成人心脏纤维细胞和肌纤维细胞的分离与表征

摘要

获得成纤维细胞的纯种群对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。这里描述的是一种详细的方法，从未受伤和受伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌纤维细胞，然后通过免疫荧光、RTPCR、荧光辅助细胞分拣和胶原蛋白凝胶收缩。

摘要

心脏纤维化对损伤的反应是伤口愈合的生理反应。已努力研究和靶向减轻纤维化的纤维细胞亚型。然而，由于缺乏普遍接受的成纤维细胞标记来识别静止和活化成纤维细胞，成纤维细胞的研究一直受到阻碍。纤维细胞是异质细胞群，难以分离和特征化。提出的协议描述了三种不同的方法来丰富纤维细胞和肌纤维细胞从未受伤和受伤的小鼠心脏。使用标准可靠的协议来分离成纤维细胞，可以研究它们在平衡和纤维化调制中的作用。

引言

心脏成纤维细胞，中质源细胞，除了在平衡1期间维持心脏结构外，在维持心脏的电传导和机械力方面起着^{重要作用。}损伤后，这些细胞被激活，膨胀，并产生细胞外基质（ECM）蛋白质^2。许多临床前研究表明，成纤维细胞是维持受伤心脏³的结构完整性的关键细胞调节器，以及负责ECM蛋白无节制生产和沉积的主要作用细胞，导致硬性疤痕形成和心力衰竭^4。纤维细胞是一组异质细胞，很难从亲纤维的不适应特性中剖析它们的恢复功能。最近，确定了心肌损伤后两种不同成纤维细胞亚型的功能异质性，表明可以隔离不同的纤维细胞亚型，并研究其在伤口愈合^{中的作用。}

获得纯成纤维细胞种群对于界定其在修复和纤维化中的作用至关重要。然而，多重纤维细胞标记的存在，识别其他细胞类型，使得分离一个基本上纯成纤维细胞种群⁶具有挑战性。一些优雅的研究已经设计了巧妙的方法来分离心脏成纤维细胞从未受伤和受伤的心肌。最流行和成熟的方法来丰富成纤维细胞是通过选择性粘附后酶组织消化^7。

此外，基于细胞表面抗原的成纤维细胞荧光激活细胞分拣（FACS）也已成功描述^8。在这项研究中，在酶消化之后，从小鼠心脏对间皮细胞按系系阴性（林:Ter119⁺CD45⁺CD31+）和gp38阳性（gp38^+）分类。⁻Gp38^_ve细胞根据col1+1和其他间质标记的共同表达被确认为成纤维细胞。虽然大多数组织消化是在解剖出培养皿中的心室后完成的，但最近一项研究调查了左心室中直接注入针头酶以分离肌细胞和非肌细胞（包括成纤维细胞^9）的研究。在这种情况下，纤维细胞通过选择性粘附分离。

该协议使用三种方法描述了成纤维细胞的分离和浓缩。第一种是一种已经确立的方法，即酶消化后有选择性地粘附成纤维细胞。第二种方法主要用于主要分离损伤引起的阿尔法平滑肌肉表达肌纤维细胞。第三种方法涉及血液细胞和内皮细胞酶消化的心脏细胞悬浮液的连续磁耗竭。耗竭后，纤维细胞/肌纤维细胞根据抗原MEFSK4的存在而使用磁珠进行分离。最近，MEFSK4被描述为一种抗原，存在于静止和活化成纤维细胞上，使其成为纤维细胞识别和隔离的合适标记。当然，这里描述的所有方法都有独特的局限性。因此，强烈建议通过流量分析、免疫染色和半定量实时PCR来检查分离细胞群的纯度。然而，这些方法可以扩大，并添加额外的标记，以排除其他污染人群之前，利用成纤维细胞和肌纤维细胞种群进行关键的实验。

研究方案

这项研究严格坚持《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》中的建议。范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准了该协议（协议号:M1600076-01）。

1. 心脏解剖

1. 解决方案准备
   1. KHB 缓冲器
      1. 使用搅拌棒，在 900 mL DDI 水中缓慢溶解 9.4 克克雷布斯-亨塞莱特缓冲液 （KHB） 粉末。
         注:如果搅拌速度过快或搅拌时间过长，缓冲器会沉淀。KHB 缓冲液在纤维化隔离期间必须冷。
      2. 添加 2.9 mM CaCl₂和 24 mM NaHCO₃。将 pH 调整到 7.2~7.3，用 dH₂O 稀释至 1 L 的体积。
      3. 使用无菌过滤器 （0.22 μm），在 4 °C 下储存长达 4 周。在隔离期间，保持冰上或4°C。
   2. 胶原酶消化鸡尾酒
      1. 在纤维细胞分离当天准备消化鸡尾酒。根据心脏数量确定适当的消化量;每颗心脏5 mL鸡尾酒。
      2. 根据制造商的说明制备胶原酶混合物（参见材料表）和DNase I。
      3. 对于20 mL的总消化鸡尾酒，在空50mL锥形管中加入17.5μL的DNase I，180μL的1M HEPES，500μL的胶原酶。
      4. 添加足够的汉克平衡盐溶液 （HBSS） 与 Ca²⁺和 Mg²⁺的容量，以获得 20 mL 的总体积。
   3. 红血球 （RBC） 水热缓冲液
      1. 根据心脏数量（5 mL/心脏）确定所需的总体积。使用 dH₂O 将 10 倍 RBC 水石液液缓冲液稀释至 1 倍。
   4. 纤维化介质:DMEM F-12 中的 10% FBS
      1. 将 10% 的 FBS 添加到 DMEM-F12 中，加入 L-谷氨酰胺和 HEPES。加入10 U/mL青霉素/链霉素、2.5微克/mL抗真菌和2.5微克/mL支原体预防（见材料表）。储存在 4 °C。
2. 心脏解剖
   1. 在冰上准备一个6孔板，每口井有2 mL的冷KHB，在解剖过程中将心脏储存在一起。使用自切除手术剪刀和钳子。
   2. 在12周大或12周以上的小鼠因异氟拉涅过量而安乐死，并随后进行宫颈脱位。
   3. 或者，对于活化成纤维细胞分离，通过冠状动脉结扎¹⁰诱导12周大小鼠心肌梗死。受伤后8-10天对小鼠进行安乐死。
   4. 喷雾体与70%乙醇和定向，使腹侧面向实验者。固定或抑制附属物以防止干扰。
   5. 切开腹部皮肤和肌肉，但避免刺穿肝脏。垂直切向胸骨，小心地打开胸腔，同时避免心脏穿孔。继续切开肋骨以露出心脏。
   6. 使用钳子，轻轻地将心脏从胸部抬起来，切掉任何附着在心脏外侧的肺或多余的组织。拆下心室，放入 6 孔板的一口中，并带有冷 KHB。继续以这种方式解剖心脏，直到所有样本被分离。
3. 心脏的酶分离
   1. 使用钳子，反复挤压和搅拌KHB的心脏，以消除多余的血液。将心脏转移到10厘米²板的清洁无菌。使用单刃刀片，快速将心脏切成小块。
   2. 加入1 mL胶原酶消化鸡尾酒，继续切碎，直到碎片足够小，可以用1 mL微移液转移。将碎片转移到带有 1 mL 微移管的 50 mL 锥形管中。用 2 mL 胶原酶消化鸡尾酒洗涤板 2x。
      注: 切断移液器尖端的一部分可以帮助收集较大的心脏碎片，否则可能会卡在移液器尖端。
   3. 在37°C孵育锥形管30分钟，摇摇晃动或搅拌。根据需要固定管。用 5 mL 移液器重新悬浮 10 倍，直到内容物均匀，并在 37 °C 下用旋转或搅拌孵育锥形管 15 分钟。
   4. 用 10 mL 移液重新悬浮 10 倍，直到均匀。通过在新的 50 mL 锥形管上用 1⁄2 mL KHB 缓冲液润湿滤网，将 40 μm 细胞滤网加注。通过注底40μm细胞滤网，将25 mL的KHB缓冲液添加到消化悬浮液、重新悬浮和过滤中。根据需要更改筛选器。
      注:随着过滤速度变慢，轻轻敲击管或使用 1 mL 微移液器从过滤器底面拉悬架可以帮助细胞悬浮液通过部分堵塞的 40 μm 细胞滤网。
   5. 在 400 x g和 4 °C 下离心 10 分钟。取出上清液，并在 1x RBC 赖塞缓冲液（5 mL/心脏）中重新悬浮颗粒。在室温 （RT） 下孵育 2 分钟。
   6. 在 400 x g和 RT 下离心 10 分钟。去除上清液，然后通过在 KHB 缓冲液的 1 mL 中重新悬浮颗粒来洗涤。
   7. 加入9 mL KHB缓冲液，并通过引注40μm细胞滤网过滤到新的50 mL锥形管中。在 400 x g和 RT 下离心 10 分钟。
   8. 取出上清液，重新悬浮在1 mL的成纤维细胞介质或PBS中，并确定细胞数。纤维细胞可以通过下面描述的三种不同的方法进行分离。

2. 从单细胞悬浮物中分离成纤维细胞

1. 纤维化隔离:差分电镀 （图 1）
   1. 准备一个6孔板，通过添加2 mL的成纤维化介质每孔和旋转板覆盖井底。
   2. 将细胞悬浮在每心脏1 mL的介质中。板 1 mL 细胞悬浮每个孔，使一个心脏（理论上）被镀每个孔。例如，六颗心将重新悬浮在6 mL的介质中，然后镀入6口井，每口孔有1 mL的细胞悬浮液。
   3. 旋转板均匀分布细胞。每口井再加1⁄2 mL介质，每口井总体积可达5 mL，并在37°C下孵育4小时。
   4. 纤维细胞将在4小时后通过选择性粘附分离。用2 mL PBS清洗附着细胞，每口加入2~4 mL无菌成纤维细胞培养液。在37°C孵育，直到汇入。每 2⁄4 天更换一次介质。
2. 纤维化隔离:使用GFP报告鼠标模型的FACS （图1）
   1. FACS 缓冲区
      1. 准备15 mL的5%胎儿牛血清（FBS）在dPBS没有Ca²⁺和Mg^2+。储存在冰上或4°C。
   2. FC阻滞器解决方案
      1. 在 25 μL 的 FACS（1:50 稀释）中制备 0.5 μL FC 阻滞剂（纯化抗鼠标 CD16/CD32）。每个样品需要25μL的FC阻滞剂溶液。储存在冰上或4°C。
   3. 样品制备和抗体染色
      注:抗体稀释物可以提前准备，但这可能会有光线或温度暴露的风险。
      1. 准备 7AAD 或幽灵染料紫紫 510，这是 FACS 缓冲液中所需稀释的 2 倍。有关抗体和稀释物，请参阅表 1。
      2. 在FC阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮500，000个新鲜分离的细胞，以防止FC抗体区域与FC受体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
      3. 将 7AAD 或幽灵染料紫紫 510 抗体添加到细胞悬浮液的最终体积 25 μL 中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
      4. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟，在 4°C 下。
      5. 在FACS缓冲液（300 μL）的建议流细胞学样品体积中重新悬浮颗粒，并转移到流式细胞测量管。
   4. 荧光激活细胞分拣 （FACS）
      注:GFP-_SMA记者老鼠是伊沃·卡拉伊齐奇博士¹¹的贡献。此小鼠表示 GFP 下 α 平滑肌肉细胞 （#SMA） 促进.*SMA已被用作活性成纤维细胞（肌纤维细胞）^{的标记12。}
      1. 对于激活性成纤维细胞（*SMA表达肌纤维细胞）分离，通过冠状动脉结扎诱导12周大GFP-_SMA小鼠心肌梗死。受伤后8-10天牺牲小鼠。
      2. 在受伤的小鼠心脏单细胞悬浮后，为绿色荧光蛋白 （GFP） 对 βSMA^_ve成纤维细胞进行排序。使用未染色的未受伤的成纤维细胞在补偿后在 GFP 通道中设置背景信号。
      3. 通过浇注 7AAD^-ve/GFP^+ve细胞或幽灵染料紫色 510^{-ve /GFP+ve}细胞和排序 GFP 表达 _SMA^_ve肌瘤细胞的活 GFP^_ve细胞的门。收集成纤维细胞介质中的细胞。
3. 纤维细胞分离:成纤维细胞的磁珠分离（图1）
   1. 平衡缓冲区
      注: 始终为隔离准备新的缓冲区。
      1. 在 PBS 中准备 0.5% BSA 和 2 mM EDTA。在将真空附着在容器盖上时，搅拌溶液，对缓冲液进行脱气。
         注: 搅拌可去除溶液中多余的气体，然后通过真空去除，这样气泡在使用时不会堵塞分离柱。
   2. 磁性标记:CD45⁺造血细胞
      1. 将小鼠心脏分离的细胞在500 x g下分离5分钟，然后去除上清液。
      2. 在1 mL的平衡缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。使用血细胞计对细胞进行计数。
      3. 将细胞悬浮液如上所示离心，并在每1 x 10⁷个总细胞中重新悬浮90 μL平衡缓冲液。每 1 x 10⁷个单元加入 10 μL CD45⁺磁珠。混合良好，在4°C孵育至少15分钟。
      4. 通过每1 x 10⁷个单元加入2 mL平衡缓冲液来清洗细胞，然后在500 x g下在4°C下10分钟离心。
      5. 去除上清液，使用血细胞计计数细胞，并在2 mL平衡缓冲液中重新悬浮至1 x 10⁷总细胞。如果存在超过 10^{个 7}个单元格，则线性缩放缓冲区。通过 40 μm 过滤器传递细胞，以防止细胞聚合堵塞分离柱矩阵。
   3. 磁分离:CD45⁺造血细胞
      1. 将分离柱放置在具有至少 3 mL PBS 的合适分离柱和平衡柱的磁场中。
      2. 收集流通 （FT） 中未标记的单元格，用 3 mL 平衡缓冲液洗涤列 3x。使用 FT 收集处理，从分隔器中删除列。将柱放在 15 mL 锥形管上。
      3. 通过将 5 mL 的平衡缓冲液移解到柱上，用柱状随附的柱塞牢固地将细胞浸平，将磁性标记的 CD45⁺细胞冲洗出来。
      4. 离心机脱位以及FT/洗涤分数在500 x g。使用血细胞计对细胞进行计数。
   4. 磁性标记和分离:CD31⁺内皮细胞
      1. 重复 CD45⁺磁标和分离（第 2.3.2⁄2.3.3 节）的协议，但使用 CD31⁺磁珠孵育 FT 和从 CD45⁺隔离中洗涤部分除外。
   5. 磁性标记和分离:MEFSK4⁺成纤维
      1. 使用 MEFSK4 抗馈送-APC 抗体代替磁珠重复 CD45⁺磁标标记协议。将 FT 和洗涤部分从 CD31^{中分离 5} 分钟，然后去除上清液。将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的平衡缓冲液中，并使用血细胞计对细胞进行计数。
      2. 每1 x 10⁷细胞加入10μL的MEFSK4抗进料-APC抗体。在4°C下孵育至少15分钟。
      3. 洗涤MEFSK4抗体结合细胞，每1 x 10⁷总细胞加入5 mL的平衡缓冲液，然后在500 x g下离心5分钟。
      4. 使用相同体积的MEFSK4抗馈送-APC抗体，去除上清液并重新悬浮在抗APC珠中。在4°C下在冰上孵育15分钟。
      5. 在500 x g下离心10分钟。去除上清液，重新悬浮在每1 x 10⁷总细胞2 mL的平衡缓冲液中，然后按照前面所述进行磁分离（第2.3.3节）。磁分离的 MEFSK4^+ve/ CD45^-ve/CD31^-ve成纤维细胞可用于纯度分析和其他下游应用。

3. 孤立成纤维细胞种群的纯度和功能分析

1. FACS种群纯度分析:*SMA-GFP细胞分析（图2）
   1. 在Fc阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮新鲜分离的细胞，以防止抗体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
   2. 可选:将25μL的7AAD或幽灵染料紫罗兰510添加到细胞悬浮液中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
   3. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟。
   4. 在FACS缓冲液的50μL中重新悬浮颗粒。将 CD31-PE、CD45-APC 和 AN2/NG2 抗体直接添加到细胞悬浮液中。在冰上孵育15分钟（表1）。
   5. 通过在 1 mL FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
   6. 将驴子抗大鼠AlexaFluor 405次抗体添加到标有未结合原抗体的细胞中。在冰上孵育30分钟。
   7. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
   8. 在 FACS 缓冲液 （300 μL） 的建议流细胞测量样本体积中重新悬浮颗粒，并转移到标记的流细胞测量管进行流量分析。
      注:FACS分析来描述MEFSK4抗原在分离的成纤维细胞上表达的特征，第3.3节对此进行了描述。
2. 纤维细胞纯度分析:免疫荧光（图3A）
   1. 每口30，000个原发性纤维化（P0-P1）种子，放置在24孔板的盖玻片上，培养至80%的汇合体。或者将排序的^CD45+和CD31+细胞（每口30，000个细胞）集中在400 x×g的囊速上g（一种用于直接均匀地沉积在24孔板盖玻片上的方法）。⁺
   2. 用冷丙酮固定细胞15分钟，用PBS洗涤3次。
   3. 块状幻灯片在10%山羊血清。孵育滑轨与主要抗体过夜（表2）。
   4. 在 PBS 中洗涤幻灯片 3 倍。孵育2小时二次抗体（表2）。
   5. 反染色滑动，并在缓慢淡入淡出的安装介质中一滴 DAPI 安装。
3. FACS种群纯度分析:MEFSK4探测（图3B）
   1. 在FC阻滞剂溶液的25μL中重新悬浮新鲜分离的细胞，以防止抗体的非特异性结合。在RT孵育5分钟。
   2. 可选:将25μL的7AAD或幽灵染料紫罗兰510添加到细胞悬浮液中。在黑暗中的冰上孵育30~60分钟。
   3. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 500 x g下离心 5 分钟。
   4. 在FACS缓冲液的50μL中重新悬浮颗粒。将MEFSK4抗体直接添加到细胞悬浮液中。在冰上孵育15分钟（表1）。
   5. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
   6. 将大鼠 IgG-APC 添加到细胞中（表 1）。在冰上孵育30分钟。
   7. 通过在 1 mL 的 FACS 缓冲液中重新挂起来洗涤。在 400 x g下离心 5 分钟。
   8. 在FACS缓冲液（300 μL）的建议流细胞测量样品体积中重新悬浮颗粒，并转移到流细胞测量管进行流量分析。
4. 纤维化纯度分析:半定量实时rtPCR（图3C）
   1. RNA分离和半定量实时PCR
   2. 在成纤维细胞富集后，使用RNA分离试剂盒分离RNA（参见材料表）。按照制造商的说明操作。
   3. 按照制造商的说明，使用 cDNA 合成试剂盒（参见材料表）完成第一链 DNA 合成。
   4. 执行半定量实时PCR^5。
5. 纤维化功能分析:胶原蛋白凝胶收缩性测定（图4）
   1. 胶原蛋白溶液
      1. 在 DMEM 中准备 20 mM HEPES 和 44 mM NaHCO_3。加入1.67毫克的1型大鼠胶原蛋白每1 mLDMEM与HEPES和_NaHCO3。
   2. TGF® 补充 DMEM
      1. 在DMEM中制备10%的FBS，并辅以抗生素和抗真菌。将 TGF® 添加到最终浓度为 1 纳克/mL。
   3. 细胞/胶原混合物和电镀
      1. 准备细胞悬浮液 （P3-P5），并确定所需的体积以获得 3.3 x 10^{5 个}单元。
      2. 将悬浮体积与 3.3 x 10⁵细胞添加到足够的胶原蛋白溶液中，以获得 1 mL 的总体积。
         注:大鼠胶原蛋白1型浓度现在应该为1.5毫克/mL。
      3. 在48孔板中，每口孔的种子300μL的细胞胶原混合物（+1 x 10⁵细胞/孔）。在37°C孵育15~20分钟，直到凝胶化。
      4. 使用 30 G 针帮助将凝胶从井壁中分离出来。在每个油井中加入 600 μL TGF® 和 FBS 补充 DMEM。24 小时和 48 小时反光扫描仪上的图像板。
         注:所有免疫荧光实验都是在配备三个激光器（405 nm、488 nm 和 640 nm）的流式细胞测量机上进行的。数据是使用流数据采集软件（材料表）获得的。使用流数据分析软件执行进一步的数据分析。AlexaFluor 405 和幽灵染料紫罗兰 510 对 405 nm 激光感到兴奋，并分别使用 450/50 BP 和 525/50 BP 过滤器进行采集。GFP 和 PE 对 488 nm 激光器感到兴奋，并分别使用 530/30 BP 和 575/26 BP 滤清器进行收集。APC 或 AlexaFluor 647 对 640 nm 激光器感到兴奋，并使用 670/14 BP 滤光片进行采集。所有细胞分拣实验均在配备四台激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm）的流式细胞测量机（材料表）上进行。7-AAD 使用 561 nm 激光器激发，并使用 670/14 BP 滤光片进行收集。GFP 和幽灵染料紫罗兰 510 使用上述相同的激光/过滤器组合进行收集。所有分拣实验都使用了具有 17 psi 压力配置的 100 um 喷嘴，提高了目标单元的下游可行性。

结果

使用 βSMA-GFP 报告小鼠显示肌纤维细胞分离的流量浇注方案
未受伤的心脏在βSMA-GFP报告鼠模型中显示没有可检测的^GFP+细胞;因此，它们被用来为补偿后GFP通道的背景信号建立一个门（图2）。*SMA⁼细胞根据在MI后10天从受伤左心室的GFP表达情况排序。一小部分内皮细胞（GFP+/CD31+） 细胞;SD = 3.8% = 0.0164;n = 5） 和造血性 （GFP+/CD45+ 细胞）;SD = 3.18% = 0.01...

讨论

纤维细胞是一个异质细胞组，由不同的标记组识别。用于识别成纤维细胞的蛋白质标记物是二叶素域受体2（DDR2）、纤维素、维他丁、胶原蛋白I和III，以及Thy1 15、16、17、18、19、20。^{15,16,17,18,19,20}维门汀已用于识别未受伤的静止心脏成纤维细胞，成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences