Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الحصول على السكان نقية من الخلايا الليفية أمر بالغ الأهمية لدراسة دورها في إصلاح الجروح والتليف. وصف هنا هو طريقة مفصلة لعزل الخلايا الليفية وmyofibroblasts من قلوب الفئران غير المصابة والجرحى تليها توصيف نقاوتها ووظائفها من قبل الفلورسة المناعية ، RTPCR ، الفلورسة بمساعدة فرز الخلايا ، و الكولاجين هلام الانكماش.

Abstract

التليف القلبي استجابة للإصابة هو استجابة فسيولوجية لتضميد الجروح. وقد بُذلت جهود لدراسة واستهداف الأنواع الفرعية للانفجار الليفي التي تخفف من التليف. ومع ذلك ، تم إعاقة أبحاث الخلايا الليفية بسبب عدم وجود علامات ليفية مقبولة عالميًا لتحديد الخلايا الليفية الممتعة وكذلك الخلايا الليفية المنشطة. الخلايا الليفية هي مجموعة خلايا غير متجانسة ، مما يجعلها صعبة العزل وتوصيفها. يصف البروتوكول المقدم ثلاث طرق مختلفة لإثراء الخلايا الليفية والخلايا الليفية من قلوب الفئران غير المصابة والمصابة. استخدام بروتوكول قياسي وموثوق به لعزل الخلايا الليفية سيمكن من دراسة أدوارها في التوازن وكذلك تعديل التليف.

Introduction

الخلايا الليفية القلبية، الخلايا ذات الأصل المتوسط، تلعب دورا هاما في الحفاظ على التوصيل الكهربائي والقوى الميكانيكية في القلب بالإضافة إلى الحفاظ على الهندسة المعمارية القلبية أثناء التوازن1. بعد الإصابة ، يتم تنشيط هذه الخلايا ، وتوسيعها ، وإنتاج بروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM)2. وقد كشفت العديد من الدراسات قبل السريرية الخلايا الليفية والمنظمين الخلوية الحرجة التي تحافظ على السلامة الهيكلية للقلب المصاب3 وكذلك الخلايا المؤثرات الرئيسية المسؤولة عن إنتاج وترسب البروتينات ECM دون رادع، مما أدى إلى تشكيل ندبة قاسية وفشل القلب4. الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا ، مما يجعل من الصعب تشريح وظيفتها العلاجية من الخصائص غير التكيفية المؤيدة للليفية. في الآونة الأخيرة ، تم تحديد التغاير الوظيفي لهذين النوعين الفرعيين الليفيين المتميزين بعد إصابة عضلة القلب ، مما يشير إلى إمكانية عزل الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا الليفية ودراسة دورها في التئام الجروح5.

الحصول على الخلايا الليفية النقية أمر بالغ الأهمية في تحديد دورهم الوظيفي في الإصلاح والتليف. ومع ذلك ، فإن وجود علامات الليفية المتعددة التي تعترف بأنواع الخلايا الأخرى تجعل من الصعب عزل مجموعة من الخلايا الليفية النقية إلى حد كبير6. وقد وضعت العديد من الدراسات الأنيقة طرق ذكية لعزل الخلايا الليفية القلبية من غير المصابين والجرحى عضلة القلب. الطريقة الأكثر شعبية وراسخة لإثراء الخلايا الليفية هي من خلال الالتصاق الانتقائي بعد هضم الأنسجة الأنزيمية7.

بالإضافة إلى ذلك ، تم بنجاح وصف فرز الخلايا المنشط ة (FACS) من الخلايا الليفية استنادًا إلى مستضدات سطح الخلية8. في الدراسة، بعد الهضم الأنزيمي، تم فرز الخلايا المتوسطة كنسب سلبي (لين: Ter119−CD45−CD31−) وgp38-إيجابية (gp38+) من قلوب الفئران. تم تأكيد Gp38+ ve الخلايا لتكون الخلايا الليفية على أساس التعبير المشترك من col1α1 وغيرها من علامات mesenchymal. على الرغم من أن معظم هضم الأنسجة يتم الانتهاء بعد تشريح البطين في طبق بيتري، وقد حققت دراسة حديثة استخدام إنزيم إبرة مباشرة من البطين الأيسر لعزل myocytes وغير myocytes التي تشمل الخلايا الليفية9. ثم تم عزل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي في هذه الحالة.

يصف هذا البروتوكول عزل وإثراء الخلايا الليفية باستخدام ثلاث طرق. الأول هو طريقة راسخة بالفعل تنطوي على الالتصاق الانتقائي للخلايا الليفية بعد الهضم الأنزيمي. يتم استخدام الطريقة الثانية لعزل في المقام الأول إصابة الناجمة عن العضلات ألفا الملساء التعبير عن myofibroblasts. الطريقة الثالثة تنطوي على الاستنفاد المغناطيسي التتابعي لتعليق خلايا القلب المهضم ة من الخلايا الدمية والفيوثيريلية. بعد الاستنفاد ، يتم عزل الخلايا الليفية / myofibroblasts استنادًا إلى وجود مستضد MEFSK4 باستخدام الخرز المغناطيسي. في الآونة الأخيرة ، وقد وصفت MEFSK4 كما antigen الحاضر على quiescent وكذلك تنشيط الخلايا الليفية ، مما يجعلها علامة مناسبة لتحديد الخلايا الليفية والعزلة. وبطبيعة الحال، فإن جميع الأساليب الموضحة هنا لها قيود فريدة من نوعها. ولذلك يوصى بشدة بالتحقق من نقاء مجموعة الخلايا المعزولة عن طريق تحليل التدفق ، وتلطيخ المناعة ، وشبه الكمية PCR في الوقت الحقيقي. ومع ذلك ، يمكن توسيع نطاق هذه المنهجيات ، ويمكن إضافة علامات إضافية من أجل استبعاد المجموعات السكانية الملوثة الأخرى قبل استخدام الخلايا الليفية والخلايا الليفية للسكان لإجراء تجارب حاسمة.

Protocol

وتؤيد هذه الدراسة بدقة التوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة. ووافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للمملكة في جامعة فاندربيلت على البروتوكول (رقم البروتوكول: M1600076-01).

1. تشريح القلب

  1. إعداد الحل
    1. المخزن المؤقت KHB
      1. باستخدام شريط اثارة، تذوب ببطء 9.4 غرام من كريبس-Henseleit العازلة (KHB) مسحوق في 900 مل من المياه DDI.
        ملاحظة: سوف يترسب المخزن المؤقت إذا أثار بسرعة كبيرة جداً أو لفترة طويلة جداً. يجب أن يكون العازلة KHB الباردة أثناء عزل الخلايا الليفية.
      2. إضافة 2.9 mM CaCl2 و 24 mM NaHCO3. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.3 وتمييع إلى حجم 1 لتر مع dH2O.
      3. باستخدام فلتر معقم (0.22 ميكرون)، يخزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع. الحفاظ على الجليد أو عند 4 درجات مئوية لمدة العزلة.
    2. كوكتيل هضم الكولاجين
      1. إعداد كوكتيل الهضم في يوم العزلة الليفية. تحديد الحجم المناسب من كوكتيل الهضم وفقا لعدد من القلوب; 5 مل من الكوكتيل لكل قلب واحد.
      2. إعداد مزيج الكولاجين (انظر جدول المواد)وDNase الأول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. ل20 مل من مجموع كوكتيل الهضم، إضافة 17.5 ميكرولتر من DNase I، 180 ميكرولتر من 1 M HEPES، و 500 ميكرولتر من الكولاجين إلى أنبوب مخروطي فارغ 50 مل.
      4. إضافة حجم كاف من حل هانك الملح المتوازن (HBSS) مع كاليفورنيا2 + وملغ2 + للحصول على حجم إجمالي 20 مل.
    3. خلية الدم الحمراء (RBC) العازلة
      1. تحديد الحجم الإجمالي المطلوب بناءً على عدد القلوب (5 مل/قلب). تمييع المخزن الاحتياطي للمخزون RBC 10x إلى 1x باستخدام dH2O.
    4. وسائل الإعلام الليفية: 10٪ FBS في DMEM F-12
      1. إضافة 10٪ FBS إلى DMEM-F12 مع L-الجلوتامين وHEPES. أضف 10 يو/مل بنسلين/ستريبتومسين، 2.5 ميكروغرام/مل مضاد للفطريات، و2.5 ميكروغرام/مل من الميكوبلازما الوقائية (انظر جدول المواد). تخزين في 4 درجة مئوية.
  2. تشريح القلب
    1. إعداد لوحة بئر 6 على الجليد مع 2 مل من KHB الباردة لكل بئر لتخزين القلوب في أثناء تشريح. الاستفادة من مقص جراحي ة الأوتوكلف وملقط.
    2. القتل الرحيم الفئران في 12 أسبوعا من العمر أو أكثر عن طريق جرعة زائدة من الايفورلوران، واتبع مع خلع عنق الرحم.
    3. بدلا من ذلك، لعزل ة الليفية المنشطة، حث احتشاء عضلة القلب في الفئران 12 أسبوع من العمر عن طريق ربط الشريان التاجي10. القتل الرحيم الفئران 8-10 أيام بعد الإصابة.
    4. الجسم رذاذ مع الإيثانول 70٪ والشرقية حتى الجانب البطني يواجه المجرب. قم بتثبيت الزوائد أو تقييدها لمنع التداخل.
    5. قطع الجلد والعضلات في البطن مفتوحة ولكن تجنب ثقب الكبد. قطع عموديا نحو القص, وفتح الصدر بعناية مع تجنب ثقب القلب. الاستمرار في قطع من خلال القفص الصدري لفضح القلب.
    6. باستخدام ملقط، ارفع القلب برفق من الصدر، وقص أي رئة أو أنسجة زائدة متصلة بالجزء الخارجي من القلب. إزالة البطين ومكان في بئر واحد من 6 لوحة جيدة مع KHB الباردة. الاستمرار في تشريح القلوب بهذه الطريقة حتى تم عزل جميع العينات.
  3. التفكك الأنزيمي للقلب
    1. استخدام ملقط، والضغط مرارا وتكرارا وتحريك القلب في KHB لإزالة الدم الزائد. نقل القلب إلى لوحة معقمة نظيفة 10 سم2. باستخدام شفرة حافة واحدة، بسرعة المفروم القلب إلى قطع صغيرة.
    2. أضف 1 مل من كوكتيل هضم الكولاجين واستمر في التشليل حتى تصبح القطع صغيرة بما يكفي لنقلها مع ميكروبيبات 1 مل. نقل القطع إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع ميكروبيبات 1 مل. غسل لوحة 2x مع 2 مل من كوكتيل هضم الكولاجين.
      ملاحظة: يمكن أن يساعد قطع جزء من طرف الماصة في جمع قطع أكبر من القلب قد تصبح عالقة في طرف الماصة.
    3. احتضان أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز أو التحريض. أنبوب آمن حسب الحاجة. إعادة تعليق 10x مع أنبوب 5 مل حتى تكون المحتويات متجانسة، واحتضان أنبوب مخروطي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع التناوب أو الانفعالات.
    4. إعادة تعليق 10x مع 10 مل الأنابيب حتى متجانسة. قم بإنشاء مصفاة خلية تبلغ 40 ميكرومترًا عن طريق ترطيب الفلتر باستخدام 1-2 مل من المخزن المؤقت KHB فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. إضافة 25 مل من العازلة KHB لتعليق الهضم، وإعادة تعليق، وتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر تستعد. تغيير عامل التصفية حسب الحاجة.
      ملاحظة: كما يبطئ الترشيح، والتنصت طفيفة أنبوب أو باستخدام ميكروبيبات 1 مل لرسم تعليق من الجانب السفلي من مرشح يمكن أن تساعد على تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر المحظورة جزئيا.
    5. الطرد المركزي في 400 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 1x RBC العازلة الليسيه (5 مل / القلب). احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    6. الطرد المركزي في 400 × ز وRT لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant ثم غسل عن طريق إعادة تعليق بيليه في 1 مل من العازلة KHB.
    7. إضافة 9 مل من العازلة KHB والتصفية من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 50 مل. الطرد المركزي في 400 × ز وRT لمدة 10 دقيقة.
    8. إزالة supernatant، resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام الليفية أو برنامج تلفزيوني، وتحديد عدد الخلية. يمكن عزل الخلايا الليفية بالطرق الثلاث المختلفة الموضحة أدناه.

2. عزل الخلايا الليفية من تعليق الخلية الواحدة

  1. العزلة الليفية: الطلاء التفاضلي(الشكل 1)
    1. إعداد لوحة 6-جيدا عن طريق إضافة 2 مل من وسائل الإعلام الليفية في البئر ويحوم لوحة لتغطية الجزء السفلي جيدا.
    2. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام لكل قلب. لوحة 1 مل من تعليق الخلية في البئر بحيث يتم مطلي قلب واحد (نظريا) في البئر. على سبيل المثال، سيتم إعادة تعليق ستة قلوب في 6 مل من وسائل الإعلام، ثم مطلي في ستة آبار مع 1 مل من تعليق الخلية لكل بئر.
    3. لوحة دوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي. أضف وسائط إضافية من 1 إلى 2 مل لكل بئر لحجم إجمالي يصل إلى 5 مل لكل بئر، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
    4. سيتم فصل الخلايا الليفية عن طريق الالتصاق الانتقائي بعد 4 ح. إزالة الخلايا غير المرتبطة والميتة عن طريق إزالة وسائل الإعلام. غسل الخلايا المرفقة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 2-4 مل وسائط الليفية العقيمة في البئر. احتضان في 37 درجة مئوية حتى confluent. تغيير وسائل الإعلام كل 2-4 أيام.
  2. العزلة الليفية : FACS باستخدام نموذج الماوس مراسل GFP(الشكل 1)
    1. المخزن المؤقت FACS
      1. إعداد 15 مل من 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في dPBS دون Ca2+ وMg2+. تخزينها على الجليد أو عند 4 درجات مئوية.
    2. حل مانع FC
      1. إعداد 0.5 μL FC مانع (تنقية المضادة للفأرة CD16/CD32) في 25 ميكرولتر من FACS (1:50 تخفيف). مطلوب 25 ميكرولتر من محلول مانع FC لكل عينة. تخزينها على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
    3. إعداد العينة وتلطيخ الأجسام المضادة
      ملاحظة: يمكن إعداد تخفيفات الأجسام المضادة مسبقًا، ولكن هذا قد يخاطر بالتعرض للضوء أو درجة الحرارة.
      1. إعداد 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 وهذا هو 2x التخفيف المطلوب في المخزن المؤقت FACS. انظر الجدول 1 للأجسام المضادة والمخففات.
      2. إعادة تعليق 500،000 الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من حل مانع FC لمنع الربط غير محدد من منطقة الأجسام المضادة FC لمستقبلات FC. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
      3. إضافة 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 الأجسام المضادة إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر من تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
      4. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      5. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقله إلى أنبوب قياس الخلايا المتدفق.
    4. فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS)
      ملاحظة: كانت فئران مراسل GFP-αSMA مساهمة من الدكتور إيفو كالازيكيتش11. هذا الماوس يعبر GFP تحت الخلية العضلية الملساء ألفا (αSMA) المروج. وقد استخدمت αSMA كعلامة على الخلايا الليفية المنشطة (myofibroblasts)12.
      1. لعزلة الخلايا الليفية المنشطة (αSMA التي تعبر عن الخلايا الليفية الليفية) ، حث احتشاء عضلة القلب في 12 من العمر أسابيع GFP-αSMA الفئران عن طريق ربط الشريان التاجي. التضحية الفئران 8-10 أيام بعد الإصابة.
      2. بعد تعليق خلية واحدة من قلوب الفئران المصابة، فرز αSMA+ ve الخلايا الليفية للبروتين الفلوري الأخضر (GFP). استخدم الخلايا الليفية غير الملطخة غير المصابة لتعيين إشارة الخلفية في قناة GFP بعد التعويض.
      3. بوابة ليعيش GFP+ ve الخلايا عن طريق التكبير ل7AAD-ve/GFP+ الخلايا أو خلايا الشبح صبغ البنفسجي 510-ve/GFP+ ve الخلايا وفرز GFP التعبير عن αSMA +ve myofibroblasts. جمع الخلايا في وسائل الإعلام الليفية.
  3. العزلة الليفية: عزل الخلايا الليفية المغناطيسية القائمة على الخلايا الليفية(الشكل 1)
    1. المخزن المؤقت للتوازن
      ملاحظة: قم دائماً بإعداد مخزن مؤقت جديد للعزل.
      1. إعداد 0.5٪ BSA و 2 MM EDTA في برنامج تلفزيوني. إزالة الغاز المخزن المؤقت عن طريق تحريك الحل في حين تعلق فراغ لغطاء الحاوية.
        ملاحظة: التحريك يزيل الغاز الزائد من الحل الذي تتم إزالته بعد ذلك من خلال الفراغ بحيث فقاعات لن تسد عمود الفصل عند الاستخدام.
    2. وضع العلامات المغناطيسية: CD45+ الخلايا الهيماتوبوية
      1. خلايا طرد مركزي معزولة من قلوب الفئران في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، ثم إزالة supernatant.
      2. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من عازلة التوازن. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
      3. الطرد المركزي تعليق الخلية على النحو الوارد أعلاه وإعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية. أضف 10 ميكرولتر من CD45+ الخرز المغناطيسي لكل 1 × 107 خلايا إجمالية. مزيج جيد واحتضان لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في 4°C.
      4. غسل الخلايا عن طريق إضافة 2 مل عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، ثم الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في 4°C.
      5. إزالة supernatant، عد الخلايا باستخدام مقياس الهيوكتومتر وإعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 107 الخلايا الإجمالية في 2 مل من المخزن المؤقت التوازن. إذا كان هناك أكثر من 10خلايا 7، مقياس المخزن المؤقت خطياً. تمرير الخلايا من خلال مرشح 40 ميكرومتر لمنع تجمعات الخلايا من انسداد مصفوفة عمود الفصل.
    3. الفصل المغناطيسي: CD45+ الخلايا الهيماتوبوية
      1. ضع عمود الفصل في المجال المغناطيسي لعمود فاصل وتوازن مناسب مع ما لا يقل عن 3 مل من PBS.
      2. جمع الخلايا غير المسماة في flowthrough (FT)، وغسل العمود 3x مع 3 مل من المخزن المؤقت التوازن. جمع السهو مع FT. إزالة العمود من الفاصل. ضع العمود على أنبوب مخروطي 15 مل.
      3. طرد CD45 المسمى مغناطيسيا+ الخلايا عن طريق pipetting 5 مل من عازلة التوازن على العمود ويغرق بحزم الخلايا مع المكبس الموردة مع العمود.
      4. طرد مركزي eluent وكذلك FT / غسل كسور في 500 × ز. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
    4. وضع العلامات المغناطيسية والانفصال: CD31+ الخلايا التنظيرية
      1. كرر بروتوكول لCD45+ وضع العلامات المغناطيسية والفصل (الأقسام 2.3.2-2.3.3)، باستثناء استخدام CD31+ الخرز المغناطيسي لاحتضان مع FT وغسل أجزاء منالعزلCD45 + .
    5. العلامات المغناطيسية والانفصال: MEFSK4+ الخلايا الليفية
      1. كرر بروتوكول لCD45+ وضع العلامات المغناطيسية باستخدام MEFSK4 المضادة للتغذية- APC الأجسام المضادة بدلا من الخرز المغناطيسي. الطرد المركزي FT ويغسل أجزاء من CD31+ العزل في 500 × ز لمدة 5 دقيقة، ثم إزالة supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للتوازن، وعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر.
      2. أضف 10 ميكرولتر من MEFSK4 المضادة للتغذية-APC الأجسام المضادة لكل 1 × 107 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في 4 درجة مئوية.
      3. غسل الخلايا المنضمة MEFSK4 الأجسام المضادة عن طريق إضافة 5 مل من عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، ثم الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
      4. إزالة supernatant وresuspend في الخرز المضادة لAPC، وذلك باستخدام نفس الحجم من MEFSK4 المضادة للتغذية- APC الأجسام المضادة المستخدمة. احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      5. الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة. إزالة supernatant، إعادة تعليق في 2 مل من عازلة التوازن لكل 1 × 107 الخلايا الإجمالية، والمضي قدما مع الفصل المغناطيسي كما هو موضح سابقا (القسم 2.3.3). يمكن استخدام الخلايا الليفية المنفصلة مغناطيسيًا MEFSK4+ve/ CD45-ve/CD31-ve في تحليلات النقاء والتطبيقات الأخرى في المصب.-ve

3. النقاء وتحليل وظائف السكان الليفية المعزولة

  1. تحليل نقاء السكان FACS: تحليل خلية αSMA-GFP(الشكل 2)
    1. إعادة تعليق الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من محلول مانع Fc لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
    2. اختياري: إضافة 25 ميكرولتر من 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
    3. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    4. إعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. إضافة CD31-PE، CD45-APC، والأجسام المضادة AN2/NG2 مباشرة إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد(الجدول 1).
    5. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل FACS المخزن المؤقت. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    6. إضافة حمار المضادة للفئران AlexaFluor 405 الأجسام المضادة الثانوية إلى الخلايا المسماة مع الأجسام المضادة الأولية غير المبشور. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    8. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقله إلى أنبوب قياس التدفق المسمى لتحليل التدفق.
      ملاحظة: تحليل FACS لتوصيف تعبير مستضد MEFSK4 على الخلايا الليفية المعزولة موضح في القسم 3.3.
  2. تحليل نقاء الخلايا الليفية: الفلورة المناعية(الشكل 3A)
    1. البذور 30،000 الخلايا الليفية الأولية (P0-P1) في البئر على coverslips وضعت في لوحة 24 جيدا والثقافة حتى 80٪ confluent. أو التركيز على فرز CD45+ وCD31+ الخلايا (30،000 خلية لكل بئر) على قسيمة الغلاف بواسطة cytospin في 400 × × ز (طريقة تستخدم لإيداع الخلايا مباشرة والتساوي على غطاء في لوحة 24 جيدا).
    2. إصلاح الخلايا مع الأسيتون الباردة لمدة 15 دقيقة. غسل 3x مرات مع برنامج تلفزيوني.
    3. كتلة الشرائح في 10٪ مصل الماعز. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها(الجدول 2).
    4. غسل الشرائح 3x في برنامج تلفزيوني. احتضان الأجسام المضادة الثانوية ل2 ساعة(الجدول 2).
    5. الشرائح مضادة للبقع، وجبل مع قطرة واحدة من DAPI في وسائل الإعلام المتصاعدة بطيئة تتلاشى.
  3. FACS تحليل النقاء السكاني: MEFSK4 التحقيق(الشكل 3B)
    1. إعادة تعليق الخلايا المعزولة حديثا في 25 ميكرولتر من محلول مانع FC لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة. احتضان لمدة 5 دقيقة في RT.
    2. اختياري: إضافة 25 ميكرولتر من 7AAD أو شبح صبغ البنفسجي 510 إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد في الظلام.
    3. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقيقة.
    4. إعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. إضافة MEFSK4 الأجسام المضادة مباشرة إلى تعليق الخلية. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد (الجدول 1).
    5. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    6. إضافة الجرذ IgG-APC إلى الخلايا(الجدول 1). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    7. غسل عن طريق إعادة تعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 سنوات.
    8. إعادة تعليق بيليه في حجم عينة قياس التدفق الموصى به من المخزن المؤقت FACS (300 ميكرولتر) ونقل لتدفق أنبوب القياس الخلوي لتحليل التدفق.
  4. تحليل نقاء الخلايا الليفية: شبه كمي في الوقت الحقيقي rtPCR(الشكل 3C)
    1. عزل الجيش الملكي النيبالي وشبه كمي PCR في الوقت الحقيقي
    2. بعد إثراء الخلايا الليفية ، عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة العزل الجيش الملكي النيبالي (انظر جدول المواد). اتبع تعليمات الشركة المصنعة.
    3. استكمال أول توليف الحمض النووي حبلا باستخدام مجموعة التوليف cDNA (انظر جدول المواد)،وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    4. تنفيذ شبه كمي في الوقت الحقيقي PCR5.
  5. تحليل وظائف الليفية: تحليل الكولاجين هلام انقباض(الشكل 4)
    1. محلول الكولاجين
      1. إعداد 20 MM HEPES و 44 MM NaHCO3 في DMEM. إضافة 1.67 ملغ من نوع 1 الكولاجين الفئران لكل 1 مل من DMEM مع HEPES وNaHCO3.
    2. TGFа المكمل DMEM
      1. إعداد 10٪ FBS في DMEM تكملها المضادات الحيوية والمضادة للفطريات. إضافة TGFа إلى تركيز نهائي من 1 نانوغرام / مل.
    3. خلية / خليط الكولاجين والطلاء
      1. إعداد تعليق الخلية (P3-P5) وتحديد الحجم المطلوب للحصول على 3.3 × 105 خلايا.
      2. إضافة حجم تعليق مع 3.3 × 105 خلايا إلى ما يكفي من محلول الكولاجين للحصول على 1 مل الحجم الإجمالي.
        ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الكولاجين من النوع 1 1 الآن 1.5 ملغم/مل.
      3. في لوحة بئر 48، البذور 300 ميكرولتر من مزيج الكولاجين الخلية لكل بئر (~ 1 × 105 خلايا / جيد). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حتى هلام.
      4. استخدم إبرة 30 G للمساعدة في فصل الجل عن جدران البئر. إضافة 600 ميكرولتر من TGFа وFBS مكملة DMEM إلى كل بئر. لوحات الصور على الماسح الضوئي العاكسة في 24 ساعة و 48 ساعة.
        ملاحظة: أجريت جميع تجارب الفلورسينس المناعي على آلة قياس خلايا التدفق مجهزة بثلاثة أشعة ليزر (405 نانومتر و488 نانومتر و640 نانومتر). تم الحصول على البيانات باستخدام برنامج الحصول على بيانات التدفق(جدول المواد). وأُجري مزيد من تحليل البيانات باستخدام برامجيات تحليل بيانات التدفق. AlexaFluor 405 والشبح صبغ البنفسجي 510 كانت متحمسة مع ليزر 405 نانومتر وجمعها باستخدام 450/50 BP و 525/50 BP مرشح، على التوالي. كانت GFP و PE متحمسة بليزر 488 نانومتر وتم جمعها باستخدام مرشحات 530/30 BP و 575/26 BP ، على التوالي. أما APC أو AlexaFluor 647 كان متحمسا من قبل 640 نانومتر الليزر وجمعها باستخدام مرشح 670/14 BP. تم إجراء جميع تجارب فرز الخلايا على آلة قياس الخلايا المتدفقة(جدول المواد)المجهزة بأربعة أشعة ليزر (405 نانومتر و488 نانومتر و561 نانومتر و640 نانومتر). 7-AAD كان متحمسا باستخدام ليزر 561 نانومتر وجمعها مع مرشح 670/14 BP. تم جمع GFP وGhost Dye Violet 510 باستخدام نفس تركيبات الليزر / التصفية كما هو موضح أعلاه. استخدمت جميع تجارب الفرز فوهة 100 أم مع تكوين ضغط 17 psi لزيادة قابلية استمرارية المصب للخلايا المستهدفة.

النتائج

تدفق نظام الجاتينغ الذي يظهر عزل myofibroblast باستخدام فئران مراسل αSMA-GFP
وأظهرت قلوب غير مصاب لا يمكن الكشف عنها GFP+ الخلايا في αSMA-GFP نموذج الماوس مراسل; وبالتالي ، تم استخدامها لإنشاء بوابة لإشارة خلفية قناة GFP بعد التعويض(الشكل 2). تم فرز αSMA+ الخلايا على أس?...

Discussion

الخلايا الليفية هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا، تم تحديدها من قبل مجموعة متنوعة من العلامات. علامات البروتين التي تم استخدامها لتحديد الخلايا الليفية هي مستقبلات المجال discoidin 2 (DDR2)، فيفينكتين، vimentin، الكولاجين الأول والثالث، وThy115،,16،,17،

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

يريد المؤلفون أن يشكروا الدكتور إيفو كالازيكيتش على فئران αSMA-GFP. تم دعم البحوث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM118300 (S.S.) ، المعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية في المعاهد القومية للصحة تحت رقم الجائزة R21EB019509 (P.P.Y.)، ومنحة تنمية العلماء من جمعية القلب الأمريكية تحت رقم الجائزة 17SDG33630187 (S.S.). تم إجراء تحليلات قياس التدفق الخلوي في الموارد المشتركة VUMC Flow Cytometry Shared resource التي يدعمها مركز فاندربيلت إنغرام للسرطان (P30 CA68485) ومركز أبحاث أمراض الجهاز الهضمي فاندربيلت (DK058404).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)Sigma AldrichA9528
Bovine Serium Albumin (BSA)Sigma9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPESLife technologies11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+Gibco13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)Life technologies16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powderSigmaK3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis BufferMiltenyi130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)Gibco15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)Molecular ProbesA1310dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1MD Bioproducts203002dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)Tonbo Biosciences13-0870dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11029dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3Southern Biotech4050-02dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11006dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247dilution = 1:200; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)Sigma AldrichA2547dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic BeadsMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Magnetic BeadsMiltenyi Biotec130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC BeadsMiltenyi Biotec130-090-855
Rat IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405Abcamab175670dilution = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm FilterThermo Scientific723-2520
10 cm2 Cell Culture DishCorning430167
10 mL PipetFisherbrand13-678-11E
40 µm Cell StrainerFisherbrand22363547
5 mL PipetFisherbrand13-678-11D
50 mL Conical TubeFalcon352070
6-well PlateCorning3506
Flow Cytometry TubesFalcon352058
Forceps
Rocker
Single Edge BladePAL62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini KitQaigen74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation KitAmbionAM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitBioRad1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)BD Biosciences

References

  1. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  2. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis. Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  3. Duan, J., et al. Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair. EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).
  4. Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).
  5. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  6. Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis. American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).
  7. Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration. Development. 143 (3), 387-397 (2016).
  8. Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105 (2019).
  9. Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  10. Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing. Nature Communications. 10 (1), 3027 (2019).
  11. Kalajzic, Z., et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone. 43 (3), 501-510 (2008).
  12. Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens. Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).
  13. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  14. Montesano, R., Orci, L. Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).
  15. Goldsmith, E. C., et al. Organization of fibroblasts in the heart. Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).
  16. Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis. Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).
  17. Goodpaster, T., et al. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).
  18. Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium. Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).
  19. Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).
  20. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).
  21. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  22. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 SMA myofibroblast MEFSK4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved