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Résumé

Présenté ici est une procédure stepwise pour la différenciation in vitro des kératinocytes primaires humains par inhibition de contact suivie de la caractérisation au niveau moléculaire par l’analyse d’ARN-seq.

Résumé

Les kératinocytes primaires humains sont souvent utilisés comme modèles in vitro pour des études sur la différenciation épidermique et les maladies connexes. Des méthodes ont été rapportées pour la différenciation in vitro des kératinocytes cultivés dans les manières submergées bidimensionnelles (2D) utilisant diverses conditions d’induction. Décrit ici est une procédure pour la méthode de différenciation in vitro de kératinocyte 2D par inhibition de contact et caractérisation moléculaire suivante par ARN-seq. En bref, les kératinocytes sont cultivés dans le milieu défini de kératinocyte complété avec des facteurs de croissance jusqu’à ce qu’ils soient entièrement confluents. La différenciation est induite par des contacts étroits entre les kératinocytes et encore stimulée par l’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu. À l’aide d’analyses ARN-seq, il est démontré que les deux 1) kératinocytes différenciés présentent des signatures moléculaires distinctes lors de la différenciation et 2) le modèle dynamique d’expression des gènes ressemble en grande partie aux cellules pendant la stratification épidermique. En ce qui concerne la comparaison à la différenciation normale des kératinocytes, les kératinocytes porteurs de mutations du facteur de transcription p63 présentent une morphologie altérée et des signatures moléculaires, compatibles avec leurs défauts de différenciation. En conclusion, ce protocole détaille les étapes de la différenciation in vitro des kératinocytes 2D et de sa caractérisation moléculaire, en mettant l’accent sur l’analyse bioinformatique des données arn-seq. Étant donné que l’extraction de l’ARN et les procédures ARN-seq ont été bien documentées, ce n’est pas l’objet de ce protocole. La procédure expérimentale de différenciation in vitro des kératinocytes et du pipeline d’analyse bioinformatique peut être utilisée pour étudier les événements moléculaires lors de la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Introduction

Les kératinocytes primaires humains dérivés de la peau humaine sont souvent utilisés comme modèle cellulaire pour étudier la biologie de l’épiderme1,2,3,4. La stratification de l’épiderme peut être modélisée par différenciation des kératinocytes, soit d’une manière monocouche immergée en 2D, soit par le modèle organotypique 3D de levage d’air2,3,5,6,7. Bien que les modèles 3D soient devenus de plus en plus importants pour évaluer la structure et la fonction épidermiques, les modèles de différenciation 2D sont encore largement utilisés, en raison de leur commodité et de la possibilité de générer un grand nombre de cellules pour les analyses.

Diverses conditions ont été appliquées pour induire la différenciation des kératinocytes en 2D, y compris l’ajout de sérum, une forte concentration de calcium, une température plus basse et l’inhibition des récepteurs du facteur de croissance épidermique2,3. Chacune de ces méthodes a été validée par un certain nombre de gènes marqueurs de différenciation des kératinocytes et s’est montrée efficace dans l’évaluation de la différenciation des kératinocytes, y compris dans des conditions pathologiques. Cependant, ces conditions d’induction montrent également des différences dans leur efficacité de différenciation et cinétique lorsque des panneaux spécifiques de gènes marqueurssont examinés 2,3.

Une de ces méthodes implique l’inhibition de contact de kératinocyte et l’épuisement des facteurs de croissance dans le milieu de culture8. Il a été démontré que les kératinocytes peuvent se différencier spontanément lorsque les cellules atteignent leur pleine densité.  L’exclusion des facteurs de croissance dans le milieu culturel peut encore améliorer la différenciation. La méthode combinant l’inhibition de contact et les facteurs de croissance appauvrissants a été montrée pour générer des kératinocytes différenciés avec des modèles d’expression de gène semblables à l’épiderme stratifié normal en utilisant plusieurs marqueurs épidermiques3,suggérant que ce modèle est approprié pour étudier la différenciation normale de kératinocyte. Récemment, deux analyses complètes d’expression génétique de la différenciation des kératinocytes à l’aide dece modèle ont été rapportées 9,10. Les chercheurs ont validé ce modèle au niveau moléculaire et ont montré qu’il peut être utilisé pour étudier la différenciation normale et maladie des kératinocytes.

Ce protocole décrit la procédure pour la méthode de différenciation in vitro et l’analyse moléculaire des cellules différenciées utilisant l’ARN-seq. Il illustre également la caractérisation du transcriptome des cellules le jour de différenciation 0 (stade de prolifération), le jour 2, le jour 4 et le jour 7 (différenciation précoce, moyenne et tardive, respectivement). Il est démontré que les kératinocytes différenciés affichent des modèles d’expression génétique qui ressemblent en grande partie à des cellules pendant la stratification épidermique. Pour examiner si cette méthode peut être employée pour étudier la pathologie de peau, nous avons appliqué le même pipeline expérimental et d’analyse pour étudier des keratinocytes portant des mutations du facteur de transcription p63 qui sont dérivés des patients présentant ectrodactyly, displasie ectodermale et cleft lip/palate (EEC) syndrome11,12. Ce protocole se concentre sur la différenciation in vitro des kératinocytes ainsi que sur l’analyse bioinformatique subséquente de l’ARN-seq. D’autres étapes de la procédure complète, telles que l’extraction de l’ARN, la préparation de l’échantillon d’ARN-seq et la construction de bibliothèques, sont bien documentées et peuvent être facilement suivies, en particulier lors de l’utilisation de nombreux kits commerciaux couramment utilisés. Par conséquent, ces étapes ne sont décrites que brièvement dans le protocole. Les données montrent que ce pipeline est approprié pour étudier les événements moléculaires pendant la différenciation épidermique chez les kératinocytes sains et maladies.

Protocole

Des biopsies de peau ont été prises du tronc des volontaires en bonne santé ou des patients présentant des mutations de p63, pour établir la culture primaire de kératinocyte. Toutes les procédures concernant l’établissement des kératinocytes primaires humains ont été approuvées par le comité d’éthique du Centre médical de l’Université Radboud de Nimègue (« Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nimègue »). Un consentement éclairé a été obtenu.

1. Différenciation primaire des kératinocytes humains par inhibition de contact

  1. Préparer le milieu de croissance des kératinocytes (KGM) à partir du milieu basal kératinocyte(tableau des matériaux)si nécessaire.
  2. Faire 500 mL de prolifération moyenne en utilisant des stocks pré-préparés (KGM-pro; voir tableau 1).
  3. Faire 500 mL de différenciation moyenne (KGM-dif; voir tableau 2).
    REMARQUE : Le KGM avec suppléments peut être maintenu à 4 °C pendant deux semaines. Pour un stockage plus long, il peut être aliquoted et stocké à -20°C.
  4. Graines kératinocytes primaires dans la densité de 5,0-20 x 103 cellules /cm2, selon la capacité proliférative cellulaire. Ajouter suffisamment de milieu KGM-pro pour couvrir les cellules.
    NOTE: 1) Les détails de la culture cellulaire régulière dans le milieu KGM peuvent être trouvés dans le site web de Lonza13. 2) La densité d’ensemencement doit être testée pour chaque lignée cellulaire. Par exemple, une lignée normale de kératinocytes primaires peut être ensemencée à une densité de 5,0 x10 3 cellules/cm2, tandis qu’une ligne portant des mutations dans le facteur de transcription p63 qui est moins proliférant devrait être ensemencée à une densité de 20 x 103 cellules/cm2. 3) Selon l’installation expérimentale, plusieurs plats ou puits de cellules devraient être ensemencés pour permettre la collecte d’échantillons les jours de différenciation dans les répliques.
  5. Rafraîchir les cellules avec le milieu KGM-pro pendant deux jours après l’ensemencement (ensemencement le jour 0, rafraîchissant pour la1re fois le jour 3). Ensuite, rafraîchissez-vous avec kgm-pro moyen tous les deux jours. Vérifiez les cellules régulièrement, au moins tous les deux jours.
  6. Induire la différenciation cellulaire lorsque les cellules sont plus de 90% confluent en changeant le milieu à KGM-dif. Le jour du changement moyen à KGM-dif est défini comme jour de différenciation 0. Recueillir les cellules pour d’autres analyses d’ARN en lavant d’abord 2x avec DPBS, puis en ajoutant dans le tampon de lyse (à partir d’un kit d’extraction d’ARN).
    REMARQUE : Avec la densité d’ensemencement mentionnée ci-dessus, les cellules devraient atteindre la confluence dans les 7 à 10 jours. Les cellules peuvent être ensemencées avec une densité initiale plus élevée pour atteindre la confluence plus tôt. Si les cellules ne prolifèrent pas, une attente plus longue peut ne pas donner lieu à des cellules entièrement confluentes. Une densité d’ensemencement plus élevée peut être nécessaire.
  7. Rafraîchissez les cellules avec le milieu KGM-dif tous les jours et recueillez les cellules le jour de différenciation 2, 4. et 7 pour l’extraction d’ARN supplémentaire.

2. Extraction d’ARN

  1. Isoler l’ARN total. Cela peut être effectué à l’aide d’un kit commercial d’isolation arn (comme Zymo Quick-RNA MicroPrep ARN), ou en utilisant lephénol 14. Cependant, une trousse d’isolement contenant un traitement DNAse est fortement recommandée pour les échantillons d’ARN-seq afin de prévenir la contamination par l’ADN et le phénol. Un exemple de kit commercial d’isolation de l’ARN est donné dans le Tableau des matériaux.
  2. Mesurer la concentration d’ARN à l’l’insoum de la technique. L’ADN et l’ARN ont un pic d’absorption à 260 nm.
    REMARQUE : 1) Le rapport entre les absorbances à 260 nm et 280 nm est utilisé pour évaluer la pureté de l’ARN. Un ratio d’environ 2,0 est généralement accepté comme ARN « pur ». Si le ratio est sensiblement inférieur à 2,0, l’échantillon pourrait être contaminé par des contaminants qui absorbent à 280 nm comme des protéines, des phénols ou d’autres substances. 2) Le rapport entre les absorbances à 260 nm et 230 nm mesure la pureté de l’acide nucléique. Un ratio entre 2,0 et 2,2 est attendu. Si le ratio est sensiblement inférieur, l’échantillon pourrait être contaminé par des contaminants qui absorbent à 230 nm comme l’EDTA, l’éthanol ou d’autres substances.

3. Contrôle de la qualité de l’ARN

  1. Exécutez l’ARN soit sur une puce RNA Pico bioanalyzer pour valider quantitativement le numéro d’intégrité de l’ARN (RIN), soit sur un gel pour une mesure qualitative. En général, un RIN d’au moins huit est fortement conseillé. Cependant, lors de l’extraction de l’ARN à partir de tissus, le RIN peut être plus faible.
    REMARQUE : En option, le contrôle de la qualité peut être effectué par qPCR sur le matériau ARN.

4. Préparation de la bibliothèque RNA-seq

REMARQUE : La préparation de la bibliothèque RNA-seq est souvent effectuée avec un kit commercial ou dans des contextes commerciaux. Le protocole décrit est adapté à partir d’un kit commercial, KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (Illumina), avec une brève description de toutes les étapes requises : épuisement du rRNA avec hybridation oligo aux ARN ribosomaux humains, fragmentation de l’ARN, synthèse du premier brin, synthèse du deuxième brin et résidus A, et nettoyage aprèschaque étape 15. D’autres trousses de préparation de bibliothèque peuvent également être utilisées à cette fin. Il est recommandé d’effectuer cette étape à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, car la qualité de la bibliothèque cDNA générée est souvent plus constante. 2) Les étapes suivantes sont décrites pour la préparation 1x bibliothèque. Si vous préparez plusieurs échantillons, faites des mélanges maîtres avec 10% de volume supplémentaire.

  1. Hybridation oligo et épuisement du rRNA
    1. Préparer l’hybridation oligo master mix (total = 11 μL, avec 4,4 μL de tampon d’hybridation, 4,4 μL d’oligos d’hybridation et 2,2 μL d’eau sans RNase) et un mélange maître d’épuisement (total = 5,5 μL, avec 3,3 μL de tampon d’épuisement et 2,2 μL de RNase H).
    2. Mettre en place le programme de réaction PCR sur un thermocycleur : 95 °C pendant 2 min; descendre à 45 °C à -0,1 °C/s; Pause de 45 °C; 45 °C pendant 30 min; 4 °C pour toujours.
      REMARQUE : Envisagez de commencer par le double de la quantité d’ARN nécessaire à l’amplification. Dans la première tentative, utilisez la moitié du montant pour continuer avec les étapes suivantes. Il s’agit de s’assurer qu’il y a encore du matériel pour répéter ces étapes avec un nombre différent de cycles (voir l’étape 4.7.2), si les cycles d’amplification s’avèrent insuffisants ou suramplifiés.
    3. Utilisez entre 25 ng et 1 μg d’ARN total dans 10 μL d’eau sans RNAse, ajoutez 10 μL de mélange maître d’hybridation oligo. Placez des échantillons dans le thermocycleur préprogrammé et démarrez le programme.
    4. Lorsque le programme atteint l’étape de la pause à 45 °C, ajouter 5 μL de mélange maître d’épuisement à la réaction d’hybridation de 20 μL sans l’enlever du thermocycleur. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois.
    5. Reprendre le programme thermocycler pour continuer avec l’étape d’épuisement (45 °C pendant 30 min).
      REMARQUE : 1) Placez les perles pour l’épuisement du rRNA (p. ex., perles pures KAPA) à température ambiante (RT) pendant l’étape d’épuisement pour la prochaine partie du protocole. 2) Envisagez de préparer le mélange maître de digestion DNase (pour la section 4.2), puisque les reagents sont nécessaires directement après le nettoyage de l’épuisement rRNA.
    6. Effectuez un nettoyage kapa pure perle de 2,2 x à base de perles : combinez le mélange d’ARN (25 μL) et de perles pures KAPA (55 μL), en résumant soigneusement les perles dans le mélange d’ARN en pipetage de haut en bas à plusieurs reprises.
    7. Incuber à RT pendant 5 min pour permettre à l’ARN de se lier aux perles, et placer le tube (s) sur une grille aimantée pour capturer les perles jusqu’à ce que le liquide soit clair, et retirer et jeter soigneusement 60 μL de supernatant.
    8. En gardant le tube sur l’aimant, laver 2x avec 200 μL de 80% d’éthanol en incubant les perles avec l’éthanol pendant ≥30 s et jeter l’éthanol. Essayez d’éliminer tout l’éthanol résiduel sans déranger les perles après le deuxième lavage.
    9. Sécher les perles à RT pendant 3 à 5 minutes ou jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé.
      REMARQUE : Le séchage trop sec des perles peut entraîner une réduction du rendement.
  2. Digestion DNase
    1. Préparer le mélange maître de digestion DNase (total = 22 μL, avec 2,2 μL de tampon DNase, 2 μL de DNase et 17,8 μL d’eau sans RNase).
    2. Resuspendez les perles dans le mélange maître de digestion DNAse (20 μL) en pipetting de haut en bas à plusieurs reprises. Incuber le tube (s) à RT pendant 3 min pour élitiser l’ARN des perles.
    3. Placez le tube sur une grille aimantée pour capturer les perles, jusqu’à ce que le liquide soit clair, et transférez soigneusement 20 μL de supernatant dans un tube propre.
    4. Incuber le tube (s) avec un surnatant à 37 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : Envisagez de préparer les mélanges maître d’élitution, de fragmentation et d’amorçage de l’ARN (pour la section 4.3), puisque les réavenants sont directement nécessaires après le nettoyage de la digestion des DNase.
    5. Effectuez un nettoyage à base de perles de 2,2 x en suivant 4.1.6-4.1.9.
  3. Elution, fragmentation et amorçage de l’ARN
    1. Préparez le mélange maître fragment, prime et elute buffer (1x) avec 11 μL d’eau sans fragment, prime et elute (2x) et 11 μL d’eau sans RNase.
    2. Resuspendez soigneusement les perles avec de l’ARN purifié traité au DNase en 22 μL de fragmentation, de tampon prime et d’elute (1x) en faisant monter et descendre plusieurs fois.
    3. Incuber à température ambiante pendant 3 min pour évaporer l’ARN dela perle, puis placer le tube sur un aimant pour capturer les perles jusqu’à ce que le liquide soit clair.
    4. Transférer délicatement 20 μL de supernatant dans un tube.s). Jeter le tube (s) avec des perles.
      REMARQUE : Il s’agit d’un point d’arrêt sûr, car les échantillons peuvent être conservés à -20 °C ≤24 h.
    5. Placez le tube (s) dans un thermocycleur et effectuez la fragmentation et l’amorçage à 94 °C pendant 6 min. Résultant en environ 200-300 bp de long fragments.
      REMARQUE : Incuber pendant 8 min à 94 °C pour des fragments de 100 à 200 pb. Lors de l’utilisation d’ARN partiellement dégradé, fragmenter entre 1-6 min à 85 °C selon la gravité de la dégradation.
    6. Placez le tube sur la glace et passez immédiatement à la synthèse du premier brin.
  4. Synthèse du premier brin
    1. Préparer le premier mélange maître de synthèse des brins (total = 12 μL, avec 11 μL de tampon de synthèse du premier brin et 1 μL de script KAPA).
    2. Configurer le programme de réaction PCR sur un thermocycleur : 25 °C pendant 10 min; 42 °C pendant 15 min; 70 °C pendant 15 min; 4 °C pour toujours.
    3. Sur la glace, mélanger 20 μL d’ARN amorcé fragmenté avec 10 μL de mélange maître de synthèse du premier brin. Garder le tube sur la glace, bien mélanger en pipetting doucement la réaction de haut en bas à plusieurs reprises.
    4. Placez le tube (s) dans le thermocycleur préprogrammé et démarrez le programme.
  5. Synthèse du deuxième brin et résidus A
    1. Préparer la synthèse du deuxième brin et le mélange maître à queue A sur la glace (total = 33 μL, avec 31 μL de tampon de synthèse du deuxième brin et 2 μL de synthèse du deuxième brin et mélange d’enzymes à queue A).
    2. Mettre en place le programme de réaction PCR sur un thermocycleur : 16 °C pendant 30 min; 62 °C pendant 10 min; 4 °C pour toujours.
    3. Mélanger 30 μL de premier produit de synthèse de brins avec 30 μL de synthèse de deuxième brin et de mélange maître à queue A, et bien mélanger en pipetage de haut en bas à plusieurs reprises sur la glace.
    4. Placez le tube (s) dans le thermocycleur préprogrammé et démarrez le programme.
  6. Nettoyage de la ligature des adaptateurs et de la post-ligature
    1. Adaptateurs de stock dilués (codes à barres d’ADN NEXTflex, 25 μM) 3,57x dans de l’eau sans RNase à 7 μM.
    2. Préparer le mélange maître de ligature adaptateur (total = 50 μL, avec 40 μL de tampon de ligature et 10 μL de ligase d’ADN).
    3. Combinez 60 μL de produit de synthèse du deuxième brin, 45 μL de mélange maître de ligature adaptateur et 5 μL d’adaptateurs dilués. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois sur la glace.
    4. Incuber les tubes à 20 °C pendant 15 min et continuer immédiatement avec le premier nettoyage après ligature.
    5. Effectuez un nettoyage à base de perles de 0,63 x en combinant de l’ADN ligated adaptateur (110 μL) et des perles pures KAPA (70 μL), puis résuspendez soigneusement les perles dans le mélange d’ADN en pipetting de haut en bas plusieurs fois.
    6. Répétez les étapes 4.1.7-4.1.9.
    7. Retirer les tubes de l’aimant. Resuspendez soigneusement les perles en 50 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5) et incuber les perles à RT pendant 2 min.
    8. Placez la plaque sur l’aimant et attendez que le liquide soit clair. Transférer 50 μL du supernatant clair dans un nouveau tube.
      REMARQUE : Point d’arrêt sûr de moins de 24 h à 4 °C.
    9. Effectuez un nettoyage à base de perles de 0,7 x en combinant 50 μL de perles avec de l’ADN purifié à ligature adaptateur avec 35 μL de solution PEG/NaCL. Bien mélanger par vortex.
    10. Effectuez les étapes de nettoyage 4.1.7-4.1.9. Resuspendez soigneusement les perles dans 20 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), et incuber les perles à RT pendant 2 min.
    11. Placez la plaque sur l’aimant; attendre que le liquide soit clair. Transférer 20 μL du surnatant clair dans un nouveau tube et passer à l’article 4.7.
      REMARQUE : Point d’arrêt sûr pendant moins d’une semaine à 4 °C ou moins d’un mois à -20 °C.
  7. Amplification et nettoyage de la bibliothèque
    1. Préparer le mix maître d’amplification de la bibliothèque (total = 33 μL, avec 27,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix et 5,5 μL de mélange d’amorce d’amplification de bibliothèque 10x).
    2. Configurer le programme de réaction PCR sur un thermocycleur en utilisant les paramètres suivants. 98 °C pour 45 s; Cycles N (voir la note ci-dessous) de: 98 °C pour 15 s; 60 °C pour 30 s; 72 °C pour 30 s; 72 °C pendant 1 min; et 4 °C pour toujours.
      REMARQUE : Les cycles d’amplification de la bibliothèque dépendent du matériel d’entrée. Il peut être estimé à peu près comme tel: à partir de l’ARN = 25-100 ng, N = 11-15 cycles; 100-250 ng, N = 9-12 cycles; 250-500 ng, N = 7-10 cycles.
    3. Effectuez un nettoyage à base de perles de 0,8 x en combinant l’ADN amplifié de la bibliothèque (50 μL) et les perles pures KAPA (40 μL), puis réutilisez soigneusement les perles dans le mélange d’ADN en faisant monter et descendre plusieurs fois.
    4. Effectuez les étapes de nettoyage 4.1.7-4.1.9. Resuspendez soigneusement les perles dans 50 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), et incuber les perles à RT pendant 2 min.
    5. Transférer 50 μL du supernatant clair dans un nouveau tube et procéder au deuxième nettoyage d’amplification de la bibliothèque.
    6. Effectuez un nettoyage à base de perles 1x en combinant l’ADN amplifié de la bibliothèque (50 μL) et les perles pures KAPA (50 μL), puis réutilisez soigneusement les perles dans le mélange d’ADN en pipetage de haut en bas à plusieurs reprises.
    7. Effectuez les étapes de nettoyage 4.1.7-4.1.9. Resuspendez soigneusement les perles dans 22 μL de 10 mM Tris HCL (pH = 8,0-8,5), et incuber les perles à RT pendant 2 min.
    8. Transfert 20 μL du supernatant clair à un nouveau tube procéder à Qbit et bioanalyzer mesures.
  8. Concentration et taille de fragmentation
    1. Mesurer les concentrations d’ADN des échantillons. À l’aide d’un kit à base de colorant fluorescent hautement sensible (p. ex., Denovix Qbit, voir tableau des matériaux),ou si la concentration semble être inférieure à 0,5 ng/μL, requantifier à l’aide d’une approche qPCR plus sensible (p. ex., quantification kappa, voir tableau des matériaux).
    2. Déterminer la taille des fragments de la bibliothèque à l’aide d’électrophoresis hautement sensible (p. ex., un bioanalyseur).
      REMARQUE : En option, le contrôle de la qualité par qPCR peut être effectué avant le séquençage (Annexe) à l’aide d’une bibliothèque préparée diluée au lieu de l’ADNC.
  9. Séquençage
    1. Envoyez la bibliothèque pour le séquençage. Pour l’analyse différentielle de l’expression des gènes ARN-seq, une profondeur de séquençage des lues entre 10 et 25 millions par échantillon est généralement suffisante.

5. Pré-traitement des données

  1. Contrôle qualité des fichiers Fastq
    1. Téléchargez et installez Trimgalore16 pour supprimer les paires de base de mauvaise qualité et les lectures vides dans les fichiers Fastq.
      NOTE: 1) La plupart des logiciels mentionnés ici ne fonctionne que sous Linux. S’il est limité à un ordinateur Windows, il est possible d’exécuter des analyses sur un serveur Linux à l’aide du logiciel MobaXterm ou Putty. Gardez à l’esprit que pour l’indexation du génome beaucoup de mémoire d’accès aléatoire (RAM) est nécessaire (environ 64 Go). 2) L’installation de tous les logiciels requis dans un environnement conda est fortement recommandé. Cela permettra une installation logicielle facile et la gestion des paquets. Pour plus d’informations sur conda, visitez .
    2. Créez un répertoire (dossier) pour les données, par exemple le dossier « RNA_seq_KC_diff ». Définissez cela comme l’annuaire de travail en tapant: « cd /home/user/RNA_seq_KC_diff/ ».
      REMARQUE : Pour une vue d’ensemble de la structure du dossier, voir « folder_structure.txt » dans les fichiers de codage supplémentaires.
    3. Créez plusieurs dossiers dans l’annuaire de travail avec les noms spécifiques : 'Fastq', 'CRCh38_fasta', 'CRCh38', 'scripts', et 'Mapping'.
    4. Déplacez les fichiers fasta des données séquencées dans le dossier fastq. Alternativement, générer des liens mous en utilisant la commande: « ln -s home/user/old_location_fastq/FastqFile home/user/RNAseq_KC_diff/Fastq/Fastqfile » aux fichiers Fastq pour économiser de l’espace disque.
    5. Exécutez Trim à gogo sur les fichiers Fastq, consultez le fichier TrimGalore.txt pour que le code copie la pâte en bash. Modifiez les noms et les paramètres du dossier dans la commande si nécessaire.
  2. Cartographie
    1. Téléchargez un génome pour cartographier les reads à, par exemple, hg38 ensembl release 97 (version démasquée) : ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCH38.primary_assembly.fa.gz ; et le fichier d’annotation génétique correspondant : hg 38 gene annotation ensembl release 97, ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-97/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.97.gtf.gz. Transférer les deux fichiers dans le dossier CRCh38_fasta.
      REMARQUE : Utilisez alternativement une version différente du génome, par exemple, la version UCSC de hg38, si la cartographie pour la transcription des ID plutôt que des ID génétiques est préférée.
    2. Installez STAR 2.7.117.
    3. Générer un génome de référence interne à l’aide de STAR 2.7.1 par le script du génome generate (voir Supplemental Coding Files). Modifiez la quantité de threads en ce que le processeur a (--runThreadN X). Modifiez les noms et paramètres des dossiers dans ce script si nécessaire. Exécutez-le par copie / pâturage en bash.
    4. Installez des samtools 1.918 pour indexer les fichiers bam et gzip pour compresser les fichiers wiggle.
    5. Alignez les lectures validées de séquençage Trim Galore sur l’assemblage du génome humain hg38 (libération de l’ensembl 97) à l’aide de STAR 2.7.1 suivie de l’indexation à l’aide de samtools et de gzip. Cela doit être effectué à l’aide du script map_fastq.txt (voir Fichiers de codage supplémentaires). Modifiez les noms et paramètres du dossier dans ce script si nécessaire. Exécutez-le en copiant/en les parant en bash.
      REMARQUE : La cartographie STAR génère plusieurs fichiers de sortie, y compris un fichier bam, un fichier agité et une table de compte de lecture nommée *_ReadsPerGene.out.tab, qui peut être directement utilisée concatenated par R pour l’utiliser comme entrée pour Deseq2.
  3. Visualisation du navigateur du génome
    1. Installez wigToBigWig à partir des outils de navigateur ucsc génome pour générer des fichiers bigwig avec le script big2bw19.
    2. Transférez les fichiers « convertBigWigChroms.py » et « CRCH38_ensembl2UCSC.txt » des fichiers de codage supplémentaires à un dossier « scripts » dans l’annuaire de travail.
    3. Rendre le convertBigWigChroms.py exécutable (en utilisant la commande: 'chmod +x scripts/convertBigWigChroms.py' sur une machine Linux).
    4. Générer des fichiers bigWig à partir des fichiers Wiggle, en utilisant le script wig2bw.txt (voir Fichiers de codage supplémentaires). Exécutez-le par copie / pâturage en bash.
    5. Entrez les fichiers BigWig sur le navigateur du génome de l’UCSC ou Integrative Genomics Viewer (IGV) pour la visualisation.

6. Analyse des données ARN-seq

  1. Saisie de données d’échantillons dans Deseq2
    1. Téléchargez et installez Rstudio (version 1.1.456) et R (version 3.6).
    2. Installez tous les paquets R requis (voir fichiers de codage supplémentaires).
      REMARQUE : Pour un fichier R-markdown détaillé affichant tout le code de programmation et la sortie, consultez les fichiers ci-joints : « RNA_seq_kc_differentiation_wt.html » et « RNA_seq_kc_differentiation_patient.html ». Une description générale de toutes les étapes est incluse ci-dessous.
    3. Générer une table de compt compte à partir des fichiers ReadsPerGene.out.tab.
    4. Rédiger un fichier de données d’échantillon, contenant tous les noms de fichiers, le jour de la différenciation et d’autres données d’échantillons pertinentes. Par exemple, exemple de fichier d’exemple, voir « sample_data_example.csv » dans les fichiers de codage supplémentaires.
    5. Utilisez la table de comptage et les données de l’échantillon pour générer un objet Deseq220 contenant à la fois les données dénombrées et les données de l’échantillon.
  2. Normalisation de l’expression génique, distance de l’échantillon et PCA
    1. Normaliser la table de comptage dans l’objet Deseq2, en utilisant soit Deseq2 rld, soit vst normalisation. La normalisation de Rld est préférée, mais avec beaucoup d’échantillons, la normalisation de vst est beaucoup plus rapide.
    2. Tracer la distance de l’échantillon en fonction des intensités normalisées du nombre de lecture àl’aide de la fonction « dist» en R et, par la suite,effectuer un regroupement « hclust» en fonction de la distance de l’échantillon. Tracez la carte thermique elle-même à l’aide du paquet pheatmap.
    3. Générer une parcelle PCA des intensités normalisées du nombre de lecture en utilisant la fonction plotPCA de Deseq2.
      REMARQUE : L’APC sert d’outil dans l’analyse exploratoire des données et peut être utilisée pour visualiser la distance et la relation entre les différents échantillons.
  3. Analyse différentielle/très variable de l’expression des gènes
    1. Calculer soit les gènes différentiels à l’aide de la fonction de résultat Deseq2. Toutefois, lors de l’évaluation des changements sur plusieurs points de temps dans lesquels les comparaisons pairewise ne sont pas applicables, utilisez des gènes très variables. Dans ce cas, extraire les 500 gènes les plus variables en commander sur la variance entre les échantillons de différents points de temps avec la fonction rowVars.
      REMARQUE : Dans notre analyse, pour les échantillons de contrôle, les 500 gènes les plus variables (les gènes ayant l’écart type le plus élevé de leur intensité normalisée entre les jours de différenciation) ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Cependant, pour l’analyse maladie vs contrôle, les gènes exprimés différemment entre la maladie et les témoins sains au fil du temps ont été calculés par Deseq2 à l’aide d’un test multiple corrigé de la valeur p de 1 x10-4 comme seuil. Une autre étape possible de filtrage est d’exclure les gènes différentiels qui changent moins qu’une certaine coupure de changement de pli.
    2. Effectuer des kmeans se regrouper sur les gènes différentiels ou très variables pour les regrouper par différents modèles d’expression.
    3. Visualisez les gènes différentiels ou très variables dans une carte thermique à l’aide du paquet pheatmap. L’intensité tracée dans la carte thermique est l’intensité normalisée de Deseq2 avec la valeur médiane soustraite.
  4. Analyse de l’enrichissement de l’annotation de Gene Ontology (GO)
    1. Générer une liste de gènes de fond exprimés en prenant tous les gènes avec plus de 10 dénombrements dans un seul échantillon.
    2. Effectuez l’analyse GO à l’aide d’outils en ligne tels que GOrilla21. Utilisez les listes des gènes différentiels/très variables en grappes comme « liste génétique » et les gènes de fond comme arrière-plan à comparer.
      REMARQUE : Les utilisateurs R plus avancés peuvent utiliser le clusterprofilerde paquets 22 pour automatiser l’analyse d’enrichissement à terme Go.

Résultats

Différenciation normale des kératinocytes et analyse ARN-seq
Dans cette expérience, des lignées de kératinocytes dérivées de cinq individus ont été employées pour la différenciation et les analyses d’ARN-seq. La figure 1 résume la procédure expérimentale de différenciation et les résultats de l’analyse ARN-seq. La figure 1A illustre un aperçu des procédures de différenciation in vitro des kératinocytes normaux et des changements de morphologie cell...

Discussion

Ce travail décrit une méthode pour induire la différenciation humaine de kératinocyte et la caractérisation suivante utilisant des analyses d’ARN-seq. Dans la littérature actuelle, beaucoup d’études sur la différenciation humaine de kératinocyte emploient deux autres méthodes, avec une concentration élevée de calcium ou avec le sérum comme méthodes pour induire la différenciation2,3,23. Un rapport précédent ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Bourse de l’Université Radboud (H.Z.); et subvention du Conseil chinois des bourses d’études 201406330059 (J.Q.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Bioanalyzer 2100AgilentG2929BA
Bovine pituitary extract (BPE)LonzaPart of the bulletKit
CFX96 Real-Time systemBio-RadqPCR machine
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Sigma-AldrichD8537
Epidermal Growth Factor (EGF)LonzaPart of the bulletKit
Ethanolamine >= 98%Sigma-AldrichE9508
High Sensitivity DNA chipsAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaPart of the bulletKit
InsulinLonzaPart of the bulletKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript cDNA synthesisBio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001Low concentration measure kit
KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboEraseRocheKK8540RNAseq kit
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (model)Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements
NEXTflex DNA barcodes -24IllumniaNOVA-5141036 bp long primers
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513

Références

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