 דקות.
      8. מניחים את הצלחת על המגנט והמתינו עד שהנוזל נקי. להעביר 50 μL של supernatant ברור לצינור חדש.
        הערה: נקודת עצירה בטוחה למשך פחות מ- 24 שעות ב- 4 °C.
      9. בצע ניקוי מבוסס חרוז 0.7x על ידי שילוב 50 μL של חרוזים עם מתאם מטוהר קשירה DNA עם 35 μL של פתרון PEG / NaCL. מערבבים היטב על ידי מערבולת.
      10. בצע שלבי ניקוי 4.1.7–4.1.9. ביסודיות resspend את החרוזים ב 20 μL של 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), ולדגוע את החרוזים ב RT במשך 2 דקות.
      11. מניחים את הצלחת על המגנט; חכה עד שהנוזל יהיה נקי. להעביר 20 μL של supernatant ברור לצינור חדש ולהמשיך לסעיף 4.7.
        הערה: נקודת עצירה בטוחה למשך פחות משבוע אחד ב- 4 °C או פחות מחודש אחד ב- -20 °C.
    7. ההגדלה והניקוי של הספרייה
      1. להכין את הספרייה ההגדלה אב תערובת (סה"כ = 33 μL, עם 27.5 μL של 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix ו 5.5 μL של 10x ספריית ההגדלה פריימר לערבב).
      2. הגדר את תוכנית התגובה PCR על thermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים. 98°C עבור 45 שניות; מחזורי N (ראה הערה להלן) של: 98 °C עבור 15 שניות; 60°C ל-30 שניות; 72°C ל-30 שניות; 72 °C למשך דקה אחת; ו-4 מעלות צלזיוס לנצח.
        הערה: המחזורים עבור ההגדלה של הספריה תלויים בחומר הקלט. זה בערך ניתן להעריך ככזה: החל RNA = 25-100 ng, N = 11-15 מחזורים; 100-250 ng, N = 9-12 מחזורים; 250-500 ng, N = 7-10 מחזורים.
      3. לבצע ניקוי מבוסס חרוז 0.8x על ידי שילוב של DNA ספרייה מוגבר (50 μL) ו KAPA חרוזים טהורים (40 μL), ולאחר מכן ביסודיות resuspends בתערובת ה-DNA על ידי pipetting למעלה ומטה מספר פעמים.
      4. בצע שלבי ניקוי 4.1.7–4.1.9. ביסודיות respenpends ב 50 μL של 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), ולדגוע את החרוזים ב RT במשך 2 דקות.
      5. להעביר 50 μL של supernatant ברור לצינור חדש ולהמשיך ניקוי ההגדלה הספרייה השנייה.
      6. לבצע ניקוי מבוסס חרוזים 1x על ידי שילוב של DNA ספרייה מוגבר (50 μL) ו KAPA חרוזים טהורים (50 μL), ולאחר מכן ביסודיות resuspend את החרוזים בתערובת ה-DNA על ידי pipetting למעלה ומטה מספר פעמים.
      7. בצע שלבי ניקוי 4.1.7–4.1.9. ביסודיות resspends ב 22 μL של 10 mM Tris HCL (pH = 8.0–8.5), ולדגוע את החרוזים ב RT במשך 2 דקות.
      8. להעביר 20 μL של supernatant ברור לצינור חדש להמשיך Qbit ומדידות bioanalyzer.
    8. גודל ריכוז ופיצול
      1. למדוד ריכוזי DNA של הדגימות. באמצעות ערכה רגישה מאוד המבוססת על צבע פלורסנט (לדוגמה, Denovix Qbit, ראהטבלת חומרים), או אם נראה שהריכוז נמצא מתחת ל-0.5 ng/μL, תכנת מחדש באמצעות גישת qPCR רגישה יותר (לדוגמה, קאפה קואנטפיקציה, ראה טבלת חומרים).
      2. לקבוע את גודל השבר של הספרייה, באמצעות אלקטרופורזה רגישה גבוהה (למשל, bioanalyzer).
        הערה: באופן אופציונלי, בקרת איכות על-ידי qPCR יכולה להתבצע לפני רצף (נספח) באמצעות ספריה מוכנה מדוללת במקום cDNA.
    9. רצף
      1. שלח את הספריה לצורך רצף. עבור ניתוח ביטוי גנים דיפרנציאלי RNA-seq, עומק רצף של קורא בין 10-25 מיליון לכל מדגם הוא בדרך כלל מספיק.

    5. עיבוד טרום-עיבוד נתונים

    1. בדיקת איכות קבצי Fastq
      1. הורד והתקן Trimgalore16 כדי להסיר זוגות בסיס באיכות נמוכה וקריגים ריקים בתוך קבצי Fastq.
        הערה: 1) רוב התוכנה המוזכרת כאן פועלת רק בלינוקס. אם מוגבל למחשב Windows, ניתן להפעיל ניתוחים בשרת Linux באמצעות התוכנה MobaXterm או Putty. זכור כי עבור גנום יצירת אינדקס הרבה זיכרון גישה אקראית (RAM) נדרש (סביב 64 GB). 2) התקנת כל התוכנות הנדרשות בסביבת קונדה מומלצת מאוד. פעולה זו תאפשר התקנה קלה של תוכנה וניהול חבילות. לקבלת מידע נוסף אודות קונדה, בקר .
      2. צור ספריה (תיקיה) עבור הנתונים, לדוגמה, התיקיה 'RNA_seq_KC_diff'. הגדר זאת כמדריך העבודה על-ידי הקלדה: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
        הערה: לקבלת מבט כולל על מבנה התיקיות, ראה 'folder_structure.txt' בקבצי קידוד משלימים.
      3. צור מספר תיקיות במדריך העבודה עם השמות הספציפיים: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'קבצי Script' ו' מיפוי'.
      4. העבר את קבצי fasta של הנתונים ברצף לתוך התיקיה fastq. לחלופין, צור קישורים רכים באמצעות הפקודה: "ב- -s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" לקבצי Fastq כדי לחסוך בשטח הדיסק.
      5. הפעל חיתוך בשפע על קבצי Fastq, לראות את הקובץ TrimGalore .txt עבור הקוד להעתיק להדביק לתוך bash. שנה שמות והגדרות של תיקיות בתוך הפקודה במידת הצורך.
    2. מיפוי
      1. הורד גנום כדי למפות את הקריאה, למשל, hg38 ensembl שחרור 97 (גרסה לא מוסוות): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; וקובץ ביאור הגן המתאים: hg 38 ביאור גן ensembl שחרור 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. העבר את שני הקבצים לתיקיית CRCh38_fasta.
        הערה: לחלופין השתמש בגירסה שונה של הגנום, לדוגמה, גירסת UCSC של hg38, אם מיפוי לתמליל מזהים ולא מזהי גנים הוא מועדף.
      2. התקן כוכב 2.7.117.
      3. צור גנום הפניה בתוך הבית באמצעות STAR 2.7.1 על-ידי סקריפט הגנום ליצור (ראה קבצי קידוד משלימים). שנה את כמות הליכי המשנה למה שיש לעיבוד (-runThreadN X). שנה שמות והגדרות של תיקיות בקובץ Script זה במידת הצורך. תריץ את זה על ידי העתקה/הדבקה ל-bash.
      4. התקן samtools 1.918 עבור יצירת אינדקס קבצי בום gzip לדחוס את קבצי להתנועע.
      5. ישר את החיתוך בשפע מאומת רצף קורא hg38 הרכבת הגנום האנושי (שחרור ensembl 97) באמצעות STAR 2.7.1 ואחריו יצירת אינדקס באמצעות samtools ו gzip. יש לבצע פעולה זו באמצעות קובץ ה- script map_fastq.txt (ראה קבצי קידוד משלימים). שנה את שמות התיקיות וההגדרות בקובץ Script זה במידת הצורך. הפעל אותו על ידי העתקה / הדבקה לתוך bash.
        הערה: מיפוי STAR יוצר מספר קבצי פלט, כולל קובץ באם, קובץ נדנוד, וטבלת ספירות קריאה בשם *_ReadsPerGene.out.tab, אשר ניתן להשתמש בה ישירות על-ידי R כדי להשתמש בה כקלט עבור Deseq2.
    3. תצוגה חזותית של דפדפן הגנום
      1. להתקין wigToBigWig מכלי דפדפן הגנום של UCSC כדי ליצור קבצי bigwig עם סקריפט big2bw19.
      2. העבר את הקבצים 'convertBigWigChroms.py' ו' CRCH38_ensembl2UCSC.txt' מקבצי הקידוד המשלים לתיקיה 'קבצי Script' במדריך העבודה.
      3. הפוך את convertBigWigChroms.py ההפעלה (באמצעות הפקודה: 'chmod +x סקריפטים / להמירBigWigChroms.py' במחשב לינוקס).
      4. צור קבצי bigWig מקבצי Wiggle, באמצעות wig2bw .txt (ראה קבצי קידוד משלימים). תריץ את זה על ידי העתקה/הדבקה ל-bash.
      5. הזן את קבצי BigWig בדפדפן הגנום של UCSC או במציג הגנומיקה אינטגרטיבית (IGV) לצורך תצוגה חזותית.

    6. ניתוח נתוני RNA-seq

    1. נתוני קלט לדוגמה לתוך Deseq2
      1. הורד והתקן Rstudio (גירסה 1.1.456) ו R (גירסה 3.6).
      2. התקן את כל חבילות R הנדרשות (ראה קבצי קידוד משלימים).
        הערה: לקבלת קובץ R-markdown מפורט המציג את כל קוד התיכנות והפלט, עיין בקבצים המצורפים: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" ו- "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". תיאור כללי של כל השלבים כלול להלן.
      3. צור טבלת ספירה מקבצי ReadsPerGene.out.tab.
      4. כתוב קובץ נתונים לדוגמה, המכיל את כל שמות הקבצים, יום ההבידול ונתונים לדוגמה רלוונטיים אחרים. לקבלת קובץ לדוגמה לדוגמה, ראה "sample_data_example.csv" בקבצי קידוד משלימים.
      5. השתמש בטבלת הספירה ובנתונים לדוגמה כדי ליצור אובייקט Deseq220 המכיל הן את הנתונים הניתנים לספירה והן את הנתונים לדוגמה.
    2. נורמליזציה של ביטויי גנים, מרחק מדגם ו- PCA
      1. נרמל את טבלת הספירה באובייקט Deseq2, באמצעות Deseq2 rld או בנורמליזציה של vst. נורמליזציה RLD הוא מועדף, אבל עם דגימות רבות, נורמליזציה vst הוא הרבה יותר מהר.
      2. התוויית מרחק מדגם בהתבסס על עוצמת ספירת הקריאה המנורמלת באמצעות הפונקציה "dist" ב- R ולאחר מכן ביצוע "hclust" קיבוץ באשכולות בהתבסס על מרחק מדגם. התווה את מפת החום עצמה באמצעות חבילת pheatmap.
      3. צור עלילת PCA של עוצמת ספירת הקריאה מנורמלת באמצעות הפונקציה plotPCA של Deseq2.
        הערה: PCA משמש ככלי בניתוח נתונים גישוש ותוכל לשמש כדי לדמיין מרחק וקשורות בין דגימות שונות.
    3. ניתוח דיפרנציאלי/משתנה מאוד של ביטויי גנים
      1. חשב את הגנים המהפרנציאליים באמצעות פונקציית התוצאה Deseq2. עם זאת, בעת הערכת שינויים על פני מספר נקודות זמן שבהן השוואות pairwise אינן ישימות, השתמש בגנים משתנים מאוד. במקרה זה, לחלץ את העליון 500 גנים משתנים מאוד באמצעות הזמנה על השונות בין דגימות מנקודות זמן שונות עם הפונקציה rowVars.
        הערה: בניתוח שלנו, עבור דגימות הבקרה, העליון 500 גנים משתנים מאוד (הגנים עם סטיית התקן הגבוהה ביותר של עוצמתם מנורמלת על פני ימים של בידול) שימשו לניתוח נוסף. עם זאת, עבור ניתוח בקרת לעומת מחלה התבטא באופן דיפרנציאלי בין מחלות ובקרות בריאות לאורך זמן חושבו על ידי Deseq2 באמצעות ערך p-ערך p מתוקן בדיקות מרובות של 1 x 10-4 כניתוק. שלב סינון אפשרי נוסף הוא לא לכלול גנים דיפרנציאליים המשתנים פחות משינוי קפל מסוים.
      2. לבצע קיבוץ kmeans על הגנים דיפרנציאליים או משתנים מאוד כדי לאשד אותם על ידי דפוסי ביטוי שונים.
      3. הצג גנים דיפרנציאליים או משתנים מאוד במפת חום באמצעות חבילת pheatmap. העוצמה המתווה במפת החום היא העוצמה המנורמלית Deseq2 עם הערך החציוני מוערך.
    4. ניתוח העשרה ביאורים של ג'ין אונטולוגיה (GO)
      1. צור רשימה של גנים רקע מבוטא על ידי לקיחת כל הגנים עם יותר מ 10 ספירות בדגימה אחת.
      2. בצע ניתוח GO באמצעות כלים מקוונים כגון GOrilla21. השתמש ברשימות של הגנים ההפרנציאליים/משתנים מאוד באשכולות כ"רשימת גנים", ובגנים ברקע לצורך השוואה.
        הערה: משתמשי R מתקדמים יותר יכולים להשתמש באשכול החבילהProfiler22 כדי להפוך ניתוח העשרה לטווח גו לאוטומטי.

    תוצאות

    בידול קרטינוציט רגיל וניתוח RNA-seq
    בניסוי זה, קווי keratinocyte נגזר מחמישה אנשים שימשו עבור בידול וניתוחי RNA-seq. איור 1 מסכם את ההליך הניסיוני של בידול ותוצאות ניתוח RNA-seq. מבט כולל על הליכי בידול במבחנה של keratinocytes נורמלי ושינויים מורפולוגיה של תאים במהלך בידול ...

    Discussion

    עבודה זו מתארת שיטה לגרימת בידול keratinocyte אנושי ואפיון עוקב באמצעות ניתוחי RNA-seq. בספרות הנוכחית, מחקרים רבים על בידול keratinocyte האנושי להשתמש בשתי שיטות אחרות, עם ריכוז סידן גבוה או עם סרום כשיטותכדי לגרום בידול 2,3,23. דו"ח קודם השווה בזהירות שלו...

    Disclosures

    לסופרים אין מה לחשוף.

    Acknowledgements

    מחקר זה נתמך על ידי הארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO / ALW / תחרות פתוחה / ALWOP 376, ה.ז., J.G.A.S.); מלגת אוניברסיטת רדבוד (ה.ת); ומענק מועצת המלגות הסינית 201406330059 (J.Q.).

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
    Bovine pituitary extract (BPE)LonzaPart of the bulletKit
    CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
    Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
    Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
    Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
    High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
    HydrocortisonLonzaPart of the bulletKit
    InsulinLonzaPart of the bulletKit
    iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
    iScript cDNA synthesisBio rad1708890
    KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration measure kit
    KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
    KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
    NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
    NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
    Penicillin-StreptomycinGibco15140122
    RNA Pico ChipAgilent5067-1513

    References

    1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
    2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
    3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
    4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
    5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
    6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
    7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
    8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
    9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
    10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
    11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
    12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
    13. . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
    14. Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
    15. . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
    16. . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
    17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
    18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
    19. . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
    20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
    21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
    22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
    23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
    24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
    25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
    26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
    27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
    28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
    29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
    30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
    31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
    32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
    33. . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
    34. . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    159keratinocytes2DRNA seqp63

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved