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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.

Zusammenfassung

Humane primäre Keratinozyten werden oft als In-vitro-Modelle für Studien über epidermale Differenzierung und verwandte Krankheiten verwendet. Es wurden Methoden zur In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten berichtet, die in zweidimensionalen (2D) untergetauchten Weisen unter Verwendung verschiedener Induktionsbedingungen kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierungsmethode durch Kontaktinhibition und anschließende molekulare Charakterisierung durch RNA-seq beschrieben. Kurz gesagt, Keratinozyten werden in definierten Keratinozyten Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt, bis sie vollständig konfluent sind angebaut. Die Differenzierung wird durch enge Kontakte zwischen den Keratinozyten induziert und durch den Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Medium weiter stimuliert. Anhand von RNA-Seq-Analysen wird gezeigt, dass beide 1) differenzierten Keratinozyten während der Differenzierung unterschiedliche molekulare Signaturen aufweisen und 2) das dynamische Genexpressionsmuster bei der epidermalen Schichtung weitgehend Zellen ähnelt. Was den Vergleich mit der normalen Keratinozytendifferenzierung betrifft, so weisen Keratinozyten, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, veränderte Morphologie und molekulare Signaturen auf, die mit ihren Differenzierungsfehlern übereinstimmen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und deren molekulare Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der bioinformatischen Analyse von RNA-seq-Daten liegt. Da die RNA-Extraktion und die RNA-Seq-Verfahren gut dokumentiert sind, steht dieses Protokoll nicht im Mittelpunkt. Das experimentelle Verfahren der In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und bioinformatischen Analyse-Pipeline kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten zu untersuchen.

Einleitung

Menschliche primäre Keratinozyten, die von der menschlichen Haut abgeleitet werden, werden oft als zelluläres Modell verwendet, um die Biologie der Epidermis1,2,3,4zu studieren. Die Schichtung der Epidermis kann durch Keratinozytendifferenzierung modelliert werden, entweder in 2D-Unterschicht-Manier oder 3D-Luftlift-Organotypikmodell2,3,5,6,7. Obwohl 3D-Modelle für die Bewertung der epidermalen Struktur und Funktion immer wichtiger geworden sind, sind 2D-Differenzierungsmodelle aufgrund ihrer Bequemlichkeit und der Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen für Analysen zu generieren, immer noch weit verbreitet.

Verschiedene Bedingungen wurden angewendet, um Keratinozytendifferenzierung in 2D zu induzieren, einschließlich Zugabe von Serum, hoher Kalziumkonzentration, niedrigerer Temperatur und Hemmung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren2,3. Jede dieser Methoden wurde durch eine Reihe von Keratinozyten-Differenzierungsmarkergenen validiert und erwies sich als wirksam bei der Beurteilung der Keratinozytendifferenzierung, auch unter pathologischen Bedingungen. Diese Induktionsbedingungen zeigen jedoch auch Unterschiede in ihrer Differenzierungseffizienz und Kinetik, wenn bestimmte Panels von Markergenen untersucht werden2,3.

Eine dieser Methoden beinhaltet Keratinozytenkontakthemmung und Erschöpfung der Wachstumsfaktoren im Kulturmedium8. Es hat sich gezeigt, dass Keratinozyten spontan unterscheiden können, wenn Zellen die volle Dichte erreichen.  Der Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Kulturmedium kann die Differenzierung weiter verstärken. Die Methode, die Kontakthemmung und erschöpfende Wachstumsfaktoren kombiniert, hat gezeigt, dass sie differenzierte Keratinozyten mit Genexpressionsmustern erzeugt, die der normalen geschichteten Epidermis ähneln, wenn mehrere epidermale Marker verwendet werden3, was darauf hindeutet, dass dieses Modell für die Untersuchung der normalen Keratinozytendifferenzierung geeignet ist. Kürzlich wurden zwei umfassende Genexpressionsanalysen der Keratinozytendifferenzierung mit diesem Modell9,10berichtet. Die Forscher validierten dieses Modell auf molekularer Ebene und zeigten, dass es verwendet werden kann, um normale und kranke Keratinozytendifferenzierung zu untersuchen.

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur In-vitro-Differenzierungsmethode und molekularen Analyse differenzierter Zellen mit RNA-seq. Es veranschaulicht auch die Charakterisierung des Transkriptoms der Zellen am Differenzierungstag 0 (Proliferationsstadium), Tag 2, Tag 4 und Tag 7 (frühe, mittlere bzw. späte Differenzierung). Es wird gezeigt, dass differenzierte Keratinozyten Genexpressionsmuster aufweisen, die Zellen während der epidermalen Schichtung weitgehend ähneln. Um zu untersuchen, ob diese Methode für die Untersuchung der Hautpathologie verwendet werden kann, haben wir dieselbe experimentelle und Analyse-Pipeline eingesetzt, um Keratinozyten zu untersuchen, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, die von Patienten mit ektokaktischer, ektodermaler Displasie und Lip-Palate-Syndrom (EEC) abgeleitet werden11,12. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten sowie die anschließende bioinformatische Analyse von RNA-seq. Andere Schritte des gesamten Verfahrens wie RNA-Extraktion, RNA-seq Probenvorbereitung und Bibliotheksbau sind gut dokumentiert und können leicht befolgt werden, insbesondere bei verwendung samt vielen häufig verwendeten kommerziellen Kits. Daher werden diese Schritte nur kurz im Protokoll beschrieben. Die Daten zeigen, dass diese Pipeline für die Untersuchung molekularer Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten geeignet ist.

Protokoll

Hautbiopsien wurden aus dem Stamm gesunder Probanden oder Patienten mit p63-Mutationen entnommen, um die primäre Keratinozytenkultur aufzubauen. Alle Verfahren zur Einrichtung menschlicher Primärkeratinozyten wurden von der Ethikkommission des Medizinischen Zentrums der Radboud-Universität Nijmegen ("Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen") genehmigt. Die informierte Zustimmung wurde eingeholt.

1. Primäre Keratinozytendifferenzierung durch Kontakthemmung

  1. Bereiten Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM) aus Keratinocyte Basal Medium(Materialtabelle) bei Bedarf vor.
  2. 500 ml Proliferationsmedium mit vorgefertigten Beständen herstellen (KGM-pro; siehe Tabelle 1).
  3. 500 ml Differenzierungsmedium machen (KGM-dif; siehe Tabelle 2).
    HINWEIS: KGM mit Nahrungsergänzungsmitteln kann zwei Wochen lang bei 4 °C aufbewahrt werden. Für längere Lagerung kann es aliquoted und bei -20°C gelagert werden.
  4. Samen primäre Keratinozyten in der Dichte von 5,0–20 x 103 Zellen/cm2 , abhängig von der Zellproliferativkapazität. Fügen Sie genügend KGM-pro Medium hinzu, um Zellen abzudecken.
    HINWEIS: 1) Einzelheiten der regulären Zellkultur innerhalb des KGM-Mediums finden Sie auf der Website von Lonza13. 2) Die Sädichte sollte für jede Zelllinie getestet werden. Beispielsweise kann eine normale primäre Keratinozytenlinie mit einer Dichte von 5,0 x 103 Zellen/cm2 gesät werden, während eine Linie, die Mutationen im Transkriptionsfaktor p63 trägt, die weniger proliferativ ist, mit einer Dichte von 20 x 103 Zellen/cm2gesät werden sollte. 3) Je nach Versuchsaufbau sollten mehrere Geschirre oder Zellenbrunnen ausgesät werden, um das Sammeln von Proben an verschiedenen Differenzierungstagen in Repliken zu ermöglichen.
  5. Erfrischen Sie die Zellen mit dem KGM-pro Medium für zwei Tage nach der Aussaat (Aussaat am Tag 0, erfrischend zum1. Mal am Tag 3). Danach jeden zweiten Tag mit KGM-pro medium auffrischen. Überprüfen Sie Zellen regelmäßig, zumindest jeden zweiten Tag.
  6. Induzieren Sie die Zelldifferenzierung, wenn Zellen mehr als 90 % konfluent sind, indem Sie das Medium in KGM-dif ändern. Der Tag des Wechselmediums zu KGM-dif wird als Differenzierungstag 0 definiert. Sammeln Sie Zellen für weitere RNA-Analysen, indem Sie zunächst 2x mit DPBS waschen und anschließend den Lysepuffer (aus einem RNA-Extraktionskit) hinzufügen.
    HINWEIS: Bei der oben genannten Saatdichte sollten Zellen innerhalb von 7–10 Tagen die Konfluenz erreichen. Zellen können mit einer höheren Anfangsdichte gesät werden, um die Konfluenz früher zu erreichen. Wenn Zellen nicht proliferativ sind, kann längeres Warten nicht zu vollständig konfluenten Zellen führen. Möglicherweise ist eine höhere Sädichte erforderlich.
  7. Erfrischen Sie Zellen mit dem KGM-dif Medium jeden Tag und sammeln Sie Zellen am Differenzierungstag 2, 4. und 7 für die weitere RNA-Extraktion.

2. RNA-Extraktion

  1. Isolieren Sie die gesamte RNA. Dies kann mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit (wie Zymo Quick-RNA MicroPrep RNA) oder mit Phenol14durchgeführt werden. Ein Isolationskit, das eine DNAse-Behandlung enthält, wird jedoch dringend für RNA-seq-Proben empfohlen, um DNA-Kontamination und Phenol zu verhindern. Ein Beispiel für ein kommerzielles RNA-Isolationskit finden Sie in der Tabelle der Materialien.
  2. Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektrometer. Sowohl DNA als auch RNA haben einen Absorptionsspitzenwert von 260 nm.
    ANMERKUNG: 1) Das Verhältnis zwischen den Absorptionen bei 260 nm und 280 nm wird verwendet, um die Reinheit der RNA zu bewerten. Ein Verhältnis von etwa 2,0 wird allgemein als "reine" RNA akzeptiert. Wenn das Verhältnis wesentlich niedriger als 2,0 ist, könnte die Probe mit Verunreinigungen kontaminiert sein, die bei 280 nm absorbieren, wie Proteine, Phenole oder andere Substanzen. 2) Das Verhältnis zwischen den Absorptionen bei 260 nm und 230 nm misst die Numsosäurereinheit. Es wird ein Verhältnis zwischen 2,0 und 2,2 erwartet. Ist das Verhältnis wesentlich niedriger, kann die Probe mit Verunreinigungen kontaminiert sein, die bei 230 nm absorbieren, wie EDTA, Ethanol oder andere Stoffe.

3. RNA-Qualitätsprüfung

  1. Führen Sie RNA entweder auf einem Bioanalyzer-RNA-Pico-Chip aus, um die RNA Integrity Number (RIN) quantitativ zu validieren, oder auf einem Gel für eine qualitative Messung. Im Allgemeinen ist eine RIN von mindestens acht sehr ratsam. Bei der Extraktion von RNA aus Geweben kann die RIN jedoch niedriger sein.
    HINWEIS: Optional kann die Qualitätskontrolle durch qPCR auf dem RNA-Material durchgeführt werden.

4. RNA-seq Bibliotheksvorbereitung

HINWEIS: Die Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek wird oft mit einem kommerziellen Kit oder unter kommerziellen Einstellungen durchgeführt. Das beschriebene Protokoll ist von einem kommerziellen Kit, KAPA RNA HyperPrep Kit mit RiboErase (Illumina), mit einer kurzen Beschreibung aller erforderlichen Schritte adaptiert: rRNA-Erschöpfung mit Oligo-Hybridisierung zu menschlichen ribosomalen RNAs, RNA-Fragmentierung, First-Strang-Synthese, Zweitstrangsynthese und A-Tailing und Bereinigung nach jedem Schritt15. Zu diesem Zweck können auch andere Bibliotheksvorbereitungskits verwendet werden. Es wird empfohlen, diesen Schritt mit einem kommerziell erhältlichen Kit auszuführen, da die Qualität der generierten cDNA-Bibliothek oft konsistenter ist. 2) Die folgenden Schritte werden für die 1x Bibliotheksvorbereitung beschrieben. Wenn Sie mehrere Proben vorbereiten, erstellen Sie Master-Mischungen mit 10% zusätzlichem Volumen.

  1. Oligo-Hybridisierung und rRNA-Erschöpfung
    1. Vorbereiten sie den Oligo-Hybridisierungs-Master-Mix (gesamt = 11 l, mit 4,4 l Hybridisierungspuffer, 4,4 l Hybridisierungsoligos und 2,2 l RNase-freiem Wasser) und Erschöpfungsmaster-Mix (gesamt = 5,5 l, mit 3,3 l Erschöpfungspuffer und 2,2 l RNase H).
    2. Einrichten des PCR-Reaktionsprogramms auf einem Thermocycler: 95 °C für 2 min; rampe bis 45 °C bei -0,1 °C/s; 45 °C Pause; 45 °C für 30 min; 4 °C für immer.
      HINWEIS: Erwägen Sie, mit der doppelten MENGE an RNA zu beginnen, als für die Amplifikation erforderlich ist. Verwenden Sie im ersten Versuch die Hälfte des Betrags, um mit den folgenden Schritten fortzufahren. Dies soll sicherstellen, dass es noch Material gibt, um diese Schritte mit einer anderen Anzahl von Zyklen zu wiederholen (siehe Schritt 4.7.2), wenn sich die Zyklen der Verstärkung als unzureichend oder überverstärkt erweisen.
    3. Verwenden Sie zwischen 25 ng und 1 g Gesamt-RNA in 10 l RNAse-freiem Wasser, fügen Sie 10 l Oligo-Hybridisierungs-Master-Mix hinzu. Legen Sie Proben in den vorprogrammierten Thermocycler und starten Sie das Programm.
    4. Wenn das Programm den Pausenschritt bei 45 °C erreicht, fügen Sie der 20-L-Hybridisierungsreaktion 5 l Erschöpfungsmaster-Mix hinzu, ohne sie aus dem Thermocycler zu entfernen. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals.
    5. Setzen Sie das Thermocycler-Programm fort, um mit dem Erschöpfungsschritt (45 °C für 30 min) fortzufahren.
      HINWEIS: 1) Legen Sie die Perlen für die rRNA-Erschöpfung (z. B. KAPA-Reine) während des Erschöpfungsschritts für den nächsten Teil des Protokolls auf Raumtemperatur (RT) ab. 2) Erwägen Sie die Vorbereitung der DNase-Verdauungs-Master-Mischung (für Abschnitt 4.2), da die Reagenzien direkt nach der rRNA-Erschöpfungsreinigung benötigt werden.
    6. Führen Sie eine 2,2-fache KapA Pure Beads-Bereinigung auf, indem Sie den RNA-Mix (25 l) und KAPA Pure Beads (55 'L) kombinieren, indem Sie die Perlen im RNA-Mix gründlich wieder aufheben, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
    7. Inkubieren Sie bei RT für 5 min, um die RNA-Bindung an die Perlen zu ermöglichen, und legen Sie die Röhre(en) auf ein Magnetgestell, um die Perlen zu erfassen, bis die Flüssigkeit klar ist, und entfernen und entsorgen Sie vorsichtig 60 L Überstand.
    8. Halten Sie die Rohre auf dem Magneten, waschen Sie 2x mit 200 l 80% Ethanol, indem Sie die Perlen mit dem Ethanol für ≥30 s inkubieren und das Ethanol entsorgen. Versuchen Sie, alle Rest-Ethanol zu entfernen, ohne die Perlen nach der zweiten Wäsche zu stören.
    9. Trocknen Sie die Perlen bei RT für 3–5 min oder bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
      HINWEIS: Eine Übertrocknung der Perlen kann zu einer geringeren Ausbeute führen.
  2. DNase-Verdauung
    1. Bereiten Sie den DNase-Verdauungsmaster-Mix vor (gesamt = 22 l, mit 2,2 l DNase-Puffer, 2 l DNase und 17,8 l RNase-freiem Wasser).
    2. Setzen Sie die Perlen in DNAse Verdauung Master-Mix (20 l) durch Pipettieren nach oben und unten mehrmals. Inkubieren Sie die Röhre bei RT für 3 min, um die RNA von den Perlen zu elute.
    3. Legen Sie die Rohre auf ein Magnetgestell, um die Perlen zu erfassen, bis die Flüssigkeit klar ist, und übertragen Sie vorsichtig 20 L Überstand in ein sauberes Rohr.
    4. Inkubieren Sie die Rohre mit Überstand bei 37 °C für 30 min.
      HINWEIS: Erwägen Sie die Vorbereitung der RNA-Elution, Fragmentierung und Grundierung Master-Mischungen (für Abschnitt 4.3), da die Reagenzien werden direkt nach der DNase Verdauung Sanimierung Reinigung benötigt.
    5. Führen Sie eine 2,2-fache Bereinigung auf Perlenbasis durch, indem Sie 4.1.6–4.1.9 folgen.
  3. RNA-Elution, Fragmentierung und Grundierung
    1. Bereiten Sie den Fragment-, Prime- und Elute-Puffer (1x)-Master-Mix mit 11 L Fragment, Prime und Elute Buffer (2x) und 11 l RNase-freiem Wasser vor.
    2. Die Perlen mit gereinigter, DNase-behandelter RNA in 22 L Fragmentierung, Prime und Elute Buffer (1x) gründlich wieder aufhängen, indem sie mehrmals nach oben und unten pipetieren.
    3. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 3 min, um RNA aus der Perle s zuelute, dann legen Sie die Röhre(n) auf einen Magneten, um die Perlen zu erfassen, bis die Flüssigkeit klar ist.
    4. Übertragen Sie vorsichtig 20 l Überstand in eine Röhre(n). Entsorgen Sie die Rohre mit Perlen.
      HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt, da Proben bei -20 °C für ≤24 h gelagert werden können.
    5. Legen Sie die Rohre in einen Thermocycler und führen Sie die Fragmentierung und Grundierung bei 94 °C für 6 min durch. Das Ergebnis ist ca. 200–300 bp lange Fragmente.
      HINWEIS: Inkubieren Sie für 8 min bei 94 °C für 100–200 bp Fragmente. Bei Verwendung teilweise degradierter RNA fragmentieren Sie zwischen 1–6 min bei 85 °C, abhängig von der Schwere des Abbaus.
    6. Legen Sie die Rohre auf Eis und fahren Sie sofort mit der ersten Strangsynthese fort.
  4. Erste Strangsynthese
    1. Bereiten Sie den ersten Strangsynthese-Master-Mix vor (insgesamt = 12 l, mit 11 l des ersten Strangsynthesepuffers und 1 L DES KAPA-Skripts).
    2. Einrichten des PCR-Reaktionsprogramms auf einem Thermocycler: 25 °C für 10 min; 42 °C für 15 min; 70 °C für 15 min; 4 °C für immer.
    3. Kombinieren Sie auf dem Eis 20 l fragmentierte grundierte RNA mit 10 l des ersten Strangsynthese-Master-Mixes. Halten Sie die Rohre auf Eis, mischen Sie gründlich, indem Sie die Reaktion vorsichtig nach oben und unten mehrmals pipet.
    4. Legen Sie die Rohre in den vorprogrammierten Thermocycler und starten Sie das Programm.
  5. Zweite Strangsynthese und A-Tailing
    1. Vorbereiten der zweiten Strangsynthese und des A-Tailing-Master-Mix auf Eis (insgesamt = 33 l, mit 31 L des zweiten Strangsynthesepuffers und 2 l der zweiten Strangsynthese & A-tailing-Enzymmischung).
    2. Einrichten des PCR-Reaktionsprogramms auf einem Thermocycler: 16 °C für 30 min; 62 °C für 10 min; 4 °C für immer.
    3. Kombinieren Sie 30 l des ersten Strangsyntheseprodukts mit 30 l der zweiten Strangsynthese und A-Tailing Master-Mix, und mischen Sie gründlich durch Pipettieren auf und ab mehrmals auf Eis.
    4. Legen Sie die Rohre in den vorprogrammierten Thermocycler und starten Sie das Programm.
  6. Adapterligation und Nachligationsbereinigung
    1. Verdünnung von Stoffadaptern (NEXTflex DNA-Barcodes, 25 M) 3,57x in RNase-freiem Wasser auf 7 m.
    2. Vorbereiten des Adapterligations-Master-Mix (gesamt = 50 l, mit 40 l Ligationspuffer und 10 l DNA-Ligase).
    3. Kombinieren Sie 60 l des zweiten Strangsyntheseprodukts, 45 l Adapterligation Master-Mix und 5 l verdünnte Adapter. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren auf und ab mehrmals auf Eis.
    4. Die Rohre 15 min bei 20 °C inkubieren und sofort mit der ersten Nachreinigung fortsetzen.
    5. Führen Sie eine 0,63-fache Bereinigung auf Perlenbasis durch die Kombination von adaptergebundener DNA (110 L) und KAPA-Reinen (70 l) durch und setzen Sie die Perlen im DNA-Mix gründlich wieder auf, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.7–4.1.9.
    7. Entfernen Sie die Rohre vom Magneten. Die Perlen in 50 l von 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) gründlich wieder aufhängen und die Perlen bei RT für 2 min inkubieren.
    8. Legen Sie die Platte auf den Magneten und warten Sie, bis die Flüssigkeit frei ist. Übertragen Sie 50 l des klaren Überstandes auf ein neues Rohr.
      HINWEIS: Sicherer Haltepunkt für weniger als 24 h bei 4 °C.
    9. Führen Sie eine 0,7-fache Bereinigung auf Perlenbasis durch, indem Sie 50 L Perlen mit gereinigter, adaptergebundener DNA mit 35 L PEG/NaCL-Lösung kombinieren. Durch Wirbel gründlich mischen.
    10. Führen Sie die Bereinigungsschritte 4.1.7–4.1.9 aus. Die Perlen in 20 l von 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) gründlich wieder aufhängen und die Perlen bei RT für 2 min inkubieren.
    11. Legen Sie die Platte auf den Magneten; warten, bis die Flüssigkeit frei ist. 20 L des klaren Überstandes auf ein neues Rohr übertragen und mit Abschnitt 4.7 fortfahren.
      HINWEIS: Sicherer Haltepunkt für weniger als 1 Woche bei 4 °C oder weniger als 1 Monat bei -20 °C.
  7. Bibliotheksverstärkung und -bereinigung
    1. Vorbereiten des Bibliotheksverstärkungs-Master-Mix (gesamt = 33 l, mit 27,5 l von 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix und 5,5 l 10x Bibliotheksamplifikations-Primer-Mix).
    2. Richten Sie das PCR-Reaktionsprogramm auf einem Thermocycler mit den folgenden Parametern ein. 98 °C für 45 s; N Zyklen (siehe Anmerkung unten) von: 98 °C für 15 s; 60 °C für 30 s; 72 °C für 30 s; 72 °C für 1 min; und 4 °C für immer.
      HINWEIS: Die Zyklen für die Bibliotheksverstärkung hängen vom Eingabematerial ab. Es kann grob als solche geschätzt werden: beginnend mit RNA = 25–100 ng, N = 11-15 Zyklen; 100–250 ng, N = 9–12 Zyklen; 250–500 ng, N = 7–10 Zyklen.
    3. Führen Sie eine 0,8-fache Bereinigung auf Perlenbasis durch die Kombination von verstärkter Bibliotheks-DNA (50 l) und KAPA-Reinen (40 l) durch und setzen Sie die Perlen im DNA-Mix gründlich wieder auf, indem Sie mehrmals nach oben und unten pipetieren.
    4. Führen Sie die Bereinigungsschritte 4.1.7–4.1.9 aus. Die Perlen in 50 l von 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) gründlich wieder aufhängen und die Perlen bei RT für 2 min inkubieren.
    5. Übertragen Sie 50 l des klaren Überstandes in ein neues Rohr und fahren Sie mit der zweiten Bibliotheksverstärkungsbereinigung fort.
    6. Führen Sie eine 1x Perlen-basierte Bereinigung durch die Kombination von verstärkter Bibliotheks-DNA (50 l) und KAPA-Reinen (50 l) durch und setzen Sie die Perlen im DNA-Mix gründlich wieder auf, indem Sie mehrmals nach oben und unten pfeifen.
    7. Führen Sie die Bereinigungsschritte 4.1.7–4.1.9 aus. Die Perlen in 22 l von 10 mM Tris HCL (pH = 8,0–8,5) gründlich wieder aufhängen und die Perlen bei RT für 2 min inkubieren.
    8. Übertragen Sie 20 l des klaren Überstandes auf ein neues Rohr und führen Sie zu Qbit- und Bioanalysemessungen aus.
  8. Konzentrations- und Fragmentierungsgröße
    1. Messen Sie die DNA-Konzentrationen der Proben. Mit einem hochempfindlichen fluoreszierenden Farbstoff-basierten Kit (z. B. Denovix Qbit, siehe Tabelle der Materialien), oder wenn die Konzentration unter 0,5 ng / L zu liegen scheint, requantififizieren Sie mit einem empfindlicheren qPCR-Ansatz (z. B. Kappa Quantififizierung, siehe Tabelle der Materialien).
    2. Bestimmen Sie die Fragmentgröße der Bibliothek mithilfe einer hochempfindlichen Elektrophorese (z. B. eines Bioanalyzers).
      HINWEIS: Optional kann die Qualitätskontrolle durch qPCR vor der Sequenzierung (Anhang) mit einer verdünnten vorbereiteten Bibliothek anstelle von cDNA durchgeführt werden.
  9. Sequenzierung
    1. Senden Sie die Bibliothek zur Sequenzierung. Für die Analyse der RNA-Seq-Differentialgenexpression reicht im Allgemeinen eine Sequenzierungstiefe von Lesevorgängen zwischen 10 und 25 Millionen pro Probe aus.

5. Datenvorverarbeitung

  1. Qualitätsprüfung Fastq-Dateien
    1. Laden Sie Trimgalore16 herunter und installieren Sie es, um Basispaare von geringer Qualität und leere Lesevorgänge in den Fastq-Dateien zu entfernen.
      HINWEIS: 1) Die meisten hier genannten Software funktioniert nur unter Linux. Wenn sie auf einen Windows-Computer beschränkt ist, ist es möglich, Analysen auf einem Linux-Server mit der Software MobaXterm oder Putty auszuführen. Denken Sie daran, dass für die Genomindizierung eine Menge Ram (Random Access Memory) erforderlich ist (ca. 64 GB). 2) Die Installation aller erforderlichen Software in einer conda-Umgebung wird dringend empfohlen. Dies ermöglicht eine einfache Softwareinstallation und Paketverwaltung. Weitere Informationen zu conda finden Sie unter .
    2. Erstellen Sie ein Verzeichnis (Ordner) für die Daten, z.B. den Ordner 'RNA_seq_KC_diff'. Legen Sie dies als Arbeitsverzeichnis fest, indem Sie folgendes eingeben: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      HINWEIS: Eine Übersicht über die Ordnerstruktur finden Sie unter "folder_structure.txt" in den zusätzlichen Codierungsdateien.
    3. Erstellen Sie mehrere Ordner im Arbeitsverzeichnis mit den spezifischen Namen: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' und 'Mapping'.
    4. Verschieben Sie die Fasta-Dateien der sequenzierten Daten in den Fastq-Ordner. Alternativ können Sie Softlinks mit dem Befehl "ln –s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" zu den Fastq-Dateien generieren, um Speicherplatz zu sparen.
    5. Führen Sie Trim galore auf den Fastq-Dateien aus, siehe TrimGalore.txt-Datei für den Code, um Paste in bash zu kopieren. Ändern Sie die Ordnernamen und -einstellungen innerhalb des Befehls, falls erforderlich.
  2. Zuordnung
    1. Laden Sie ein Genom herunter, um die Lesevorgänge z.B. hg38 ensembl release 97 (unmaskierter Version) zuzuordnen: ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; und die entsprechende Gen-Anmerkungsdatei: hg 38 gen annotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Übertragen Sie beide Dateien in den CRCh38_fasta Ordner.
      HINWEIS: Alternativ können Sie eine andere Version des Genoms verwenden, z. B. die UCSC-Version von hg38, wenn die Zuordnung zu Transkription-IDs anstelle von Gen-IDs bevorzugt wird.
    2. Installieren Sie STAR 2.7.117.
    3. Generieren Sie ein internes Referenzgenom mit STAR 2.7.1 durch das Genomskript generieren (siehe Ergänzende Codierungsdateien). Ändern Sie die Anzahl der Threads in das, was der Processer hat (--runThreadN X). Ändern Sie ggf. Ordnernamen und -einstellungen in diesem Skript. Führen Sie es durch Kopieren/Einfügen in bash aus.
    4. Installieren Sie samtools 1.918 für die Indizierung der bam-Dateien und gzip, um die wackeligen Dateien zu komprimieren.
    5. Richten Sie die Trim Galore validierten Sequenzierungslesevorgänge an der menschlichen Genombaugruppe hg38 (Ensembl Release 97) mit STAR 2.7.1 aus, gefolgt von der Indizierung mit Samtools und Gzip. Dies sollte mit dem Skript map_fastq.txt durchgeführt werden (siehe Ergänzende Codierungsdateien). Ändern Sie ggf. die Ordnernamen und -einstellungen in diesem Skript. Führen Sie es durch Kopieren/Einfügen in bash aus.
      HINWEIS: STAR-Mapping generiert mehrere Ausgabedateien, darunter eine Bam-Datei, eine wackelige Datei und lesecounts-Tabelle mit dem Namen *_ReadsPerGene.out.tab, die direkt von R verkettet verwendet werden kann, um sie als Eingabe für Deseq2 zu verwenden.
  3. Genome-Browser-Visualisierung
    1. Installieren Sie wigToBigWig aus den UCSC Genome Browser-Tools, um bigwig-Dateien mit dem big2bw-Skript19zu generieren.
    2. Übertragen Sie die Dateien "convertBigWigChroms.py" und "CRCH38_ensembl2UCSC.txt" aus den ergänzenden Codierungsdateien in einen Ordner "Skripte" im Arbeitsverzeichnis.
    3. Machen Sie die convertBigWigChroms.py ausführbar (mit dem Befehl: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' auf einem Linux-Rechner).
    4. Generieren Sie bigWig-Dateien aus den Wiggle-Dateien mit dem Skript wig2bw.txt (siehe Ergänzende Codierungsdateien). Führen Sie es durch Kopieren/Einfügen in bash aus.
    5. Geben Sie die BigWig-Dateien im UCSC-Genombrowser oder in integrativegenomics Viewer (IGV) zur Visualisierung ein.

6. RNA-seq-Datenanalyse

  1. Beispieldaten in Deseq2 eingeben
    1. Rstudio (Version 1.1.456) und R (Version 3.6) herunterladen und installieren.
    2. Installieren Sie alle erforderlichen R-Pakete (siehe Ergänzende Codierungsdateien).
      HINWEIS: Eine detaillierte R-Markdown-Datei mit allen Programmiercodes und Ausgaben finden Sie in den angehängten Dateien: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" und "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Eine allgemeine Beschreibung aller Schritte ist unten enthalten.
    3. Generieren Sie eine Zähltabelle aus den Dateien ReadsPerGene.out.tab.
    4. Schreiben Sie eine Beispieldatendatei, die alle Dateinamen, den Tag der Differenzierung und andere relevante Beispieldaten enthält. Eine Beispieldatei finden Sie unter "sample_data_example.csv" in den Ergänzenden Codierungsdateien.
    5. Verwenden Sie die Zähltabelle und die Beispieldaten, um ein Deseq220-Objekt zu generieren, das sowohl die zählbaren als auch die Beispieldaten enthält.
  2. Genexpressionsnormalisierung, Probenabstand und PCA
    1. Normalisieren Sie die Zähltabelle im Deseq2-Objekt, indem Sie entweder Deseq2 rld oder vst Normalisierung verwenden. Die Rld-Normalisierung wird bevorzugt, aber bei vielen Samples ist die Vst-Normalisierung viel schneller.
    2. Plot-Sample-Entfernung basierend auf den normalisierten Lesezählintensitäten mit der "dist" Funktion in R und anschließend Durchführung "hclust" Clustering basierend auf Sample-Entfernung. Zeichnen Sie die Heatmap selbst mit dem pheatmap-Paket.
    3. Generieren Sie ein PCA-Diagramm der normalisierten Lesezählintensitäten mit der plotPCA-Funktion von Deseq2.
      HINWEIS: PCA dient als Werkzeug für die explorative Datenanalyse und kann verwendet werden, um Entfernung und Verwandtwerden zwischen verschiedenen Proben zu visualisieren.
  3. Differential/hochvariable Genexpressionsanalyse
    1. Berechnen Sie entweder die Differentialgene mit der Deseq2-Ergebnisfunktion. Verwenden Sie bei der Bewertung von Veränderungen über mehrere Zeitpunkte, in denen paarweise Vergleiche nicht anwendbar sind, hochvariable Gene. Extrahieren Sie in diesem Fall die Top 500 hochvariablen Gene über die Sortierung der Varianz zwischen Proben aus verschiedenen Zeitpunkten mit der rowVars-Funktion.
      HINWEIS: In unserer Analyse wurden für die Kontrollproben die Top 500 hochvariablen Gene (die Gene mit der höchsten Standardabweichung ihrer normalisierten Intensität über Tage der Differenzierung) für weitere Analysen verwendet. Für die Krankheits- vs-Kontrollanalyse wurden jedoch differenziell exprimierte Gene zwischen Krankheit und gesunden Kontrollen im Zeitverlauf von Deseq2 mit einem mehrfach getesteten korrigierten p-Wert von 1 x 10-4 als Cutoff berechnet. Ein weiterer möglicher Filterschritt besteht darin, Differentialgene auszuschließen, die sich weniger als ein bestimmter Falzwechsel-Cutoff ändern.
    2. Führen Sie kMeans Clustering auf den differentialen oder hochvariablen Genen durch, um sie nach verschiedenen Expressionsmustern zu gruppieren.
    3. Visualisieren Sie differenzielle oder hochvariable Gene in einer Heatmap mit dem pheatmap-Paket. Die in der Heatmap dargestellte Intensität ist die normalisierte Deseq2-Intensität mit subtrahierter Medianwert.
  4. Gene Ontology (GO) Annotation anreichern Analyse
    1. Generieren Sie eine Liste der exprimierenden Hintergrundgene, indem Sie alle Gene mit mehr als 10 Zählungen in einer einzigen Probe einnehmen.
    2. Führen Sie GO-Analysen mit Online-Tools wie GOrilla21durch. Verwenden Sie die Listen der differential/hochvariablen Gene in Clustern als "Genliste" und die Hintergrundgene als Hintergrund für den Vergleich.
      HINWEIS: Fortgeschrittene R-Benutzer können das Paket clusterProfiler22 verwenden, um die Go-Term-Anreicherungsanalyse zu automatisieren.

Ergebnisse

Normale Keratinozytendifferenzierung und RNA-Seq-Analyse
In diesem Experiment wurden Keratinozytenlinien, die von fünf Individuen abgeleitet wurden, für Differenzierungs- und RNA-Seq-Analysen verwendet. Abbildung 1 fasst das experimentelle Verfahren der Differenzierung und der RNA-Seq-Analyseergebnisse zusammen. Abbildung 1Azeigt einen Überblick über die In-vitro-Differenzierungsverfahren normaler Keratinozyten und Zellmorphologieverände...

Diskussion

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Induktion der menschlichen Keratinozytendifferenzierung und anschließenden Charakterisierung mittels RNA-Seq-Analysen. In der aktuellen Literatur verwenden viele Studien zur Unterscheidung der menschlichen Keratinozyten zwei andere Methoden, mit einer hohen Kalziumkonzentration oder mit Serum als Methoden zur Differenzierung2,3,23. Ein früherer Bericht verglich diese drei verschiedenen ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) unterstützt. (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Stipendium der Radboud University (H.Z.); und Stipendium des Chinesischen Stipendienrates 201406330059 (J.Q.).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)LonzaPart of the bulletKit
CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaPart of the bulletKit
InsulinLonzaPart of the bulletKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA synthesisBio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

Referenzen

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