Изоляция и характеристика взрослых сердечных фибробластов и миофибробластов

Резюме

Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение для изучения их роли в восстановлении ран и фиброза. Описанный здесь подробный метод для изоляции фибробластов и миофибробластов от невредимых и поврежденных сердцах мыши с последующей характеристикой их чистоты и функциональности с помощью иммунофлюоресценции, RTPCR, флуоресценции при содействии сортировки клеток, и коллагеновый гель сжатия.

Аннотация

Сердечный фиброз в ответ на травму является физиологической реакцией на заживление ран. Были предприняты усилия по изучению и целевой фибробластных подтипов, которые смягчают фиброз. Тем не менее, фибробластисследования исследования были затруднены из-за отсутствия универсально приемлемых фибробластных маркеров для выявления тихих, а также активированных фибробластов. Фибробласты являются гетерогенной популяцией клеток, что затрудняет их изоляцию и характеристику. Представленный протокол описывает три различных метода обогащения фибробластов и миофибробластов от невредимых и травмированных мышей сердца. Использование стандартного и надежного протокола для изоляции фибробластов позволит изучить их роли в гомеостазе, а также модуляцию фиброза.

Введение

Сердечные фибробласты, клетки мезенхимального происхождения, играют значительную роль в поддержании электрической проводимости и механических сил в сердце в дополнение к поддержанию сердечной архитектуры во время гомеостаза¹. После травмы, эти клетки активируются, расширяются и производят внеклеточные матрицы (ECM) белки². Многие доклинические исследования показали фибробластов в качестве критических клеточных регуляторов, которые поддерживают структурную целостность поврежденного сердца^3, а также основные клетки-эффекторы, ответственные за бесконтрольное производство и осаждение белков ECM, что приводит к жесткому образованию рубцов и^{сердечной недостаточности 4}. Фибробласты являются неоднородной группой клеток, что затрудняет вскрытие их репаративной функции от профиброзных неадаптивных свойств. Недавно была определена функциональная неоднородность двух различных подтипов фибробластов после травмы миокарда, что указывает на возможность изоляции различных подтипов фибробластов и изучения их роли в заживлении ран^5.

Получение чистой популяции фибробластов имеет решающее значение в делении их функциональной роли в ремонте и фиброзе. Тем не менее, наличие нескольких фибробластных маркеров, которые признают другие типы клеток, делает его сложным, чтобы изолировать существенно чистую популяцию фибробластов⁶. Несколько элегантных исследований разработали умные способы изолировать сердечные фибробласты от невредимых и травмированных миокарда. Наиболее популярным и устоявшимся методом обогащения фибробластов является селективная адгезия после ферментативного пищеварения^7.

Кроме того, флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) фибробластов на основе поверхностных антигенов клеток была успешно описана⁸. В исследовании, после ферментативного пищеварения, мезенхимальные клетки были отсортированы как линейные-отрицательные (Lin: Ter119^-CD45^-CD31⁾и gp38-положительный (gp38⁾от сердца мыши. Gp38^+ve клетки были подтверждены фибробласты на основе их совместного выражения col1 "1 и других мезенхимальных маркеров. Хотя большинство переваривания тканей завершена после вскрытия желудочка в чашке Петри, недавнее исследование исследовало использование прямого фермента иглы перфузии левого желудочка, чтобы изолировать миоциты и не миоциты, которые включают фибробласты⁹. Фибробласты были затем изолированы селективной сливки в этом случае.

Этот протокол описывает изоляцию и обогащение фибробластов тремя методами. Первый метод, включающий селективное сливование фибробластов после ферментативного пищеварения. Второй метод используется в первую очередь изолировать травмы индуцированной альфа-гладкой мышцы, выражающие myofibroblasts. Третий метод включает в себя последовательное, магнитное истощение фермент-переваренной сердечной суспензии гематопогетических и эндотелиальных клеток. После истощения фибробласты/миофибробласты выделены на основе присутствия антигена MEFSK4 с использованием магнитных бусинок. Недавно MEFSK4 был описан как антиген, присутствующий на тихих, а также активированных фибробластов, что делает его подходящим маркером для идентификации и изоляции фибробластов. Естественно, все описанные здесь методы имеют уникальные ограничения. Поэтому настоятельно рекомендуется проверить чистоту изолированной популяции клеток с помощью анализа потока, иммуноанализа и полуколичественного ПЦР в реальном времени. Тем не менее, эти методологии могут быть расширены, и дополнительные маркеры могут быть добавлены для того, чтобы исключить другие загрязняющие популяции до использования фибробластов и миофибробластных популяций для важнейших экспериментов.

протокол

Это исследование строго соответствует рекомендациям, содеяняёмым в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Комитет по институциональному уходу и использованию животных Университета Вандербильта утвердил протокол (протокольный номер: M1600076-01).

1. Рассечение сердца

1. Подготовка решения
   1. Буфер KHB
      1. Используя перемешивание бар, медленно растворить 9,4 г Krebs-Henseleit буфера (KHB) порошок в 900 мл воды DDI.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер будет осаждать, если перемешивают слишком быстро или слишком долго. Буфер KHB должен быть холодным во время изоляции фибробластов.
      2. Добавьте 2,9 мМ CaCl₂ и 24 mM NaHCO₃. Отрегулируйте рН до 7,2-7,3 и разбавьте до объема 1 л с dH₂O.
      3. Используя стерильный фильтр (0,22 мкм), храните при 4 градусах По Цельсию до 4 недель. Держите на льду или при 4 градусах По Цельсия в течение длительности изоляции.
   2. Коктейль для пищеварения коллагенеза
      1. Приготовьте коктейль для пищеварения в день фибробластной изоляции. Определить соответствующий объем пищеварения коктейль в зависимости от количества сердец; 5 мл коктейля на 1 сердце.
      2. Приготовьте смесь коллагеназа (см. Таблица материалов)и DNase I в соответствии с инструкциями производителя.
      3. Для 20 мл всего коктейля пищеварения добавьте 17,5 л DNase I, 180 л 1 M HEPES и 500 л коллагеназы к пустой конической трубке 50 мл.
      4. Добавьте достаточный объем раствора сбалансированной соли Хэнка (HBSS) с Ca^{2 и} Mg^2,5, чтобы получить общий объем 20 мл.
   3. Резерв лизации красных кровяных телец (РБК)
      1. Определить общий объем, необходимый на основе количества сердец (5 мл/сердце). Разбавить 10x РБК лисис овый буфер до 1x с помощью dH₂O.
   4. Фибробласт СМИ: 10% FBS в DMEM F-12
      1. Добавьте 10% FBS в DMEM-F12 с L-глютамином и HEPES. Добавьте 10 U/mL пенициллина/стрептомицина, 2,5 мкг/мл противогрибковых, и 2,5 мкг/мл микоплазмы профилактика (см. Таблица материалов). Хранить при 4 градусах по Цельсию.
2. Вскрытие сердца
   1. Подготовьте 6 хорошо пластины на льду с 2 мл холодного KHB в колодец для хранения сердца во время вскрытия. Используйте автоматические хирургические ножницы и щипцы.
   2. Эвтаназия мышей в возрасте 12 недель и старше от передозировки изофлуран, и следовать с вывихом шейки матки.
   3. Кроме того, для активированной фибробластной изоляции, индуцировать инфаркт миокарда у 12 недельных мышей путем перевязки коронарной артерии¹⁰. Эвтаназия мышей 8-10 дней после травмы.
   4. Спрей тела с 70% этанола и ориентироваться так брюшной стороне сталкивается с экспериментатором. Прикрепите или ограничиваем придатки для предотвращения помех.
   5. Вырезать брюшной кожи и мышцы открыты, но избежать пирсинга печени. Вырезать вертикально к грудине, и осторожно открыть грудную клетку, избегая пирсинга сердца. Продолжайте прорезать грудную клетку, чтобы разоблачить сердце.
   6. Используя щипкания, аккуратно поднимите сердце из груди, отрезав любые легкие или излишки ткани, прикрепленные к внешней стороне сердца. Снимите желудочек и поместите в один колодец 6 хорошо пластины с холодной KHB. Продолжайте вскрывать сердца таким образом, пока все образцы не будут выделены.
3. Энзиматная диссоциация сердца
   1. Используя щипчи, неоднократно сжимайте и агитируют сердце в КХБ, чтобы удалить избыток крови. Перенесите сердце в чистую стерильную¹⁰ см 2 пластины. Используя одно краевое лезвие, быстро фарш сердца на мелкие кусочки.
   2. Добавьте 1 мл коктейля для пищеварения коллагеназа и продолжайте измельчать до тех пор, пока кусочки не будут достаточно малы, чтобы передать с помощью микропипетта мощностью 1 мл. Перенесите части в коническую трубку 50 мл с микропипетом 1 мл. Вымойте тарелку 2x с 2 мл коктейля с пищеварением коллагенеза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрезка часть пипетки отзыв может помочь собрать большие куски сердца, которые в противном случае могут застрять в кончике пипетки.
   3. Инкубировать коническую трубку при 37 градусах По Цельсию в течение 30 минут с раскачиванием или возбуждением. Безопасная трубка по мере необходимости. Отрежь 10x с трубкой 5 мл до тех пор, пока содержимое не станет однородным, и инкубируйте коническую трубку при 37 градусах По Цельсию в течение 15 минут с вращением или возбуждением.
   4. Отдохните 10x с трубой 10 мл до однородной. Премьер 40 мкм ячейки ситечко путем смачивания фильтра с 1-2 мл буфера KHB на вершине новой 50 мл конической трубки. Добавьте 25 мл буфера KHB в суспензию пищеварения, отдохните и профильтруйте через загрунтованный ситечко 40 мкм. Изменение фильтра по мере необходимости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как фильтрация замедляется, слегка нажав трубки или с помощью 1 мл микропайпет, чтобы сделать подвеску из нижней части фильтра может помочь подвески клетки пройти через частично заблокирован 40 мкм ячейки ситечко.
   5. Центрифуга при 400 х г и 4 кв 10 мин. Удалите супернатант и отдохните гранулу в 1x буфере лиза РБК (5 мл/сердце). Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
   6. Центрифуга при 400 х г и RT в течение 10 мин. Удалить супернатант затем промыть, переопродлив гранулы в 1 мл буфера KHB.
   7. Добавьте 9 мл буфера KHB и процедите через загрунтованный 40 мкм-ситечко в новую коническую трубку 50 мл. Центрифуга при 400 х г и RT в течение 10 мин.
   8. Удалите супернатант, повторно в 1 мл фибробластных носителей или PBS, и определить номер ячейки. Фибробласты могут быть изолированы тремя различными методами, описанными ниже.

2. Изоляция фибробластов от одноклеточной подвески

1. Изоляция фибробластов: дифференциальное покрытие(рисунок 1)
   1. Подготовка 6-колодцов пластины, добавив 2 мл фибробластных носителей в скважину и закрученного пластины для покрытия нижней части скважины.
   2. Resuspend клетки в 1 мл средств массовой информации на сердце. Плита 1 мл клеточной подвески в хорошо, что одно сердце (теоретически) в настоящее время покрытием в скважине. Например, шесть сердец будут вновь в 6 мл носителей, а затем покрыны в шесть скважин с 1 мл клеточной подвески на скважину.
   3. Вихревая пластина равномерно распределяет клетки. Добавьте дополнительные 1-2 мл носителя на скважину при общем объеме до 5 мл на скважину и инкубировать при 37 градусах По цельсии на 4 ч.
   4. Фибробласты будут разделены селективной сливкой после 4 ч. Удалить неприкрепленные и мертвые клетки путем удаления носителей. Вымойте прикрепленные клетки с 2 мл PBS и добавить 2-4 мл стерильных фибробластных носителей в скважине. Инкубировать при 37 градусах Цельсия до слияния. Меняйте носители каждые 2–4 дня.
2. Фибробласт изоляции: FACS с помощью модели мыши репортер GFP (Рисунок 1)
   1. Буфер FACS
      1. Подготовка 15 мл 5% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в dPBS без Ca^{2 "и} Mg^2". Хранить на льду или при 4 градусах Цельсия.
   2. Решение блокировщика FC
      1. Приготовьте блокировщик FC 0,5 л (очищенный антимык CD16/CD32) в 25 Л. FACS (1:50 разбавления). Для одного образца требуется 25 Зл блокаторного раствора FC. Хранить на льду или при 4 градусах По Цельсию.
   3. Подготовка образцов и окрашивание антител
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавления антител могут быть подготовлены заранее, но это может привести к воздействию света или температуры.
      1. Подготовка 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510, что в 2 разбавления в буфере FACS. Смотрите таблицу 1 для антител и разбавлений.
      2. Resuspend 500,000 свежеизолеваемых клеток в 25 Зл блокатор решение для предотвращения неспецифических связывания региона антитела ФК к рецептору FC. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
      3. Добавьте 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 антитела к окончательному объему 25 Зл клеточной подвески. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
      4. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
      5. Повторное удаление гранул в рекомендуемом цитометрии потока объем образца faCS буфера (300 л) и передачи в поток цитометрии трубки.
   4. Fluorescence-активированная сортировка клеток (FACS)
      ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-ЗСМА репортер мышей были вклад д-р Иво Kalajzic¹¹. Эта мышь выражает GFP под альфа-гладкой мышечной клетки (ЗСМА) промоутер. ЗСМА используется в качестве маркера активированных фибробластов (миофибробластов)¹².
      1. При активированной фибробласте (ЗСМА, выражающей миофибробластную) изоляцию, индуцируйте инфаркт миокарда у 12-недельных мышей ГФП-ЗСМА с помощью вывязки коронарных артерий. Пожертвуйте мышам8-10 дней после травмы.
      2. После одноклеточной подвески из поврежденных мышей сердца, сортировать фибробласты SMA^Зве для зеленого флуоресцентного белка (GFP). Используйте неокрашенные неповрежденные фибробласты для установки фонового сигнала в канале GFP после компенсации.
      3. Ворота для живых клеток GFP^ve, gating для 7AAD-ve /GFP^циве клетки или Ghost красителя фиолетовый 510^-ve/GFP^ве клетки и сортировать GFP, выражающие зСМА^зве myofibroblasts.^-ve Сбор клеток в фибробластных носителях.
3. Фибробластизоляция: изоляция фибробластов на основе магнитного биса(рисунок 1)
   1. Буфер равновесия
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда готовьте свежий буфер для изоляции.
      1. Подготовка 0,5% BSA и 2 мМ EDTA в PBS. Дега буфер, перемешивая раствор при присоединении вакуума к крышке контейнера.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешивание удаляет избыток газа из раствора, который затем удаляется через вакуум, так что пузырьки не будут засорять колонку разделения при использовании.
   2. Магнитная маркировка: CD45 - гематопоитические клетки⁺
      1. Центрифуга изолированных клеток из сердца мышей на 500 х г в течение 5 мин, а затем удалить супернатант.
      2. Отрежь пеллетклетки в 1 мл буфера равновесия. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
      3. Centrifuge подвески ячейки, как указано выше, и resuspend клеточной гранулы в 90 мл очного буфера на 1 х 10⁷ общих ячеек. Добавьте 10 qL CD45^и магнитных шариков на 1 х 10⁷ общих ячеек. Хорошо перемешайте и инкубировать не менее 15 мин при 4 градусах Цельсия.
      4. Вымойте клетки, добавив 2 мл буфера равновесия на 1 х 10⁷ общих ячеек, затем центрифуги на 500 х г в течение 10 минут при 4 "C.
      5. Удалить супернатант, рассчитывать клетки с помощью гемоцитометра и повторно до 1 х 10⁷ всего ячеек в 2 мл буфера равновесия. Если более 10⁷ ячеек присутствуют, масштаб буферливо. Пройдите клетки через фильтр 40 мкм, чтобы предотвратить скопление клеток от засорения матрицы столбца разделения.
   3. Магнитное разделение: CD45 - гематопоитические клетки⁺
      1. Поместите колонку разделения в магнитное поле подходящего сепаратора и уравновештинную колонку с не менее 3 мл PBS.
      2. Соберите немаркированные ячейки в проточном потоке (FT) и вымойте столбец 3x с 3 мл буфера равновесия. Сбор смается с FT. Удалите столбец из сепаратора. Поместите колонну на коническую трубку 15 мл.
      3. Промыть магнитно помечены CD45^и клетки путем pipetting 5 мл буфера равновесия на колонку и твердо погружая клетки с поршенем поставляется с колонкой.
      4. Centrifuge eluent, а также FT / мыть фракции на 500 х г. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
   4. Магнитная маркировка и разделение: CD31^- эндотелиальные клетки
      1. Повторите протокол для CD45^- магнитной маркировки и разделения (разделы 2.3.2-2.3.3), за исключением использования CD31^и магнитных бусин оки для инкубации с FT и мытьчасти части от изоляции CD45.⁺
   5. Магнитная маркировка и разделение: MEFSK4^- фибробласты
      1. Повторите протокол для CD45^- магнитной маркировки с помощью антифидер-APC антитела MEFSK4 вместо магнитных бусинок. Centrifuge FT и мыть части из CD31^{изоляции} на 500 г в течение 5 минут, а затем удалить супернатант. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл буфера равновесия и подсчитайте клетки с помощью гемоситометра.
      2. Добавьте 10 зл и л антифидер-APC MEFSK4 на 1 х 10⁷ клеток. Инкубировать не менее 15 мин при 4 градусах Цельсия.
      3. Вымойте MEFSK4 связанные клетки антител, добавив 5 мл буфера равновесия на 1 х 10^{7 общих} ячеек, затем центрифуги на 500 х г в течение 5 мин.
      4. Удалить супернатант и повторно в анти-APC бусы, используя тот же объем MEFSK4 анти-feeder-APC антитела используются. Инкубировать на льду в течение 15 мин при 4 градусах По Цельсию.
      5. Центрифуга при 500 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант, resuspend в 2 мл буфера равновесия на 1 х 10⁷ общих ячеек, и приступить к магнитному разделению, как описано ранее (раздел 2.3.3). Магнитно разделенные MEFSK4^qve/ CD45^-ve/CD31^-ve фибробласты могут быть использованы для анализа чистоты и других приложений вниз по течению.

3. Анализ чистоты и функциональности изолированного населения Фибробласта

1. Анализ чистоты популяции FACS: анализ клеток SMA-GFP(рисунок 2)
   1. Resuspend свежеизолированных клеток в 25 Зл блокаторного раствора Fc для предотвращения неспецифических связывания антител. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
   2. Дополнительно: добавьте 25 зл 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 к суспензии клеток. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
   3. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
   4. Повторное удаление гранул в 50 злбуферах FACS. Добавьте CD31-PE, CD45-APC и антитела AN2/NG2 непосредственно к клеточной подвеске. Инкубировать в течение 15 мин на льду(таблица 1).
   5. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл FACS буфера. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
   6. Добавить осла анти-крысы AlexaFluor 405 вторичного антитела к клеткам помечены неконъюгированных первичных антител. Инкубировать 30 мин на льду.
   7. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
   8. Resuspend гранулы в рекомендуемом потоке цитометрии образец объем буфера FACS (300 л) и передачи на помечены поток цитометрии трубки для анализа потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ FACS для характеристики выражения антигена MEFSK4 на изолированных фибробластах описан в разделе 3.3.
2. Анализ чистоты фибробластов: иммунофлуоресценция(рисунок 3A)
   1. Семена 30000 первичных фибробластов (P0-P1) в хорошо на крышки помещены в 24 хорошо пластины и культуры до 80% слияния. Или концентрируйте⁺ отсортированные клетки CD45 и CD31⁺ (30 000 клеток на скважину) на крышке цитоспином при 400 х х г (метод, используемый для вешнейных клеток непосредственно и равномерно на крышку в 24 скважине пластины).
   2. Исправить клетки с холодным ацетоном в течение 15 мин. Вымойте 3 раза с PBS.
   3. Блок слайдов в 10% козьей сыворотки. Инкубировать слайды с первичными антителами на ночь(Таблица 2).
   4. Вымойте слайды 3x в PBS. Инкубировать вторичные антитела для 2 h(Таблица 2).
   5. Counterstain слайды, и монтировать с одной капли DAPI в медленно угасающих монтажных носителей.
3. Анализ чистоты популяции FACS: MEFSK4 зондирование(Рисунок 3B)
   1. Resuspend свежеизолированных клеток в 25 Л FC блокатор решение для предотвращения неспецифических связывания антител. Инкубировать в течение 5 мин на RT.
   2. Дополнительно: добавьте 25 зл 7AAD или Ghost красителя фиолетовый 510 к суспензии клеток. Инкубировать в течение 30-60 минут на льду в темноте.
   3. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин.
   4. Повторное удаление гранул в 50 злбуферах FACS. Добавьте антитела MEFSK4 непосредственно в суспензию клеток. Инкубировать в течение 15 мин на льду (таблица 1).
   5. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
   6. Добавить крысу IgG-APC в клетки(Таблица 1). Инкубировать 30 мин на льду.
   7. Вымойте, повторно приостановив в 1 мл буфера FACS. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин.
   8. Resuspend гранулы в рекомендуемом потоке цитометрии образец объем буфера FACS (300 л) и передачи в поток цитометрии трубки для анализа потока.
4. Анализ чистоты Фибробласта: полуколичественный rtPCR в реальном времени(рисунок 3C)
   1. Изоляция РНК и полуколичественные ПЦР в реальном времени
   2. После обогащения фибробластов изолировать РНК с помощью комплекта изоляции РНК (см. Таблица материалов). Следуйте инструкциям производителя.
   3. Завершите синтез первой нити ДНК с помощью набора синтеза кДНА (см. Таблица материалов),следуя инструкциям производителя.
   4. Выполняйте полуколичественные ПЦР в реальном времени^.
5. Анализ функциональности Фибробласта: анализ контрактности коллагенового геля(рисунок 4)
   1. Коллагена раствор
      1. Подготовка 20 мМ HEPES и 44 мМ NaHCO₃ в DMEM. Добавьте 1,67 мг крысиного коллагена типа 1 на 1 мл DMEM с HEPES и NaHCO₃.
   2. TGF-дополненный DMEM
      1. Подготовка 10% FBS в DMEM дополненантибиотики и противогрибковые. Добавьте TGF к окончательной концентрации 1 нг/мл.
   3. Клеточная/коллагеновая смесь и покрытие
      1. Подготовьте суспензию клетки (P3-P5) и определите необходимый объем для получения 3,3 х 10⁵ ячеек.
      2. Добавьте объем подвески с 3,3 х 10⁵ клетками, чтобы достаточно растворколлагена, чтобы получить 1 мл общего объема.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Крысиный коллаген типа 1 концентрация должна теперь быть 1,5 мг/мл.
      3. В 48 хорошо пластины, семена 300 л клеточного коллагена смесь в хорошо (1 х 10⁵ клеток / хорошо). Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15-20 мин до гелеобразного.
      4. Используйте иглу 30 G, чтобы помочь отделить гель от стенок колодца. Добавьте 600 л TGF и FBS, дополненные DMEM к каждой скважине. Изображения на светоотражающем сканере на 24 ч и 48 ч.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты иммунофлуоресценции были проведены на цитометрии потока машина оснащена тремя лазерами (405 нм, 488 нм, и 640 нм). Данные были приобретены с помощью программного обеспечения для получения данных потока(Таблица материалов). Дальнейший анализ данных был проведен с использованием программного обеспечения для анализа данных потока. AlexaFluor 405 и Ghost Dye Violet 510 были взволнованы 405-нм лазером и собраны с помощью фильтра 450/50 BP и 525/50 BP, соответственно. GFP и PE были взволнованы 488 нм лазером и собраны с помощью фильтров 530/30 BP и 575/26 BP, соответственно. Либо APC или AlexaFluor 647 был взволнован 640 нм лазером и собран с помощью фильтра 670/14 BP. Все эксперименты по сортировке клеток проводились на цитометрии-машине потока(Таблица материалов),оснащенной четырьмя лазерами (405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм). 7-AAD был взволнован с помощью 561 нм лазера и собраны с 670/14 BP фильтра. GFP и Ghost Dye Violet 510 были собраны с использованием тех же комбинаций лазера/фильтра, которые описаны выше. Все эксперименты по сортировке использовали сопло 100 мкм с конфигурацией давления 17 psi для повышения жизнеспособности целевых ячеек.

Результаты

Схема flow gating, демонстрирующая изоляцию миофибробластов с помощью мышей-репортеров ЗСМА-ГФП
Неповрежденные сердца не показали никаких обнаруживаемых GFP^и клеток в модели мыши репортера SMA-GFP; следовательно, они были использованы для создания ворот для фонового сигнала к?...

Обсуждение

Фибробласты представляют собой неоднородную группу клеток, идентифицированную разнообразным набором маркеров. Белковые маркеры, которые были использованы для идентификации фибробластов являются рецептор домена дискоидин 2 (DDR2), фибронектин, виментин, коллаген I и III, и Thy1¹⁵

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences