Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Resumen

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Resumen

La fibrosis cardíaca en respuesta a una lesión es una respuesta fisiológica a la cicatrización de heridas. Se han hecho esfuerzos para estudiar y atacar los subtipos de fibroblastos que mitigan la fibrosis. Sin embargo, la investigación de fibroblastos se ha visto obstaculizada debido a la falta de marcadores de fibroblastos universalmente aceptables para identificar fibroblastos en reposo y activados. Los fibroblastos son una población de células heterogéneas, lo que dificulta su aislamiento y caracterización. El protocolo presentado describe tres métodos diferentes para enriquecer los fibroblastos y los miofibroblastos de los corazones de ratón no lesionados y heridos. El uso de un protocolo estándar y fiable para aislar los fibroblastos permitirá el estudio de sus funciones en la homeostasis, así como la modulación de la fibrosis.

Introducción

Los fibroblastos cardíacos, células de origen mesenquimal, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la conducción eléctrica y las fuerzas mecánicas en el corazón, además del mantenimiento de la arquitectura cardíaca durante la homeostasis^1. Después de la lesión, estas células se activan, se expanden y producen proteínas de matriz extracelular (ECM)². Muchos estudios preclínicos han revelado fibroblastos como reguladores celulares críticos que mantienen la integridad estructural de un corazón lesionado^3, así como las principales células efectoras responsables de la producción y deposición sin control de proteínas ECM, lo que resulta en la formación de cicatrices rígidas y la insuficiencia cardíaca⁴. Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, lo que hace difícil diseccionar su función reparadora de las propiedades de la maladaptiveificación profibrosca. Recientemente, se ha definido la heterogeneidad funcional de dos subtipos de fibroblastos distintos después de una lesión miocárdica, lo que indica la posibilidad de aislar diferentes subtipos de fibroblastos y estudiar su papel en la cicatrización de heridas⁵.

La obtención de una población de fibroblastos puros es crucial para delinear su papel funcional en la reparación y la fibrosis. Sin embargo, la presencia de múltiples marcadores de fibroblastos que reconocen otros tipos de células hacen que sea difícil aislar a una población de fibroblastos sustancialmente pura^6. Varios estudios elegantes han ideado formas inteligentes de aislar fibroblastos cardíacos de miocardio no lesionado y lesionado. El método más popular y bien establecido de fibroblastos enriquecedores es a través de la adhesión selectiva después de la digestión del tejido enzimático⁷.

Además, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de fibroblastos a base de antígenos de superficie celular se ha descrito con éxito⁸. En el estudio, después de la digestión enzimática, las células mesenquimales se clasificaron como negativos de linaje (Lin: Ter119^-CD45^-CD31⁾y gp38-positivo (gp38⁺) de los corazones del ratón. Se confirmó que las células Gp38^+ve eran fibroblastos en función de su coexpresión de col1-1 y otros marcadores mesenquimales. Aunque la mayoría de la digestión tisular se completa después de disección del ventrículo en una placa de Petri, un estudio reciente ha investigado el uso de una perfusión directa de la enzima aguja del ventrículo izquierdo para aislar los miocitos y los no miocitos que incluyen fibroblastos^9. Los fibroblastos fueron aislados por adhesión selectiva en este caso.

Este protocolo describe el aislamiento y el enriquecimiento de los fibroblastos utilizando tres métodos. El primero es un método ya establecido que implica la adhesión selectiva de fibroblastos después de la digestión enzimática. El segundo método se utiliza para aislar principalmente el músculo liso alfa inducido por lesiones que expresa miofibroblastos. El tercer método consiste en el agotamiento secuencial y magnético de una suspensión celular cardíaca digerida enzimática de células hematopoyéticas y endoteliales. Tras el agotamiento, los fibroblastos/miofibroblastos se aíslan en función de la presencia del antígeno MEFSK4 utilizando perlas magnéticas. Recientemente, MEFSK4 ha sido descrito como un antígeno presente en fibroblastos inactivos y activados, por lo que es un marcador adecuado para la identificación y aislamiento de fibroblastos. Naturalmente, todos los métodos descritos aquí tienen limitaciones únicas. Por lo tanto, es muy recomendable comprobar la pureza de la población celular aislada mediante análisis de flujo, inmunomanchay y PCR semicuantitativo en tiempo real. Sin embargo, estas metodologías se pueden ampliar, y se pueden agregar marcadores adicionales con el fin de excluir otras poblaciones contaminantes antes de utilizar las poblaciones de fibroblastos y miofibroblastos para experimentos cruciales.

Protocolo

Este estudio mantiene estrictamente las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt aprobó el protocolo (número de protocolo: M1600076-01).

1. Disección cardíaca

1. Preparación de la solución
   1. Buffer KHB
      1. Con una barra de agitación, disuelva lentamente 9,4 g de polvo de tampón Krebs-Henseleit (KHB) en 900 ml de agua DDI.
         NOTA: El búfer se precipitará si se agita demasiado rápido o durante demasiado tiempo. El tampón KHB debe estar frío durante el aislamiento de fibroblastos.
      2. Añadir 2,9 mM CaCl₂ y 24 mM NaHCO_3. Ajuste el pH a 7.2–7.3 y diluya a un volumen de 1 L con dH₂O.
      3. Usando un filtro estéril (0,22 m), conservar a 4 oC durante un máximo de 4 semanas. Mantener en hielo o a 4 oC durante el aislamiento.
   2. Cóctel de digestión de colagenasa
      1. Preparar el cóctel de digestión el día del aislamiento de fibroblastos. Determinar el volumen adecuado de cóctel de digestión de acuerdo con el número de corazones; 5 ml de cóctel por 1 corazón.
      2. Preparar la mezcla de colagenasa (ver Tabla de Materiales)y DNase I de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      3. Para 20 ml de cóctel de digestión total, añadir 17,5 ml de DNase I, 180 ml de 1 M HEPES y 500 ml de colagenasa a un tubo cónico vacío de 50 ml.
      4. Agregue un volumen suficiente de la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank con Ca²⁺ y Mg²⁺ para obtener un volumen total de 20 ml.
   3. Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)
      1. Determinar el volumen total necesario en función del número de corazones (5 ml/corazón). Diluir el búfer de stock de lisis RBC 10x a 1x usando dH₂O.
   4. Medios de fibroblastos: 10% FBS en DMEM F-12
      1. Añadir 10% FBS a DMEM-F12 con L-glutamina y HEPES. Añadir 10 U/ml de penicilina/estreptomicina, antifúngica de 2,5 g/ml y 2,5 g/ml de micoplasma profiláctico (ver Tabla de materiales). Conservar a 4oC.
2. Disección cardíaca
   1. Preparar una placa de 6 pozos sobre hielo con 2 ml de KHB frío por pozo para almacenar los corazones en durante la disección. Utilice tijeras quirúrgicas autoclaves y fórceps.
   2. Euthanizar ratones a las 12 semanas de edad o más por sobredosis de isoflurano, y seguir con la luxación cervical.
   3. Alternativamente, para el aislamiento activado de fibroblastos, induzca el infarto de miocardio en ratones de 12 semanas de edad por ligadura de arteria coronaria¹⁰. Eutanasia a los ratones 8-10 días después de una lesión.
   4. Rocíe el cuerpo con 70% de etanol y oriente para que el lado ventral esté orientado hacia el experimentador. Anclar o restringir los apéndices para evitar interferencias.
   5. Corta la piel abdominal y el músculo abierto, pero evita perforar el hígado. Corte verticalmente hacia el esternón, y abra cuidadosamente el tórax evitando perforar el corazón. Continúe cortando a través de la caja torácica para exponer el corazón.
   6. Con fórceps, levante suavemente el corazón del pecho, cortando cualquier pulmón o exceso de tejido unido al exterior del corazón. Retire el ventrículo y colóquelo en un pozo de 6 pocillos con KHB frío. Continúe diseccionando corazones de esta manera hasta que todas las muestras hayan sido aisladas.
3. Disociación enzimática del corazón
   1. Usando fórceps, apriete y agite repetidamente el corazón en KHB para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el corazón a una placa limpia estéril de 10 cm^2. Usando una hoja de un solo borde, pique rápidamente el corazón en trozos pequeños.
   2. Añadir 1 ml de cóctel de digestión de colagenasa y continuar picando hasta que las piezas sean lo suficientemente pequeñas como para transferirlas con una micropipette de 1 ml. Transfiera las piezas a un tubo cónico de 50 ml con un micropipeta de 1 ml. Placa de lavado 2x con 2 ml de cóctel de digestión de colagenasa.
      NOTA: Cortar una parte de la punta de la pipeta puede ayudar a recoger trozos de corazón más grandes que de otro modo podrían quedar atascados en la punta de la pipeta.
   3. Incubar el tubo cónico a 37oC durante 30 min con mecedor o agitación. Asegure el tubo según sea necesario. Resuspender 10x con una pipeta de 5 ml hasta que el contenido sea homogéneo, e incubar el tubo cónico a 37oC durante 15 min con rotación o agitación.
   4. Resuspender 10x con una pipeta de 10 ml hasta que sea homogéneo. Cemusla un colador de células de 40 m humedeciendo el filtro con 1-2 ml de tampón KHB en la parte superior de un nuevo tubo cónico de 50 ml. Agregue 25 ml de tampón KHB a la suspensión de digestión, resuspenda y filtre a través de un colador de células cebado de 40 m. Cambie el filtro según sea necesario.
      NOTA: A medida que la filtración se ralentiza, el tubo de roscado leve o el uso de un micropipeta de 1 ml para extraer la suspensión de la parte inferior del filtro pueden ayudar a que la suspensión celular pase a través de un colador de células parcialmente bloqueado de 40 m.
   5. Centrífuga a 400 x g y 4 oC durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 tampón de lisis RBC (5 ml/corazón). Incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
   6. Centrífuga a 400 x g y RT durante 10 min. Retire el sobrenadante y luego lave resuperando el pellet en 1 ml de tampón KHB.
   7. Agregue 9 ml de tampón KHB y filtre a través del colador de celda saqueador de 40 m en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Centrífuga a 400 x g y RT durante 10 min.
   8. Retire el sobrenadante, resuspenda en 1 ml de medios fibroblastos o PBS, y determine el número de células. Los fibroblastos se pueden aislar mediante los tres métodos diferentes que se describen a continuación.

2. Aislamiento de fibroblastos de la suspensión de una sola célula

1. Aislamiento de fibroblastos: revestimiento diferencial (Figura 1)
   1. Prepare una placa de 6 pocillos añadiendo 2 ml de medios de fibroblastos por poca y girando la placa para cubrir el fondo del pozo.
   2. Resuspender las células en 1 ml de medios por corazón. Placa 1 ml de suspensión celular por pozo tal que un corazón (teóricamente) está siendo chapado por pozo. Por ejemplo, seis corazones serían resuspendidos en 6 ml de medios, luego chapados en seis pozos con 1 ml de suspensión celular por pozo.
   3. Gire la placa para distribuir uniformemente las células. Añadir un medio adicional de 1–2 ml por pozo para un volumen total de hasta 5 ml por pozo, e incubar a 37 oC durante 4 h.
   4. Los fibroblastos se separarán por adhesión selectiva después de 4 h. Eliminar las células no conectadas y muertas mediante la eliminación de medios. Lave las células adheridas con 2 ml de PBS y agregue medios de fibroblastos estériles de 2-4 ml por poca. Incubar a 37oC hasta que confluente. Cambie los medios cada 2-4 días.
2. Aislamiento de fibroblastos: FACS utilizando un modelo de ratón de reportero GFP (Figura 1)
   1. Buffer FACS
      1. Preparar 15 ml de suero bovino fetal 5% (FBS) en dPBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺. Conservar en hielo o a 4oC.
   2. Solución bloqueadora de FC
      1. Preparar el bloqueador de FC de 0,5 l (CD16/CD32 antiratón purificado) en 25 s de FACS (dilución 1:50). Se requieren 25 ml de solución de bloqueador de FC por muestra. Conservar en hielo o a 4oC.
   3. Preparación de muestras y tinción de anticuerpos
      NOTA: Las diluciones de anticuerpos se pueden preparar con antelación, pero esto puede correr el riesgo de exposición a la luz o a la temperatura.
      1. Preparar 7AAD o tinte fantasma violeta 510 que es 2 veces la dilución requerida en tampón FACS. Consulte la Tabla 1 para anticuerpos y diluciones.
      2. Resuspenda 500.000 células recién aisladas en 25 sl de solución de bloqueador fc para evitar la unión inespecífica de la región de anticuerpos FC a un receptor FC. Incubar durante 5 min a RT.
      3. Añadir 7AAD o Ghost dye violeta 510 anticuerpo al volumen final de 25 l de suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
      4. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min a 4oC.
      5. Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado del tampón FACS (300 l) y transfiera al tubo de citometría de flujo.
   4. Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS)
      NOTA: Los ratones reportero de GFP-SMA fueron una contribución del Dr. Ivo Kalajzic¹¹. Este ratón expresa GFP bajo el promotor de la célula muscular alfa suave ( SMA). Se ha utilizado como marcador de fibroblastos activados (miofibroblastos)^12.
      1. Para el aislamiento de fibroblastos activado (SMA que expresa miofibroblasto), inducir el infarto de miocardio en ratones GFP-SMA de 12 semanas de edad por ligadura de arteria coronaria. Sacrificar a los ratones 8-10 días después de la lesión.
      2. Después de la suspensión de una sola célula de los corazones de los ratones lesionados, coterte los fibroblastos de la sma^+ve para la proteína fluorescente verde (GFP). Utilice fibroblastos no lesionados no manchados para establecer la señal de fondo en la post-compensación del canal GFP.
      3. Puerta para células GFP vivas^+ve por gating para 7AAD^-ve/GFP^+ve células o tinte fantasmal violeta 510^-ve/GFP^+ve células y ordenar GFP expresando "SMA^{+ ve} miofibroblastos". Recoger las células en medios fibroblastos.
3. Aislamiento de fibroblastos: aislamiento magnético a base de perlas de fibroblastos (Figura 1)
   1. Búfer de equilibrio
      NOTA: Prepare siempre un búfer nuevo para los aislamientos.
      1. Preparar 0.5% BSA y 2 mM EDTA en PBS. Desgasifique el tampón revolviendo la solución mientras se conecta un vacío a la tapa del recipiente.
         NOTA: La agitación elimina el exceso de gas de la solución que luego se elimina a través del vacío, de forma que las burbujas no obstruyan la columna de separación al usarla.
   2. Etiquetado magnético: CD45⁺ células hematopoyéticas
      1. Centrifugar células aisladas de los corazones de ratones a 500 x g durante 5 min, luego eliminar el sobrenadante.
      2. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de equilibrio. Cuente las células usando un hemocaquímetro.
      3. Centrifugar la suspensión celular como arriba y resuspender el gránulo celular en tampón de equilibrio de 90 l por 1 x 10⁷ células totales. Añadir 10 sL de CD45⁺ perlas magnéticas por 1 x 10⁷ celdas totales. Mezclar bien e incubar durante al menos 15 min a 4oC.
      4. Lave las células agregando un búfer de equilibrio de 2 ml por 1 x 10⁷ células totales, luego centrifugar a 500 x g durante 10 min a 4 oC.
      5. Retire el sobrenadante, cuente las células usando un hemocitómetro y resuspenda hasta 1 x 10⁷ células totales en 2 ml de tampón de equilibrio. Si hay más de 10⁷ celdas, escale el búfer linealmente. Pase las celdas a través de un filtro de 40 m para evitar que las agregaciones de celdas obstruyan la matriz de columnas de separación.
   3. Separación magnética: CD45⁺ células hematopoyéticas
      1. Coloque la columna de separación en el campo magnético de un separador adecuado y equilibre la columna con al menos 3 ml de PBS.
      2. Recoja las células sin etiquetar en el flujo (FT), y lave la columna 3x con 3 mL del buffer del equilibrio. Retire los lavados con FT. Retire la columna del separador. Coloque la columna en un tubo cónico de 15 ml.
      3. Enjuague las células CD45^{+ etiquetadas} magnéticamente pipeteando 5 ml de tampón de equilibrio en la columna y hundiendo firmemente las células con un émbolo suministrado con la columna.
      4. Eluyente de centrífuga, así como fracciones FT/wash a 500 x g. Cuente las células usando un hemocaquímetro.
   4. Etiquetado y separación magnética: CD31⁺ células endoteliales
      1. Protocolo de repetición para CD45⁺ etiquetado magnético y separación (secciones 2.3.2–2.3.3), excepto utilizar CD31⁺ perlas magnéticas para incubar con el FT y lavar porciones del CD45⁺ aislamiento.
   5. Etiquetado y separación magnética: MEFSK4⁺ fibroblastos
      1. Protocolo de repetición para CD45⁺ etiquetado magnético utilizando el anticuerpo antialimentador MEFSK4 en lugar de perlas magnéticas. Centrifugar las porciones FT y Wash del CD31⁺ aislamiento a 500 o g durante 5 min, luego eliminar el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de equilibrio y cuente las células usando un hemocitómetro.
      2. Añadir 10 l de anticuerpo antialimentador-APC MEFSK4 por cada 1 x 10⁷ células. Incubar durante al menos 15 min a 4oC.
      3. Lave las células unidas a anticuerpos MEFSK4 agregando 5 ml de tampón de equilibrio por 1 x 10⁷ células totales, luego centrifugar a 500 x g durante 5 min.
      4. Retire el sobrenadante y resuspende en perlas anti-APC, utilizando el mismo volumen de anticuerpo santi-alimentador-APC MEFSK4 utilizado. Incubar sobre hielo durante 15 min a 4oC.
      5. Centrífuga a 500 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante, resuspenda en 2 ml de tampón de equilibrio por 1 x 10⁷ células totales, y proceda con la separación magnética como se describió anteriormente (sección 2.3.3). Los fibroblastos MEFSK4^+ve/ CD45^-ve/CD31^-ve se pueden utilizar para análisis de pureza y otras aplicaciones posteriores.

3. Análisis de pureza y funcionalidad de la población aislada de fibroblastos

1. Análisis de la pureza de la población facS: análisis de células de La AMA-GFP (Figura 2)
   1. Resuspenda las células recién aisladas en 25 ml de solución bloqueadora de Fc para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Incubar durante 5 min a RT.
   2. Opcional: añadir 25 s l de 7AAD o tinte fantasmal violeta 510 a la suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
   3. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min.
   4. Resuspenda el pellet en 50 l de tampón FACS. Agregue los anticuerpos CD31-PE, CD45-APC y AN2/NG2 directamente a la suspensión celular. Incubar durante 15 minutos sobre hielo (Tabla 1).
   5. Lávese resuponiendo en búfer FACS de 1 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
   6. Añadir burro anti-rata AlexaFluor 405 anticuerpo secundario a las células etiquetadas con anticuerpo primario no conjugado. Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
   7. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
   8. Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado de tampón FACS (300 l) y transfiera a un tubo de citometría de flujo etiquetado para el análisis de flujo.
      NOTA: El análisis FACS para caracterizar la expresión del antígeno MEFSK4 en fibroblastos aislados se describe en la sección 3.3.
2. Análisis de pureza de fibroblastos: inmunofluorescencia(Figura 3A)
   1. Semilla 30,000 fibroblastos primarios (P0-P1) por pozo en cubreobjetos colocados en una placa de 24 pozos y cultivo hasta 80% confluente. O concentrar las células CD45⁺ y CD31⁺ ordenadas (30.000 células por pozo) en un cubreobjetos por citospin a 400 x a g (un método utilizado para depositar las células directa y uniformemente en un cubreobjetos en una placa de 24 pocillos).
   2. Fijar las células con acetona fría durante 15 min. Lavar 3 veces con PBS.
   3. Bloquee los portaobjetos en suero de cabra al 10%. Incubar diapositivas con anticuerpos primarios durante la noche (Tabla 2).
   4. Lave los portaobjetos 3x en PBS. Incubar anticuerpos secundarios durante 2 h(Tabla 2).
   5. Se desliza contramancha y se monta con una gota de DAPI en medios de montaje de difuminado lento.
3. Análisis de pureza de la población FACS: sondeo MEFSK4 (Figura 3B)
   1. Resuspenda las células recién aisladas en 25 ml de solución de bloqueador de FC para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Incubar durante 5 min a RT.
   2. Opcional: añadir 25 s l de 7AAD o tinte fantasmal violeta 510 a la suspensión celular. Incubar durante 30-60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
   3. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 500 x g durante 5 min.
   4. Resuspenda el pellet en 50 l de tampón FACS. Añadir anticuerpos MEFSK4 directamente a la suspensión celular. Incubar durante 15 minutos sobre hielo (Tabla 1).
   5. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
   6. Agregue la rata IgG-APC a las células (Tabla 1). Incubar durante 30 minutos sobre hielo.
   7. Lavar por resustitución en 1 mL de tampón FACS. Centrífuga a 400 x g durante 5 min.
   8. Resuspenda el pellet en el volumen de muestra de citometría de flujo recomendado de tampón FACS (300 l) y transfiera al tubo de citometría de flujo para el análisis de flujo.
4. Análisis de pureza de fibroblastos: rtPCR en tiempo real semicuantitativo(Figura 3C)
   1. Aislamiento de ARN y PCR semicuantitativo en tiempo real
   2. Tras el enriquecimiento de fibroblastos, aísle el ARN utilizando un kit de aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del fabricante.
   3. Complete la síntesis de ADN de la primera cadena utilizando un kit de síntesis de ADNc (ver Tabla de Materiales),siguiendo las instrucciones del fabricante.
   4. Realice PCR⁵semicuantitativo en tiempo real.
5. Análisis de la funcionalidad de fibroblastos: ensayo de contractilidad de gel de colágeno (Figura 4)
   1. Solución de colágeno
      1. Preparar 20 mM HEPES y 44 mM NaHCO₃ en DMEM. Añadir 1,67 mg de colágeno de rata tipo 1 por 1 ml de DMEM con HEPES y NaHCO₃.
   2. DMEM suplementado por TGF
      1. Preparar 10% FBS en DMEM complementado con antibióticos y antifúngicos. Añadir TGF a una concentración final de 1 ng/mL.
   3. Mezcla de células/colágeno y revestimiento
      1. Prepare la suspensión celular (P3-P5) y determine el volumen necesario para obtener 3.3 x 10⁵ células.
      2. Añadir volumen de suspensión con 3,3 x 10⁵ células a suficiente solución de colágeno para obtener 1 ml de volumen total.
         NOTA: La concentración de colágeno de rata tipo 1 ahora debe ser de 1,5 mg/ml.
      3. En una placa de 48 pocillos, semilla de 300 l de mezcla de colágeno celular por poca (1 x 10⁵ células/pozo). Incubar a 37oC durante 15-20 min hasta que se gelifique.
      4. Utilice una aguja de 30 G para ayudar a separar el gel de las paredes del pozo. Añadir 600 l de TGFá y FBS DMEM suplementado a cada pocto. Placas de imagen en un escáner reflectante a 24 h y 48 h.
         NOTA: Todos los experimentos de inmunofluorescencia se realizaron en una máquina de citometría de flujo equipada con tres láseres (405 nm, 488 nm y 640 nm). Los datos se adquirieron utilizando un software de adquisición de datos de flujo(Tabla de materiales). Se realizó un análisis de datos adicional utilizando un software de análisis de datos de flujo. AlexaFluor 405 y Ghost Dye Violet 510 fueron excitados con el láser de 405 nm y recogidos usando un filtro de 450/50 BP y 525/50 BP, respectivamente. GFP y PE fueron excitados por el láser de 488 nm y recogidos utilizando los filtros 530/30 BP y 575/26 BP, respectivamente. APC o AlexaFluor 647 fue excitado por el láser de 640 nm y recogido usando un filtro de 670/14 BP. Todos los experimentos de clasificación celular se realizaron en una máquina de citometría de flujo(Tabla de materiales)equipada con cuatro láseres (405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm). 7-AAD se entusiasmó con el láser de 561 nm y se recogió con un filtro de 670/14 BP. GFP y Ghost Dye Violet 510 fueron recogidos usando las mismas combinaciones láser/filtro como se describió anteriormente. Todos los experimentos de clasificación utilizaron una boquilla de 100 um con una configuración de presión de 17 psi para aumentar la viabilidad aguas abajo de las células de destino.

Resultados

Esquema de medición de flujo que demuestra el aislamiento de miofibroblastos utilizando ratones reportero de la SMA-GFP
Los corazones no lesionados no mostraron células GFP⁺ detectables en el modelo de ratón de reportero de la SMA-GFP; por lo tanto, se utilizaron para establecer una puerta para la señal de fondo de la post-compensación del canal GFP(Figura 2). Las células de la AMA⁺ se clasificaron en función de la presencia de la expresión d...

Discusión

Los fibroblastos son un grupo heterogéneo de células, identificado por un conjunto diverso de marcadores. Los marcadores proteicos que se han utilizado para identificar fibroblastos son el receptor 2 de dominio de discoidina (DDR2), la fibronectina, la vimentina, el colágeno I y III, y El Thy1^{15,,16,17,18,19,20}. Mientras q...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences