Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Özet

Fibroblastların saf bir popülasyon elde yara onarımı ve fibrozis rollerini incelemek için çok önemlidir. Burada açıklanan yaralanmamış ve yaralı fare kalplerinden fibroblastlar ve miyofibroblastlar izole etmek için ayrıntılı bir yöntem immünofloresan, RTPCR, floresan destekli hücre sıralama ve saflık ve işlevsellik karakterizasyonu takip kollajen jel kontraksiyonu.

Özet

Kardiyak fibrozis yaralanmaya yanıt olarak yara iyileşmesi için fizyolojik bir yanıttır. Fibrozisi azaltan fibroblast alt tiplerinin incelenmesi ve hedef altına inme çalışmaları yapılmıştır. Ancak, fibroblast araştırma quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar tanımlamak için evrensel olarak kabul edilebilir fibroblast belirteçleri eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Fibroblastlar heterojen hücre popülasyonuolup, onları izole etmek ve karakterize etmek zordur. Sunulan protokol, yaralanmamış ve yaralanan fare kalplerinden fibroblastve miyofibroblastları zenginleştirmek için üç farklı yöntem tanımlanmaktadır. Fibroblastları izole etmek için standart ve güvenilir bir protokol kullanmak, homeostazdaki rollerinin ve fibrozis modülasyonunun incelenmesini sağlayacaktır.

Giriş

Kardiyak fibroblastlar, mezenkimal kökenli hücreler, homeostaz sırasında kardiyak mimarinin bakımına ek olarak kalpte elektrikiletimi ve mekanik kuvvetlerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır^1. Yaralanmadan sonra, bu hücreler aktive edilir, genişletilir ve ekstrasellüler matriks (ECM) proteinleri^üretir2. Birçok preklinik çalışmalar da yaralı bir kalp yapısal bütünlüğünü korumak kritik hücresel düzenleyiciler olarak fibroblastlar ortaya koymuştur³ yanı sıra kontrolsüz üretim ve ECM proteinlerin birikimisorumlu ana efektör hücreleri, sert yara oluşumu ve kalp yetmezliği ile sonuçlanan⁴. Fibroblastlar heterojen bir hücre grubudur, bu da reparatif fonksiyonlarını pro-fibrotik maladaptif özelliklerden ayırmakiçin zorlayıcı dır. Son zamanlarda, miyokardiyal yaralanma sonrası iki farklı fibroblast alt tipinin fonksiyonel heterojenliği tanımlanmış, farklı fibroblast alt tiplerini izole etme ve yara iyileşmesindeki rollerini inceleme olasılığı^{gösterilmiştir 5}.

Saf fibroblast popülasyonu elde etmek, onarım ve fibrozisteki fonksiyonel rollerini ortaya§ almakta çok önemlidir. Ancak, diğer hücre tiplerini tanıyan birden fazla fibroblast belirteçlerinin varlığı önemli ölçüde saf fibroblast^{popülasyonu 6}izole etmek için zor olun. Çeşitli zarif çalışmalar yaralanmamış ve yaralanmalı miyokardyum kardiyak fibroblastlar izole etmek için akıllı yollar icat var. Fibroblastları zenginleştirmenin en popüler ve köklü yöntemi enzimatik doku sindirimini⁷takiben seçici yapışma yoluyla 7.

Ayrıca, hücre yüzeyi antijenlerine dayalı fibroblastların floresan aktive hücre sıralama (FACS) başarıyla tarif edilmiştir⁸. Çalışmada enzimatik sindirimitaki mezenkimal hücreler fare kalplerinden soy-negatif (Lin: Ter119⁻CD45⁻CD31^{− )}ve gp38-pozitif (gp38⁺) olarak sıralandı. Gp38^+ve hücrelerinin col1α1 ve diğer mezenkimal belirteçlerin ortak ekspresyonuna göre fibroblast olduğu doğrulandı. En doku sindirim petri çanak ventrikül dışarı diseksiyon sonra tamamlanmış olsa da, yeni bir çalışma da miyositler ve fibroblastlar içeren non-miyositizole etmek için sol ventrikül doğrudan iğne enzim perfüzyonu kullanımını araştırdı⁹. Fibroblastlar daha sonra bu durumda selektif yapışma ile izole edildi.

Bu protokol, fibroblastların izolasyonu ve zenginleşmesini üç yöntemle açıklar. İlki enzimatik sindirimi takiben fibroblastların seçici yapışmasını içeren zaten kurulmuş bir yöntemdir. İkinci yöntem öncelikle miyofibroblastları ifade eden yaralanmaya bağlı alfa düz kas izole etmek için kullanılır. Üçüncü yöntem hematopoetik ve endotel hücrelerinin enzim sindirilmiş kardiyak hücre süspansiyonunun sıralı, manyetik olarak tükenmesini içerir. Tükenmeden sonra fibroblastlar/miyofibroblastlar manyetik boncuklar kullanılarak mefsk4 antijeninin varlığına göre izole edilir. Son zamanlarda, MEFSK4 quiescent yanı sıra aktif fibroblastlar üzerinde bir antijen mevcut olarak tarif edilmiştir, fibroblast tanımlama ve izolasyon için uygun bir belirteç yapma. Doğal olarak, burada açıklanan tüm yöntemlerin benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, akış analizi, immünboyama ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR ile izole hücre popülasyonunun saflığını kontrol etmek şiddetle tavsiye edilir. Ancak, bu metodolojiler üzerine genişletilebilir ve önemli deneyler için fibroblast ve miyofibroblast popülasyonları kullanmadan önce diğer kirletici popülasyonları dışlamak için ek belirteçler eklenebilir.

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri kesinlikle onaylar. Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi protokolü onayladı (protokol numarası: M1600076-01).

1. Kalp Diseksiyonu

1. Çözüm hazırlama
   1. KHB arabelleği
      1. Bir karıştırma çubuğu kullanarak, 900 mL DDI suda 900 mL'lik Krebs-Henseleit tampon (KHB) tozunu yavaşça çözün.
         NOT: Tampon çok hızlı veya çok uzun süre karıştırılırsa çökelecektir. Fibroblast izolasyonu sırasında KHB tamponu soğuk olmalıdır.
      2. 2,9 mM CaCl₂ ve 24 mM NaHCO₃ekleyin. pH'ı 7.2-7.3'e ayarlayın ve dH₂O ile 1 L'lik bir hacme seyreltin.
      3. Steril filtre (0,22 μm) kullanarak 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın. İzolasyon süresi boyunca buzda veya 4 °C'de tutun.
   2. Kollajenaz sindirim kokteyli
      1. Fibroblast izolasyon u yuzden sindirim kokteyli hazırlayın. Kalp sayısına göre sindirim kokteylinin uygun hacmini belirleyin; 1 kalp başına 5 mL kokteyl.
      2. Üreticinin talimatlarına göre kollajenaz karışımı (Malzeme Tablosuna bakın) ve DNase I hazırlayın.
      3. Toplam sindirim kokteylinin 20 mL'si için 17,5 μL DNase I, 180 μL 1 M HEPES ve 500 μL kollajenaz ekleyin.
      4. 20 mL toplam hacim elde etmek için Ca²⁺ ve Mg²⁺ ile Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS) için yeterli hacim ekleyin.
   3. Kırmızı kan hücresi (RBC) lysis tampon
      1. Kalp sayısına (5 mL/kalp) göre gereken toplam hacmi belirleyin. DH₂O kullanarak 10x RBC lysis stok tampon1x seyreltin.
   4. Fibroblast ortam: DMEM F-12'de %10 FBS
      1. L-glutamin ve HEPES ile DMEM-F12'ye %10 FBS ekleyin. 10 U/mL penisilin/streptomisin, 2,5 g/mL anti-mantar ve 2,5 g/mL mikoplazma profilaktik ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 4 °C'de saklayın.
2. Kalp diseksiyonu
   1. Diseksiyon sırasında kalpleri depolamak için her kuyuda 2 mL soğuk KHB ile buz üzerinde 6 kuyuluk bir plaka hazırlayın. Otoklavlı cerrahi makas ve forceps yararlanın.
   2. 12 haftalık veya daha büyük dozlarda izofluran aşırı dozda fareleri ötenazi ve servikal çıkış ile takip edin.
   3. Alternatif olarak, aktive fibroblast izolasyonu için, koroner arter ligasyonu¹⁰ile 12 haftalık farelerde miyokard infarktüsü indüklemek. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra ötenazi.
   4. % 70 etanol ve orient ile sprey vücut böylece ventral tarafı deneyci karşı karşıya. Paraziti önlemek için uzantıları sabitleyin veya dizginleyin.
   5. Karın deri ve kas açık kesin ama karaciğer piercing kaçının. Göğüs kafesini dikey olarak kesin ve kalbin delinmesini önlerken göğüs kafesini dikkatlice açın. Kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesmeye devam et.
   6. Forseps kullanarak, yavaşça göğüs kalbini kaldırın, herhangi bir akciğer veya kalp dışında bağlı aşırı doku keserek. Ventrikül çıkarın ve soğuk KHB ile 6 iyi plaka bir kuyuya yerleştirin. Tüm örnekler izole edilene kadar kalpleri bu şekilde kesmeye devam edin.
3. Kalbin enzimatik dissosiyasyonu
   1. Forceps kullanarak, art arda sıkmak ve fazla kan kaldırmak için KHB kalp ajite. Kalbi temiz bir steril 10 cm² tabağa aktarın. Tek bir kenar bıçak kullanarak, hızlı bir şekilde küçük parçalar halinde kalp kıyma.
   2. Kollajenaz sindirim kokteyli 1 mL ekleyin ve parçalar 1 mL mikropipet ile aktarmak için yeterince küçük olana kadar kıyma devam edin. Parçaları 1 mL mikropipetli 50 mL konik boruya aktarın. 2 mL kollajenaz sindirim kokteyli ile yıkama plakası 2x.
      NOT: Pipet ucunun bir kısmının kesilmesi, pipet ucuna yapışabilecek daha büyük kalp parçalarının toplanmasına yardımcı olabilir.
   3. 37 °C'de 30 dk sallayarak veya ajitasyon ile kuluçka konik tüp. Gerektiği gibi güvenli tüp. İçeriği homojen olana kadar 5 mL pipetle 10x'i yeniden askıya alın ve konik tüpü 37 °C'de 15 dakika boyunca döndürme veya ajitasyon ile kuluçkaya yatırın.
   4. Homojen olana kadar 10 mL pipet ile 10x'i yeniden askıya alın. Filtreyi 1-2 mL KHB tamponu ile ıslatarak 40 μm'lik bir hücre süzgecini yeni bir 50 mL konik tüpün üzerine uygulayın. Sindirim süspansiyonu için 25 mL KHB tampon ekleyin, yeniden askıya alın ve astarlanmış 40 μm hücresüzden süzün. Gerektiğinde filtreyi değiştirin.
      NOT: Filtrasyon yavaşladıkça, tüpü hafifçe dokunarak veya filtrenin alt tarafından süspansiyon çekmek için 1 mL mikropipet kullanmak hücre süspansiyonunun kısmen tıkanmış 40 μm hücreli bir süzgeçten geçmesine yardımcı olabilir.
   5. 10 dk. 400 x g ve 4 °C'de santrifüj. Oda sıcaklığında 2 dakika (RT) kuluçka.
   6. 10 dk. 400 x g ve RT'de santrifüj 10 dk. Supernatant'ı çıkarın ve 1 mL KHB tamponunda peleti yeniden sulayarak yıkayın.
   7. Yeni 50 mL konik tüp içine astarlı 40 μm hücresüz ile KHB tampon 9 mL ekleyin ve filtre. Santrifüj 400 x g ve RT 10 dakika.
   8. Supernatant çıkarın, fibroblast media veya PBS 1 mL resuspend, ve hücre numarasını belirlemek. Fibroblastlar aşağıda açıklanan üç farklı yöntemle izole edilebilir.

2. Fibroblastların Tek Hücreli Süspansiyondan İzolasyon

1. Fibroblast izolasyonu: diferansiyel kaplama (Şekil 1)
   1. Kuyu başına 2 mL fibroblast media ekleyerek ve iyi alt kapsayacak şekilde plaka girdap 6-iyi bir plaka hazırlayın.
   2. Kalp başına 1 mL'lik ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın. Plaka 1 mL hücre süspansiyon u olabilir ki bir kalp (teorik olarak) iyi başına kaplanmış ediliyor. Örneğin, 6 mL'lik ortamda altı kalp yeniden askıya alınır, ardından kuyu başına 1 mL hücre süspansiyonu ile altı kuyuya kaplanır.
   3. Hücreleri eşit olarak dağıtmak için girdap plakası. Kuyu başına 5 mL'ye kadar toplam hacim için kuyu başına 1-2 mL ek bir ortam ekleyin ve 37 °C'de 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   4. Fibroblastlar 4 saat sonra seçici yapışma ile ayrılacak. Ekli hücreleri 2 mL PBS ile yıkayın ve kuyu başına 2-4 mL steril fibroblast media ekleyin. 37 °C'de inküler. Her 2-4 günde bir ortam değiştirin.
2. Fibroblast İzolasyon: GFP muhabiri fare modeli kullanılarak FACS (Şekil 1)
   1. FACS arabelleği
      1. Ca²⁺ ve Mg²⁺olmadan dPBS'de %5 fetal sığır serumunun (FBS) 15 mL'sini hazırlayın. Buzda veya 4°C'de saklayın.
   2. FC bloker çözümü
      1. 0,5 μL FC bloker (saflaştırılmış anti-fare CD16/CD32) 25 μL FACS (1:50 seyreltme) hazırlayın. Numune başına 25 μL FC bloker çözeltisi gereklidir. Buzda veya 4 °C'de saklayabilirsiniz.
   3. Numune hazırlama ve antikor boyama
      NOT: Antikor seyreltmeleri önceden hazırlanabilir, ancak bu ışık veya ısıya maruz kalma riski olabilir.
      1. 7AAD veya Ghost boya mor 510 2x FACS tampon gerekli seyreltme hazırlayın. Antikorlar ve seyreltmeler için Tablo 1'e bakınız.
      2. FC antikor bölgesinin FC reseptörüne spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL FC bloker çözeltisinde 500.000 yeni izole edilmiş hücreyi yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
      3. Hücre süspansiyonunun 25°L'lik son hacmine 7AAD veya Ghost boya sımen 510 antikor ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
      4. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 4°C'de 5 dk için 500 x g santrifüj.
      5. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi örnek hacminde peleti resuspend ve akış sitometri tüpüne aktarın.
   4. Floresan aktive hücre sıralama (FACS)
      NOT: GFP-αSMA muhabiri fareler Dr Ivo Kalajzic bir katkı vardı¹¹. Bu fare alfa düz kas hücresi altında GFP ifade (αSMA) organizatörü. αSMA aktif fibroblastların (miyofibroblastlar) bir belirteci olarak kullanılmıştır¹².
      1. Aktive fibroblast (αSMA ifade miyofibroblast) izolasyonu için, koroner arter ligasyonu ile 12 haftalık GFP-αSMA farelerde miyokard infarktüsünü indükler. Fareleri yaralanmadan 8-10 gün sonra kurban edin.
      2. Yaralı farelerin kalplerinden tek hücreli süspansiyon sonrasında, yeşil floresan protein (GFP) için αSMA^+ve fibroblastları sıralayın. GFP kanalında arka plan sinyalini telafi sonrası ayarlamak için lekesiz yaralanmamış fibroblastlar kullanın.
      3. 7AAD^-ve/GFP^+ve hücreleri veya Ghost boya mor 510^-ve/GFP^+ve hücreleri ve αSMA^+ve miyofibroblastları ifade eden GFP'yi sıralayarak canlı GFP^+ve hücreleri için kapı. Fibroblast ortamda hücreleri toplamak.
3. Fibroblast izolasyonu: fibroblastların manyetik boncuk bazlı izolasyonu (Şekil 1)
   1. Denklik tamponu
      NOT: Yalıtımlar için her zaman taze arabellek hazırlayın.
      1. PBS'de %0.5 BSA ve 2 mM EDTA hazırlayın. Kabın kapağına bir vakum takarak çözeltiyi karıştırarak tamponu degas edin.
         NOT: Karıştırma, vakumdan çıkarılan çözeltiden fazla gazı kaldırır, bu nedenle kabarcıklar kullanımda ayırma sütununu tıkamaz.
   2. Manyetik etiketleme: CD45⁺ hematopoetik hücreler
      1. 5 dk için 500 x g fare kalplerinden izole hücreleri santrifüj, sonra supernatant kaldırın.
      2. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
      3. Hücre süspansiyonuna yukarıdaki gibi santrifüj edin ve hücre peletini 1 x 10⁷ toplam hücre başına 90 μL denge tamponu halinde yeniden askıya alın. 1 x 10⁷ toplam hücre başına 10 μL CD45⁺ manyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4°C'de en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
      4. Hücreleri 1 x 10⁷ toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 4°C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin.
      5. Supernatant çıkarın, bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak ve 2 mL denge tampon 1 x 10⁷ toplam hücreleri yeniden askıya. 10'dan fazla⁷ hücre varsa, arabelleği doğrusal olarak ölçeklendirin. Hücre kümelerinin ayırma sütun matrisini tıkamasını önlemek için hücreleri 40 μm'lik bir filtreden geçirin.
   3. Manyetik ayırma: CD45⁺ hematopoetik hücreler
      1. Ayırma sütununu uygun bir ayırıcının manyetik alanına yerleştirin ve en az 3 mL PBS ile denge sütunu yerleştirin.
      2. Akışta (FT) etiketlenmemiş hücreleri toplayın ve 3 mL'lik denge arabelleğiyle sütun 3x yıkayın. FT ile yıkar toplamak. Sütunu 15 mL konik bir tüpüzerine yerleştirin.
      3. 5 mL'lik denge tamponu sütunun üzerine boru landırarak ve hücreleri kolonla birlikte verilen bir pistonla sıkıca dalan manyetik etiketli CD45⁺ hücreleri dışarı atın.
      4. Santrifüj eluent yanı sıra FT / yıkama fraksiyonları 500 x g. Hemositometre kullanarak hücreleri say.
   4. Manyetik etiketleme ve ayırma: CD31⁺ endotel hücreleri
      1. CD45⁺ manyetik etiketleme ve ayırma (bölüm 2.3.2-2.3.3) için tekrar protokol, CD31⁺ manyetik boncuklar CD45⁺ izolasyon dan FT ve yıkama bölümleri ile kuluçka için kullanmak dışında.
   5. Manyetik etiketleme ve ayırma: MEFSK4⁺ fibroblastlar
      1. MANYETIK boncuklar yerine MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor kullanarak CD45⁺ manyetik etiketleme için protokolü tekrarlayın. 5 dk için 500 × g CD31⁺ izolasyon FT ve Yıkama kısımları santrifüj, sonra supernatant kaldırın. Hücre peletini 1 mL'lik denge tamponunda yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      2. 1 x 10⁷ hücre başına 10 μL MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor ekleyin. 4 °C'de en az 15 dakika kuluçka.
      3. MEFSK4 antikor bağlı hücreleri 1 x 10⁷ toplam hücre başına 5 mL denge tamponu ekleyerek yıkayın, ardından 5 000 x g'de 5 dk santrifüj edin.
      4. Kullanılan MEFSK4 anti-besleyici-APC antikor aynı hacmi kullanarak, anti-APC boncuklar supernatant çıkarın ve resuspend. 4 °C'de 15 dakika buz üzerinde kuluçka.
      5. 10 dk. 500 x g'da santrifüj, 1 x 10⁷ toplam hücre başına 2 mL denge tamponu ile resuspend ve daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma ile devam edin (bölüm 2.3.3). Manyetik olarak ayrılmış MEFSK4^+ve/ CD45^-ve/CD31^-ve fibroblastlar saflık analizleri ve diğer downstream uygulamaları için kullanılabilir.

3. İzole Fibroblast Popülasyonunun Saflık ve İşlevsellik Analizi

1. FACS popülasyon saflık analizi: αSMA-GFP hücre analizi (Şekil 2)
   1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için 25 μL Fc bloker çözeltisinde yeni izole edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
   2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
   3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
   4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. CD31-PE, CD45-APC ve AN2/NG2 antikorlarını doğrudan hücre süspansiyonuna ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
   5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
   6. Eşeği anti-rat AlexaFluor 405 ikincil antikor unconjugated primer antikor ile etiketlenmiş hücrelere ekleyin. Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
   7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
   8. FACS tamponunun (300 μL) önerilen akış sitometrisi numune hacminde peleti resuspend ve akış analizi için etiketli akış sitometri tüpüne aktarın.
      NOT: Mefsk4 antijeninin izole fibroblastlar üzerindeki ekspresyonunu karakterize eden FACS analizi bölüm 3.3'te tanımlanmıştır.
2. Fibroblast saflık analizi: immünoresans (Şekil 3A)
   1. Tohum 30.000 primer fibroblastlar (P0-P1) kapaklar üzerinde iyi başına 24 iyi plaka ve kültür% 80 konfluent yerleştirilir. Veya 400 x × g (bir 24 iyi plaka bir coverslip üzerine hücreleri doğrudan ve eşit olarak yatırmak için kullanılan bir yöntem) 400 x × g (bir coverslip tarafından coverslip üzerinde sıralanmış CD45⁺ ve CD31⁺ hücreleri (kuyu başına 30.000 hücre) konsantre.
   2. Hücreleri 15 dk soğuk aseton ile düzeltin.
   3. %10 keçi serumundaki slaytları bloke edin. Bir gecede primer antikorlar içeren kuluçka slaytları(Tablo 2).
   4. Slaytları PBS'de 3 x yıkayın. 2 saat boyunca inkübat sekonder antikorlar (Tablo 2).
   5. Counterstain slaytlar ve yavaş soluk montaj ortamda DAPI bir damla ile monte.
3. FACS nüfus saflık analizi: MEFSK4 probing (Şekil 3B)
   1. Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için FC bloker çözeltisinin 25 μL'lik yeni izole hücrelerini yeniden askıya alın. RT 5 dakika kuluçka.
   2. İsteğe bağlı: hücre süspansiyonuna 25 μL 7AAD veya Ghost boya mor 510 ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 30-60 dakika kuluçka.
   3. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. 5 dk için 500 x g santrifüj.
   4. 50 μL FACS tamponunda peleti yeniden askıya alın. DOĞRUDAN hücre süspansiyonuna MEFSK4 antikorekleyin. Buz üzerinde 15 dakika kuluçka (Tablo 1).
   5. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
   6. Hücrelere fare IgG-APC ekleyin (Tablo 1). Buz üzerinde 30 dakika kuluçka.
   7. 1 mL FACS arabelleği nde yeniden susallayarak yıkayın. Santrifüj 400 x g 5 dk.
   8. FACS tamponunun önerilen akış sitometrisi numune hacminde (300 μL) pelleti resuspend ve akış analizi için akış sitometri tüpüne aktarın.
4. Fibroblast saflık analizi: yarı kantitatif gerçek zamanlı rtPCR (Şekil 3C)
   1. RNA izolasyonu ve yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR
   2. Fibroblastların zenginleştiriminin ardından RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı izole edin (bkz. Malzeme Tablosu). Üreticinin talimatlarına uyun.
   3. Üreticinin talimatlarına uyarak cDNA sentez kiti (Bkz. Malzemeler Tablosu)kullanarak ilk iplikçik DNA sentezini tamamlayın.
   4. Yarı kantitatif gerçek zamanlı PCR⁵gerçekleştirin.
5. Fibroblast işlevsellik analizi: kollajen jel kontraktilite tahlil (Şekil 4)
   1. Kollajen çözeltisi
      1. DMEM'de 20 mM HEPES ve 44 mM NaHCO₃ hazırlayın. HEPES ve NaHCO₃ile DMEM 1 mL başına tip 1 sıçan kollajen 1.67 mg ekleyin.
   2. TGFβ destekli DMEM
      1. DMEM antibiyotik ve anti-mantar ile birlikte% 10 FBS hazırlayın. TGFβ'yı 1 ng/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
   3. Hücre/kollajen karışımı ve kaplama
      1. Hücre süspansiyonu (P3-P5) hazırlayın ve 3.3 x 10⁵ hücre elde etmek için gerekli hacmi belirleyin.
      2. 1 mL toplam hacim elde etmek için yeterli kollajen çözeltisi için 3,3 x 10⁵ hücreleri ile süspansiyon hacmi ekleyin.
         NOT: Sıçan kollajen tip 1 konsantrasyonu şimdi 1.5 mg/mL olmalıdır.
      3. Bir 48 iyi plaka, tohum 300 ° L hücre-kollajen karışımı başına iyi (~ 1 x 10⁵ hücre / iyi). 37 °C'de 15-20 dk jöleye kadar kuluçkaya yatırın.
      4. Kuyu duvarlarından jel ayırmak için 30 G iğne kullanın. Her kuyuya 600 μL TGFβ ve FBS destekli DMEM ekleyin. 24 saat ve 48 saat aynaklı bir tarayıcıda görüntü plakaları.
         NOT: Tüm İmmünofloresans deneyleri üç lazer (405 nm, 488 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi nde yapıldı. Veriler, akış verisi edinme yazılımı(Tablo Of Materials)kullanılarak elde edilmiştir. Daha fazla veri analizi akış veri analizi yazılımı kullanılarak yapılmıştır. AlexaFluor 405 ve Ghost Dye Violet 510 405 nm lazer ile heyecanlı ve 450/50 BP ve 525/50 BP filtre kullanılarak toplanan, sırasıyla. GFP ve PE 488 nm lazer tarafından heyecanlı ve 530/30 BP ve 575/26 BP filtreleri kullanılarak toplanan, sırasıyla. Ya APC veya AlexaFluor 647 640 nm lazer tarafından heyecanlı ve 670/14 BP filtre kullanılarak toplanan. Tüm hücre sıralama deneyleri dört lazer (405 nm, 488 nm, 561 nm ve 640 nm) ile donatılmış bir akış sitometri makinesi(Malzeme Tablosu)üzerinde yapılmıştır. 7-AAD 561 nm lazer kullanarak heyecanlı ve 670/14 BP filtre ile toplanan. GFP ve Ghost Boya Violet 510 yukarıda açıklandığı gibi aynı lazer / filtre kombinasyonları kullanılarak toplanmıştır. Tüm sıralama deneyleri hedef hücrelerin daha düşük canlılığı için 17 psi basınç yapılandırması ile 100 um meme kullanılmıştır.

Sonuçlar

ΑSMA-GFP muhabiri fareler kullanılarak miyofibroblast izolasyonu gösteren akış şeması
Yaralanmamış kalpler αSMA-GFP muhabiri fare modelinde tespit edilebilir GFP⁺ hücreleri göstermedi; bu nedenle, gfp kanalının arka plan sinyali için bir geçit kurmak için kullanılmıştır sonra-tazminat (Şekil 2). αSMA⁺ hücreleri MI'den 10 gün sonra yaralı sol ventrikülden GFP ekspresyonunun varlığına göre sıralandı. Endotel (GFP+/CD31+...

Tartışmalar

Fibroblastlar, çeşitli belirteçler kümesi ile tanımlanan heterojen bir hücre grubudur. Fibroblastları tanımlamak için kullanılan protein belirteçleri diskoidin etki alanı reseptörü 2 (DDR2), fibronektin, vimentin, kollajen I ve III ve Thy1^{15,16,17,18,19,20}. Vimentin yaralanmamış quiescent kardiyak fibroblastla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences