АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлена здесь пошаговая процедура для дифференциации в пробирке первичных кератиноцитов человека путем ингибирования контакта с последующим характеристикой на молекулярном уровне анализом РНК-сек.

Аннотация

Первичные кератиноциты человека часто используются в качестве моделей in vitro для исследований по эпидермальной дифференциации и сопутствующим заболеваниям. Сообщалось о методах дифференциации кератиноцитов в пробирке, обучаемых двумерными (2D) подводными способами с использованием различных условий индукции. Описана здесь процедура 2D в пробирке метод дифференциации кератиноцитов путем ингибирования контакта и последующей молекулярной характеристики РНК-сек. Короче говоря, кератиноциты выращиваются в определенных кератиноцитов среды дополняется факторами роста, пока они полностью стечены. Дифференциация вызвана тесными контактами между кератиноцитами и в дальнейшем стимулируется за счет исключения факторов роста в среде. Используя анализы РНК-сек, показано, что оба дифференцированных кератиноцита обладают различными молекулярными сигнатурами во время дифференциации и 2) динамический шаблон экспрессии генов в значительной степени напоминает клетки во время эпидермального расслоения. Что касается сравнения с нормальной дифференциацией кератиноцитов, то кератиноциты, несущие мутации транскрипционные факторы p63, обладают измененной морфологией и молекулярными сигнатурами, в соответствии с их дефектами дифференциации. В заключение, этот протокол подробно шаги для 2D в пробирке кератиноцитов дифференциации и его молекулярной характеристики, с акцентом на биоинформатический анализ данных РНК-сек. Поскольку процедуры извлечения РНК и РНК-сек хорошо документированы, это не является фокусом этого протокола. Экспериментальная процедура дифференциации кератиноцитов в пробирке и биоинформатического анализа трубопровода может быть использована для изучения молекулярных событий во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

Введение

Первичные кератиноциты человека, полученные из кожи человека, часто используются в качестве клеточной модели для изучениябиологии эпидермиса 1,2,3,4. Стратификация эпидермиса может быть смоделирована с помощью дифференциации кератиноцитов, либо в 2D погруженном монослойном моде, либо в 3D органотипическоймодели 2,3,5,6,7. Хотя 3D-модели становятся все более важными для оценки эпидермальной структуры и функции, 2D модели дифференциации по-прежнему широко используются, в связи с их удобством и возможностью генерировать большое количество клеток для анализа.

Различные условия были применены для индуцирования дифференциации кератиноцитов в 2D, в том числе добавление сыворотки, высокая концентрация кальция, более низкая температура и ингибирование рецепторовэпидермального фактора роста 2,3. Каждый из этих методов был проверен рядом генов маркера дифференциации кератиноцитов и показал свою эффективность в оценке дифференциации кератиноцитов, в том числе в патологических условиях. Тем не менее, эти условия индукции также показывают различия в эффективности их дифференциации и кинетики, когда конкретные панелимаркерных генов рассматриваются 2,3.

Один из этих методов включает в себя ингибирование контакта кератиноцитов и истощение факторов роста в средекультуры 8. Было показано, что кератиноциты могут дифференцироваться спонтанно, когда клетки достигают полной плотности.  Исключение факторов роста в среде культуры может еще больше усилить дифференциацию. Метод объединения ингибирования контакта и истощения факторов роста было показано для создания дифференцированных кератиноцитов с генными экспрессионными моделями, похожими на нормальный стратифицированный эпидермис при использовании нескольких эпидермальныхмаркеров 3, предполагая, что эта модель подходит для изучения нормальной дифференциации кератиноцитов. Недавно, два всеобъемлющих анализа экспрессии генов дифференциации кератиноцитов с помощью этой модели былизарегистрированы 9,10. Исследователи проверили эту модель на молекулярном уровне и показали, что она может быть использована для изучения нормальной и больной дифференциации кератиноцитов.

Этот протокол описывает процедуру метода дифференциации in vitro и молекулярного анализа дифференцированных клеток с использованием РНК-сек. Он также иллюстрирует характеристику транскриптома клеток на день дифференциации 0 (стадия распространения), день 2, день 4 и день 7 (ранняя, средняя и поздняя дифференциация, соответственно). Показано, что дифференцированные кератиноциты отображают модели экспрессии генов, которые во многом напоминают клетки во время эпидермального расслоения. Чтобы изучить, может ли этот метод быть использован для изучения патологии кожи, мы применили тот же экспериментальный и анализ трубопровода для исследования кератиноцитов проведения мутаций транскрипционного фактора p63, которые являются производными от пациентов с эктродактически, эктодермальной дисплазии и расщелины губы / неба (EEC)синдром 11,12. Этот протокол фокусируется на дифференциации кератиноцитов в пробирке, а также последующем биоинформатическое анализ РНК-сек. Другие шаги в полной процедуре, такие как экстракция РНК, подготовка образца РНК-сек и строительство библиотеки, хорошо документированы и могут быть легко соблюдены, особенно при использовании многих широко используемых коммерческих комплектов. Таким образом, эти шаги лишь кратко описаны в протоколе. Данные показывают, что этот трубопровод подходит для изучения молекулярных явлений во время эпидермальной дифференциации в здоровых и больных кератиноцитах.

протокол

Биопсия кожи была взята из ствола здоровых добровольцев или пациентов с мутациями p63, чтобы создать первичную культуру кератиноцитов. Все процедуры, касающиеся создания первичных кератиноцитов человека, были одобрены комитетом по этике Медицинского центра Университета Радбуда в Неймегене ("Комиссар Менсгебонден Ондерзек Арнем-Неймеген"). Получено информированное согласие.

1. Первичная дифференциация кератиноцитов человека путем ингибирования контакта

  1. При необходимости приготовьте среду роста кератиноцитов (KGM) изкератиноцита Базальная среда (таблицаматериалов).
  2. Сделать 500 мл распространения среды с использованием заранее подготовленных запасов (KGM-pro; см. таблицу 1).
  3. Сделайте 500 мл дифференциации среды (KGM-dif; см. Таблицу 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: KGM с добавками можно держать на 4 C в течение двух недель. Для более длительного хранения, он может быть aliquoted и храниться при -20 градусов по Цельсию.
  4. Семена первичных кератиноцитов в плотности 5,0-20 х 103 клетки/см 2, в зависимостиот пролиферативной способности клетки. Добавьте достаточное количество среды KGM-pro для покрытия ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Подробная информация о регулярной культуры клеток в среде KGM можно найти на веб-сайте Lonza13. 2) Плотность посева должна быть проверена для каждой клеточной линии. Например, нормальная первичная линия кератиноцитов может быть посеяна при плотности 5,0 х 103 клетки/см2, в то время как линия, несущая мутации в транскрипционные факторы p63, то есть менее пролиферативные должны быть посеяны при плотности 20 х 103 клеток /см 2. 3) В зависимости от экспериментальной настройки, несколько блюд или колодцев клеток должны быть посеяны, чтобы позволить собирать образцы в разные дни дифференциации в репликах.
  5. Освежите клетки с помощью среды KGM-pro в течение двух дней после посева (посев на 0-й день,освежающий в течение 1-го времени на 3-й день). После этого, обновить с KGM-pro среды через день. Регулярно проверяйте клетки, по крайней мере, через день.
  6. Индуцировать дифференциацию клеток, когда клетки более чем на 90% стечены путем изменения среды на KGM-dif. День смены среды на KGM-dif определяется как день дифференциации 0. Соберите клетки для дальнейшего анализа РНК, сначала стирая 2x с DPBS, затем добавляя в буфер лиза (из комплекта извлечения РНК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При вышеупомянутой плотности посева клетки должны достичь слияния в течение 7-10 дней. Клетки могут быть посеяны с более высокой начальной плотностью, чтобы достичь слияния раньше. Если клетки не пролиферативные, более длительное ожидание может не привести к полному слиянию клеток. Может потребоваться более высокая плотность посева.
  7. Освежают клетки с помощью среды KGM-dif каждый день и собирают клетки на день дифференциации 2, 4. и 7 для дальнейшей добычи РНК.

2. Добыча РНК

  1. Изолировать полную РНК. Это может быть выполнено с помощью коммерческого комплекта изоляции РНК (например, ymo Быстрый РНК MicroPrep РНК), или с помощью фенола14. Тем не менее, изоляционный комплект, содержащий лечение DNAse настоятельно рекомендуется для РНК-сек образцов для предотвращения загрязнения ДНК и фенола. Пример коммерческого комплекта для изоляции РНК приведен в таблице материалов.
  2. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрометра. И ДНК, и РНК имеют пик поглощения на уровне 260 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Соотношение между абсорбансами на 260 нм и 280 нм используется для оценки чистоты РНК. Соотношение около 2,0, как правило, принято как "чистый" РНК. Если соотношение значительно ниже 2,0, образец может быть загрязнен загрязняющими веществами, которые поглощают на 280 нм, таких как белки, фенолы или другие вещества. 2) Соотношение между абсорбансами на уровне 260 нм и 230 нм измеряет чистоту нуклеиновой кислоты. Ожидается соотношение между 2,0 и 2,2. Если соотношение значительно ниже, образец может быть загрязнен загрязняющими веществами, которые поглощают 230 нм, такими как ЭДТА, этанол или другие вещества.

3. Проверка качества РНК

  1. Вы запустите РНК либо на чипе биоанализера РНК Пико для количественной проверки рнк Integrity Number (RIN), либо на геле для качественного измерения. В целом, RIN, по крайней мере восемь настоятельно рекомендуется. Однако при извлечении РНК из тканей РИН может быть ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительно, контроль качества может быть выполнен qPCR на материале РНК.

4. Подготовка библиотеки РНК-сек

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка библиотеки РНК-сек часто осуществляется с коммерческим комплектом или в коммерческих условиях. Описанный протокол адаптирован из коммерческого комплекта, KAPA РНК HyperPrep Kit с RiboErase (Illumina), с кратким описанием всех необходимых шагов: rRNA истощения с олиго гибридизации человека рибосомных РНК, фрагментация РНК, синтез первой нити, синтез второй нити и A-хвост, и послеочистки каждого шага 15. Для этой цели можно также использовать другие комплекты для подготовки библиотеки. Рекомендуется выполнять этот шаг с использованием коммерчески доступного комплекта, так как качество сгенерированной библиотеки cDNA часто более последовательно. 2) Описаны следующие шаги для подготовки библиотеки 1x. При подготовке нескольких образцов, сделать мастер смеси с 10% дополнительного объема.

  1. Олиго гибридизации и rRNA истощения
    1. Подготовка олиго гибридизации мастер-микс (всего 11 йл, с 4,4 йл буфера гибридизации, 4,4 МКЛ гибридизации oligos, и 2,2 йл RNase-свободной воды) и истощения мастер смеси (всего 5,5 йл, с 3,3 йл истощения буфера и 2,2 l RNase H).
    2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 95 градусов по Цельсию в течение 2 мин; до 45 градусов по Цельсию при -0,1 градуса по Цельсию; Пауза в 45 градусов по Цельсию; 45 градусов по Цельсию в течение 30 мин; 4 КК навсегда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим, начиная с двойного количества РНК, чем это необходимо для усиления. В первой попытке используйте половину суммы, чтобы продолжить следующие шаги. Это необходимо для того, чтобы убедиться, что еще есть материал для повторения этих шагов с разным количеством циклов (см. шаг 4.7.2), если циклы усиления оказываются недостаточными или чрезмерно усиленными.
    3. Используйте от 25 нг до 1 мкг общей РНК в 10 МКЛ без РНКС воды, добавьте 10 МКЛ олиго гибридизации мастер смеси. Поместите образцы в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
    4. Когда программа достигнет шага паузы при 45 градусов по Цельсию, добавьте 5 МКЛ мастер-микса к реакции гибридизации 20 йЛ, не удаляя ее из термоциклера. Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз несколько раз.
    5. Возобновление программы термоциклера для продолжения шага истощения (45 градусов по Цельсию в течение 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Положите шарики для истощения rRNA (например, КАПА чистые бусы) при комнатной температуре (RT) во время истощения шаг для следующей части протокола. 2) Рассмотрим подготовку DNase пищеварения мастер смеси (для раздела 4.2), так как реагенты необходимы непосредственно после очистки истощения rRNA.
    6. Выполните 2,2-х шарик на основе KAPA Чистые бусы очистки: объединить смесь РНК (25 йл) и KAPA Чистые бусы (55 йл), тщательно повторного бусы в СМЕСИ РНК путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз.
    7. Инкубировать на RT в течение 5 минут, чтобы РНК связывания с бисером, и поместите трубку (ы) на магнит стойку, чтобы захватить бисер, пока жидкость не будет ясно, и тщательно удалить и отбросить 60 йл супернатанта.
    8. Ведение трубки (ы) на магните, мыть 2x с 200 йл 80% этанола путем инкубации бисера с этанолом в течение ≥30 с и отказаться от этанола. Попробуйте удалить все остаточные этанола, не нарушая бисер после второй стирки.
    9. Высушите бисер на RT в течение 3-5 минут или до тех пор, пока весь этанол не испарится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное высыхание бисера может привести к снижению урожайности.
  2. Пищеварение DNase
    1. Подготовка DNase пищеварения мастер смеси (всего 22 йл, с 2,2 йл буфера DNase, 2 йл DNase, и 17,8 йл RNase свободной воды) .
    2. Resuspend шарики в DNAse пищеварения мастер смеси (20 йл) путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз. Инкубировать трубку (ы) на RT в течение 3 минут, чтобы elute РНК от бисера.
    3. Поместите трубку (ы) на магнитную стойку, чтобы захватить бисер, пока жидкость не будет ясной, и тщательно перенесите 20 мкл супернатанта в чистую трубку.
    4. Инкубировать трубку (ы) с супернатантом при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность подготовки РНК-элюциона, фрагментации и грунтовки мастер-миксов (для раздела 4.3), так как реагенты непосредственно необходимы после очистки пищеварения DNase.
    5. Выполните очистку на основе бисера на 2,2x, следуя 4.1.6-4.1.9.
  3. РНК-элюция, фрагментация и грунтовка
    1. Подготовье мастер-микс Fragment, Prime и Elute Buffer (1x) с 11 МЛ Фрагмента, Прайма и Элуте Буфера (2x) и 11 йл воды без RNase.
    2. Тщательно resuspend шарики с очищенными, DNase-обработанные РНК в 22 йл фрагментации, премьер и Elute Buffer (1x) путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз.
    3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут, чтобы elute РНК отшарика с, а затем поместить трубку (ы) на магнит, чтобы захватить бусы, пока жидкость не станет ясной.
    4. Тщательно перенесите 20 МКЛ супернатанта в трубку (ы). Откажитесь от трубки (ы) с бисером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная остановка, так как образцы могут храниться при -20 градусов по Цельсию в течение ≤24 ч.
    5. Поместите трубку (ы) в термоциклер и провести фрагментации и грунтовки при 94 градусов по Цельсию в течение 6 минут. В результате около 200-300 bp длинные фрагменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубировать в течение 8 мин при 94 градусов по Цельсию для 100-200 bp фрагментов. При использовании частично деградированной РНК, фрагмент между 1-6 мин при 85 градусов по Цельсию в зависимости от тяжести деградации.
    6. Поместите трубку (ы) на лед и немедленно перейти к первой нити синтеза.
  4. Синтез первой нити
    1. Подготовь первую смесь синтеза нитей (всего 12 йл, с 11 йл буфера синтеза первой нити и 1 йл скрипта KAPA).
    2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 25 градусов по Цельсию в течение 10 мин; 42 КК в течение 15 мин; 70 градусов по Цельсию в течение 15 мин; 4 КК навсегда.
    3. На льду смешайте 20 МКЛ фрагментированной загрунтовых РНК с 10 йл первой смеси синтеза нитей. Держите трубку (ы) на льду, тщательно перемешать, аккуратно трубчатой реакции вверх и вниз несколько раз.
    4. Поместите трубку (ы) в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
  5. Синтез второй нити и A-хвост
    1. Подготовьте синтез второй нити и мастер-микс A-tailing на льду (всего 33 йл, с 31 ЗЛ буфера синтеза второй нити и 2 йл второй нити синтеза и A-хвостовой ферментной смеси).
    2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере: 16 градусов по Цельсию в течение 30 мин; 62 КК в течение 10 мин; 4 КК навсегда.
    3. Комбинат 30 йл первого продукта синтеза нити с 30 йл второй нити синтеза и-хвост мастер смеси, и тщательно перемешать путем трубопроводов вверх и вниз несколько раз на льду.
    4. Поместите трубку (ы) в заранее запрограммированный термоциклер и запустите программу.
  6. Адаптация перевязки и после перевязки очистки
    1. Разбавленные фондовые адаптеры (штрих-коды ДНК NEXTflex, 25 МКМ) 3,57x в RNase-свободной воде до 7 МКМ.
    2. Подготовка адаптера лигации мастер-микс (всего 50 йл, с 40 йл буфера перевязки и 10 йл лигозы ДНК).
    3. Объедините 60 мкл второго продукта синтеза нити, 45 МКЛ смеси мастера перевязки адаптера и 5 йл разбавленных адаптеров. Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз несколько раз на льду.
    4. Инкубировать трубки при 20 градусов по Цельсию в течение 15 минут и продолжить немедленно с первой очистки перевязки после перевязки.
    5. Выполните 0,63x бисера на основе очистки путем объединения адаптер-лигатированные ДНК (110 йл) и KAPA чистые бусы (70 йл), а затем тщательно повторно бусинки в смеси ДНК, трубя вверх и вниз несколько раз.
    6. Повторите шаги 4.1.7-4.1.9.
    7. Снимите трубки с магнита. Тщательно resuspend шарики в 50 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5) и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
    8. Поместите тарелку на магнит и подождите, пока жидкость не прояснится. Перенесите 50 МКЛ ясного супернатанта в новую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная точка остановки менее 24 ч при 4 градусах Цельсия.
    9. Выполните очистку на основе бисера на 0,7x, объединив 50 МКЛ бисера с очищенной ДНК с 35 йл решения PEG/NaCL. Тщательно смешайте вихрем.
    10. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 20 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
    11. Поместите тарелку на магнит; ждать, пока жидкость будет ясно. Перенесите 20 МКЛ ясного супернатанта в новую трубку и перенесите в раздел 4.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Безопасная остановка менее чем за 1 неделю при 4 градусов по Цельсию или менее чем за 1 месяц при -20 градусов по Цельсию.
  7. Усиление и очистка библиотеки
    1. Подготовка библиотеки усиления мастер-микс (всего 33 йл, с 27,5 МЛ 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix и 5,5 йл 10x библиотеки усиления грунтовки смеси).
    2. Настройка программы реакции ПЦР на термоциклере с использованием следующих параметров. 98 градусов по Цельсию на 45 с; N циклов (см. примечание ниже) от: 98 градусов по Цельсию для 15 с; 60 градусов по Цельсию на 30 с; 72 градуса по Цельсию на 30 с; 72 КК в течение 1 мин; и 4 КК навсегда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Циклы усиления библиотеки зависят от входного материала. Его можно приблизительно оценить как таковое: начиная с РНК и 25-100 нг, N и 11-15 циклов; 100-250 нг, N и 9-12 циклов; 250-500 нг, N и 7-10 циклов.
    3. Выполните очистку на основе бисера на основе 0,8x, объединив усиленную библиотечную ДНК (50 МКЛ) и чистые бусинки KAPA (40 йл), а затем тщательно повторно поместить бисер в смеси ДНК, несколько раз засовывав вверх и вниз.
    4. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 50 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
    5. Перенесите 50 МКЛ ясного супернатанта на новую трубку и приступайте ко второй очистке усиления библиотеки.
    6. Выполните очистку на основе бисера на основе 1x путем объединения усиленной библиотечной ДНК (50 йл) и чистых бусин KAPA (50 йл), затем тщательно повторно посовестите шарики в смеси ДНК, несколько раз промокая вверх и вниз.
    7. Выполните шаги по очистке 4.1.7-4.1.9. Тщательно resuspend шарики в 22 йл 10 мМ Трис HCL (рН 8,0-8,5), и инкубировать бисер на RT в течение 2 мин.
    8. Передача 20 ЗЛ ясного супернатанта в новую трубку переходит к измерениям Збит и биоанализа.
  8. Размер концентрации и фрагментации
    1. Измерьте концентрацию образцов в ДНК. Использование высокочувствительных флуоресцентных красителей на основе комплекта (например, Denovix Збит, см. Таблица материалов ),или если концентрация, как представляется, ниже 0,5 нг / ЗЛ, requantify с использованием более чувствительного подхода qPCR (например, Каппа количественно, см. Таблицу материалов).
    2. Определите размер фрагмента библиотеки с помощью высокочувствительных электрофорезов (например, биоанализа).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально контроль качества с помощью qPCR может быть выполнен до секвенирования (приложения) с использованием разбавленной подготовленной библиотеки вместо cDNA.
  9. Последовательности
    1. Отправить библиотеку для секвенирования. Для анализа экспрессии дифференциальных генов РНК-сек глубина секвенирования считывается от 10 до 25 миллионов на выборку, как правило, достаточна.

5. Предварительная обработка данных

  1. Проверка качества файлов Fastq
    1. Скачать и установить Trimgalore16, чтобы удалить низкое качество базовых пар и пустые чтения в файлах Fastq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1) Большинство программного обеспечения, упомянутого здесь работает только в Linux. Если он ограничен компьютером Windows, можно проработать анализ на сервере Linux с помощью программного обеспечения MobaXterm или Putty. Имейте в виду, что для индексации генома требуется много случайной памяти доступа (RAM) (около 64 ГБ). 2) Установка всего необходимого программного обеспечения в конда-среде настоятельно рекомендуется. Это позволит легко установки программного обеспечения и управления пакетами. Для получения более подробной информации о конде, посетите сайт lt;https://docs.conda.io'gt;.
    2. Создайте каталог (папку) для данных, например папки "RNA_seq_KC_diff". Установите это в качестве рабочего каталога, введя: "cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обзора структуры папок с folder_structure.txt м.
    3. Создайте несколько папок в рабочем каталоге с конкретными названиями: 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts' и 'Mapping'.
    4. Перемести файлы fasta секвенирований данных в папку fastq. Кроме того, создайте мягкие ссылки с помощью команды: "ln-s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile" к файлам Fastq для экономии дискового пространства.
    5. Вы запустите Trim в изобилии на файлах Fastq, см. .txt TrimGalore для кода, чтобы скопировать пасту в Баш. При необходимости измените имена папок и настройки в команде.
  2. Сопоставление
    1. Скачать геном, чтобы сопоставить читает, например, hg38 ensembl релиз 97 (разоблаченная версия): ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; и соответствующий файл аннотации гена: hg 38 аннотация гена ensembl релиз 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Передача обоих файлов в CRCh38_fasta папку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте другую версию генома, например, версию HG38 UCSC, если предпочтительнее отображение для транскрипции СВУ, а не геномных СВУ.
    2. Установите STAR 2.7.117.
    3. Создайте в доме эталонный геном с помощью STAR 2.7.1 по сценарию генерации генома (см. Дополнительные файлы кодирования). Измените количество потоков на то, что имеет процессер (-runThreadN X). При необходимости измените имена и настройки папок в этом скрипте. Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
    4. Установите samtools 1.918 для индексации файлов бам и gzip для сжатия файлов покачиваться.
    5. Выровнять Trim Galore проверенные секвенирования читает на сборку генома человека hg38 (ensembl релиз 97) с помощью STAR 2.7.1 следуют индексации с использованием samtools и gzip. Это должно быть выполнено с помощью скрипта map_fastq.txt (см. Дополнительные файлы кодирования). При необходимости измените имена и настройки папок в этом скрипте. Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
      ПРИМЕЧАНИЕ: STAR отображение генерирует несколько выходных файлов, в том числе файл бам, файл покачиваться, и читать рассчитывает таблица под названием _ReadsPerGene.out.tab, которые могут быть непосредственно использованы concatenated R для использования в качестве ввода для Deseq2.
  3. Визуализация браузера генома
    1. Установите wigToBigWig от инструментов браузера генома UCSC для того чтобы произвести архивы bigwig с сценарием19big2bw.
    2. Перенесите файлы "convertBigWigChroms.py" и "CRCH38_ensembl2UCSC.txt" из дополнительных файлов кодирования в папку "скрипты" в рабочем каталоге.
    3. Сделайте convertBigWigChroms.py (с помощью команды: 'chmod x скрипты/конвертыBigWigChroms.py' на linux-машине).
    4. Создайте файлы bigWig из файлов Wiggle, используя скрипт wig2bw.txt (см. Дополнительные файлы кодирования). Запустите его путем копирования / вирования в Баш.
    5. Вввесть файлы BigWig в браузер генома UCSC или интегративного зрителя геномики (IGV) для визуализации.

6. Анализ данных РНК-сек

  1. Ввод выборочных данных в Deseq2
    1. Скачать и установить Rstudio (версия 1.1.456) и R (версия 3.6).
    2. Установите все необходимые пакеты R (см. Дополнительные файлы кодирования).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного файла R-markdown, показывающего весь код программирования и выход, см. прилагаемые файлы: "RNA_seq_kc_differentiation_wt.html" и "RNA_seq_kc_differentiation_patient.html". Общее описание всех шагов приведено ниже.
    3. Создайте таблицу подсчета из файлов ReadsPerGene.out.tab.
    4. Напишите файл выборочных данных, содержащий все имена файлов, день дифференциации и другие соответствующие выборочных данных. В примере пример файла см. "sample_data_example.csv" в дополнительных файлах кодирования.
    5. Используйте таблицу подсчета и выборочных данных для создания объекта Deseq220, содержащего как подсчитываемые, так и выборочных данных.
  2. Нормализация экспрессии генов, расстояние выборки и PCA
    1. Нормализация таблицы подсчета в объекте Deseq2 с использованием либо Deseq2 rld, либо нормализации vst. Rld нормализации является предпочтительным, но со многими образцами, VST нормализации гораздо быстрее.
    2. Расстояние выборки участка на основе нормализованной интенсивности считывания с использованием функции«dist»в R и последующего выполнения кластеризацииhclustна основе выборочных расстояний. Участок тепловой карты себя с помощью пакета pheatmap.
    3. Создайте сюжет PCA нормализованного отсчета считывай интенсивности, используя функцию plotPCA Deseq2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PCA служит инструментом в исследовательском анализе данных и может быть использован для визуализации расстояния и родственности между различными образцами.
  3. Дифференциальный/высоко переменный анализ экспрессии генов
    1. Рассчитайте либо дифференциальные гены с помощью функции результата Deseq2. Однако при оценке изменений в течение нескольких точек времени, в которых парные сравнения не применимы, используйте высоко переменные гены. В этом случае извлекайте 500 наиболее переменных генов через заказ на дисперсию между образцами из разных точек времени с функцией rowVars.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем анализе для контрольных образцов для дальнейшего анализа были использованы 500 наиболее переменных генов (гены с самым высоким стандартным отклонением их нормализованной интенсивности в дни дифференциации). Тем не менее, для больного против контроля анализа дифференцированно выраженных генов между болезнью и здоровым контролем с течением времени были рассчитаны Deseq2 с помощью нескольких испытаний исправлено р-значение 1 х 10-4 в качестве отсечения. Другим возможным шагом фильтрации является исключение дифференциальных генов, изменяющихся меньше, чем определенное изменение складок.
    2. Выполняйте кмеаны, группируются на дифференциальных или сильно переменных генах, чтобы сгруппить их различными моделями выражения.
    3. Визуализуйте дифференциальные или сильно переменные гены в тепловой карты с помощью пакета pheatmap. Интенсивность, построенная в тепловой карты, является нормализованной интенсивностью Deseq2 со средним значением вычитается.
  4. Анализ аннотации генной онтологии (GO)
    1. Создайте список выраженных фоновых генов, взяв все гены с более чем 10 графами в одном образце.
    2. Выполните анализ GO с помощью онлайн-инструментов, таких как GOrilla21. В качестве фона для сравнения используйте списки дифференциальных/высоко переменных генов в кластерах и фоновые гены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более продвинутые R-пользователи могут использовать пакетный кластерProfiler22 для автоматизации анализа go-term enrichment.

Результаты

Нормальная дифференциация кератиноцитов и анализ РНК-сек
В этом эксперименте для дифференциации и анализа РНК-сек использовались линии кератиноцитов, полученные от пяти особей. На рисунке 1 обобщается экспериментальная процедура дифференциации и результат...

Обсуждение

В этой работе описывается метод индуцирования дифференциации кератиноцитов человека и последующая характеристика с использованием анализа РНК-сек. В текущей литературе, многие исследования по дифференциации кератиноцитов человека использовать два других метода, с высокой концентр?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Нидерландской организацией научных исследований (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.З.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.З., J.G.A.S.); стипендии Университета Радбуда (Х.З.); и грант Китайского стипендиального совета 201406330059 (J.З.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)LonzaPart of the bulletKit
CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaPart of the bulletKit
InsulinLonzaPart of the bulletKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA synthesisBio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

Ссылки

  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
  3. Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
  4. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  5. Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  6. Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
  7. Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
  8. Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
  9. Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
  10. Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
  11. Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
  12. Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
  13. . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
  14. Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
  15. . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
  16. . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
  17. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  21. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
  22. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  23. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  24. Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  25. Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3' RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
  26. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  27. Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
  28. Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
  29. Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
  30. Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
  31. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
  32. Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
  33. . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
  34. . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1592Din vitrop63

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены