Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Zusammenfassung

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Zusammenfassung

Herzfibrose als Reaktion auf Verletzungen ist eine physiologische Reaktion auf die Wundheilung. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Fibroblasten-Subtypen zu untersuchen und zu zielen, die Fibrose mildern. Die Fibroblastenforschung wurde jedoch aufgrund des Fehlens universell akzeptabler Fibroblasten-Marker behindert, um ruhehafte sowie aktivierte Fibroblasten zu identifizieren. Fibroblasten sind eine heterogene Zellpopulation, was sie schwer zu isolieren und zu charakterisieren macht. Das vorgestellte Protokoll beschreibt drei verschiedene Methoden zur Anreicherung von Fibroblasten und Myofibroblasten aus unverletzten und verletzten Mausherzen. Die Verwendung eines Standard- und zuverlässigen Protokolls zur Isolierung von Fibroblasten wird die Untersuchung ihrer Rolle bei der Homöostase sowie der Fibrosemodulation ermöglichen.

Einleitung

Herzfibroblasten, Zellen mesenchymaler Herkunft, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der elektrischen Leitung und mechanischen Kräfte im Herzen zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Herzarchitektur während der Homöostase¹. Nach der Verletzung werden diese Zellen aktiviert, erweitern und produzieren extrazelluläre Matrixproteine (ECM)². Viele präklinische Studien haben Fibroblasten als kritische zelluläre Regulatoren aufgedeckt, die die strukturelle Integrität eines verletzten Herzens³ sowie Haupteffektorzellen, die für die unkontrollierte Produktion und Ablagerung von ECM-Proteinen verantwortlich sind, aufrecht erhalten, was zu einer steifen Narbenbildung und Herzinsuffizienz^{führt 4}. Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, was es schwierig macht, ihre reparative Funktion von pro-fibrotischen maladaptiven Eigenschaften zu sezieren. Kürzlich wurde die funktionelle Heterogenität von zwei unterschiedlichen Fibroblasten-Subtypen nach Einer Myokardverletzung definiert, was auf die Möglichkeit hindeutet, verschiedene Fibroblasten-Subtypen zu isolieren und ihre Rolle bei der Wundheilung zu untersuchen⁵.

Die Gewinnung einer reinen Fibroblastenpopulation ist entscheidend für die Abgrenzung ihrer funktionellen Rolle bei Derinstandunden- und Fibrose. Das Vorhandensein mehrerer Fibroblastenmarker, die andere Zelltypen erkennen, macht es jedoch schwierig, eine im Wesentlichen reine Fibroblastenpopulation zu isolieren⁶. Mehrere elegante Studien haben clevere Wege entwickelt, um Herzfibroblasten von unverletztem und verletztem Myokard zu isolieren. Die beliebteste und etablierteste Methode zur Anreicherung von Fibroblasten ist durch selektive Adhäsion nach enzymatischer Gewebeverdauung⁷.

Zusätzlich wurde die fluoreszenaktivierte Zellsortierung (FACS) von Fibroblasten auf Basis von Zelloberflächenantigenen erfolgreich beschrieben⁸. In der Studie wurden die mesenchymalen Zellen nach enzymatischer Verdauung als Lineage-negativ (Lin: Ter119^-CD45^-CD31⁾und gp38-positiv (gp38⁺) aus Mausherzen sortiert. Gp38^+ve-Zellen wurden aufgrund ihrer Koexpression von col1-1 und anderen mesenchymalen Markern als Fibroblasten bestätigt. Obwohl die meisten Gewebeverdauungen nach dem Austeilen des Ventrikels in einer Petrischale abgeschlossen sind, hat eine aktuelle Studie die Verwendung einer direkten Nadelenzymperfusion des linken Ventrikels untersucht, um Myozyten und Nicht-Myozyten zu isolieren, die Fibroblasten enthalten⁹. Fibroblasten wurden dann in diesem Fall durch selektive Haftung isoliert.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Anreicherung von Fibroblasten mit drei Methoden. Die erste ist eine bereits etablierte Methode mit selektiver Adhäsion von Fibroblasten nach enzymatischer Verdauung. Die zweite Methode wird verwendet, um in erster Linie verletzungsinduzierte Alpha glatte Muskel exsemitenDe Myofibroblasten zu isolieren. Die dritte Methode beinhaltet die sequenzielle, magnetische Erschöpfung einer enzymverdauten Herzzellsuspension von hämatopoetischen und endotheliaalen Zellen. Nach erschöpfender Erschöpfung werden Fibroblasten/Myofibroblasten basierend auf dem Vorhandensein des Antigens MEFSK4 unter Verwendung magnetischer Perlen isoliert. Kürzlich wurde MEFSK4 als Antigen beschrieben, das sowohl bei ruhelösenden als auch bei aktivierten Fibroblasten vorliegt, was es zu einem geeigneten Marker für die Fibroblasten-Identifikation und -Isolierung macht. Natürlich haben alle hier beschriebenen Methoden einzigartige Einschränkungen. Es wird daher dringend empfohlen, die Reinheit der isolierten Zellpopulation durch Strömungsanalyse, Immunfärbung und semiquantitative Echtzeit-PCR zu überprüfen. Diese Methoden können jedoch erweitert werden, und zusätzliche Marker können hinzugefügt werden, um andere kontaminierende Populationen auszuschließen, bevor die Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen für wichtige Experimente verwendet werden.

Protokoll

Diese Studie hält strikt an den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health fest. Der Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte das Protokoll (Protokollnummer: M1600076-01).

1. Herzsektion

1. Lösungsvorbereitung
   1. KHB-Puffer
      1. Mit einem Rührstab langsam 9,4 g Krebs-Henseleit-Pufferpulver (KHB) in 900 ml DDI-Wasser auflösen.
         HINWEIS: Puffer wird ausfallen, wenn zu schnell oder zu lange gerührt. Der KHB-Puffer muss während der Fibroblastenisolation kalt sein.
      2. 2,9 mM CaCl₂ und 24 mM NaHCO₃hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2–7,3 ein und verdünnen Sie ihn auf ein Volumen von 1 L mit dH₂O.
      3. Mit einem sterilen Filter (0,22 m) bis zu 4 °C lagern. Auf Eis oder bei 4 °C für die Dauer der Isolation.
   2. Kollagenase Verdauungscocktail
      1. Bereiten Sie Verdauungscocktail am Tag der Fibroblasten-Isolierung vor. Bestimmen Sie das geeignete Volumen des Verdauungscocktails entsprechend der Anzahl der Herzen; 5 ml Cocktail pro 1 Herz.
      2. Bereiten Sie kollagennasemischung (siehe Tabelle der Materialien) und DNase I gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      3. Für 20 ml Gesamtvergärungscocktail 17,5 l DNase I, 180 l 1 M HEPES und 500 l Kollagenase zu einem leeren 50 ml konischen Rohr geben.
      4. Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von Hanks Balanced Salt Lösung (HBSS) mit Ca²⁺ und Mg²⁺ hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 ml zu erhalten.
   3. Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer
      1. Bestimmen Sie das benötigte Gesamtvolumen basierend auf der Anzahl der Herzen (5 ml/Herz). Verdünnen Sie den 10x RBC Lyse-Lagerpuffer mit dH₂O auf 1x.
   4. Fibroblastenmedien: 10% FBS in DMEM F-12
      1. Fügen Sie 10% FBS zu DMEM-F12 mit L-Glutamin und HEPES hinzu. Fügen Sie 10 U/ml Penicillin/Streptomycin, 2,5 g/ml Antimykotika und 2,5 g/ml Mykoplasmen prophylaktisch hinzu (siehe Materialtabelle). Bei 4 °C lagern.
2. Herzsektion
   1. Bereiten Sie eine 6 Brunnenplatte auf Eis mit 2 ml kaltem KHB pro Brunnen vor, um Herzen während der Zerlegung zu speichern. Verwenden Sie autoklavierte chirurgische Schere und Zange.
   2. Euthanisieren Sie Mäuse im Alter von 12 Wochen oder älter durch Isofluran-Überdosierung, und folgen Sie mit zervikalen Dislokation.
   3. Alternativ können Sie bei aktivierter Fibroblastenisolation einen Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten Mäusen durch koronare Arterienligation¹⁰induzieren. Euthanisieren Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
   4. Sprühen Sie Körper mit 70% Ethanol und orientieren, so dass die ventrale Seite dem Experimentator gegenüber steht. Anhänge anheften oder zurückhalten, um Interferenzen zu vermeiden.
   5. Schneiden Sie die Bauchhaut und den Muskel auf, aber vermeiden Sie das Durchstechen der Leber. Schneiden Sie vertikal in Richtung des Brustbeins, und öffnen Sie vorsichtig den Thorax, während das Piercing des Herzens zu vermeiden. Fahren Sie fort, durch den Brustkorb zu schneiden, um das Herz freizulegen.
   6. Heben Sie das Herz mit Zangen sanft aus der Brust und schneiden Sie alle Lungen oder überschüssiges Gewebe ab, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist. Entfernen Sie den Ventrikel und legen Sie ihn in einen Brunnen von 6 Brunnenplatten mit kaltem KHB. Setzen Sie die Herzen auf diese Weise fort, bis alle Proben isoliert wurden.
3. Enzymatische Dissoziation des Herzens
   1. Mit Zangen, immer wieder drücken und agitieren das Herz in KHB, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie das Herz auf eine saubere sterile 10 cm² Platte. Mit einer einschneidigen Klinge, schnell das Herz in kleine Stücke zerkleinern.
   2. Fügen Sie 1 ml Kollagennase-Verdauungscocktail hinzu und weiter hacken, bis die Stücke klein genug sind, um sie mit einer 1 ml Mikropipette zu übertragen. Stücke auf ein 50 ml konisches Rohr mit einer 1 ml Mikropipette übertragen. Waschplatte 2x mit 2 ml Kollagenase-Verdauungscocktail.
      HINWEIS: Das Abschneiden eines Teils der Pipettenspitze kann helfen, größere Herzstücke zu sammeln, die sonst in der Pipettenspitze stecken bleiben könnten.
   3. Konische Röhre bei 37 °C für 30 min mit Schaukeln oder Rührung inkubieren. Sicheres Rohr nach Bedarf. 10x mit einer 5 ml Pipette aufheben, bis der Inhalt homogen ist, und das konische Rohr bei 37 °C für 15 min mit Drehung oder Rührung inkubieren.
   4. 10x mit einer 10 ml Pipet bis homogen aussetzen. Setzen Sie ein 40 m'm-Zellensieb ein, indem Sie den Filter mit 1–2 ml KHB-Puffer auf einem neuen 50 ml konischen Rohr benetzen. Fügen Sie 25 ml KHB-Puffer zur Verdauungssuspension hinzu, suspendieren und filtern Sie durch ein grundiertes 40-m-Zellsieb. Ändern Sie den Filter nach Bedarf.
      HINWEIS: Wenn sich die Filtration verlangsamt, kann ein leicht esbendes Rohr oder die Verwendung einer 1 ml Mikropipette zum Ziehen einer Suspension von der Unterseite des Filters der Zellsuspension helfen, ein teilweise blockiertes 40-m-Zellsieb zu durchlaufen.
   5. Zentrifuge bei 400 x g und 4 °C für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1x RBC-Lysepuffer (5 ml/Herz) wieder auf. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
   6. Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min. Überstand entfernen und dann waschen, indem Sie Pellet in 1 ml KHB-Puffer wieder aufhängen.
   7. Fügen Sie 9 ml KHB-Puffer hinzu und filtern Sie durch grundiertes 40-m-Zellsieb in ein neues 50 ml konisches Rohr. Zentrifuge bei 400 x g und RT für 10 min.
   8. Entfernen Sie den Überstand, setzen Sie sich in 1 ml Fibroblastenmedium oder PBS wieder aus, und bestimmen Sie die Zellnummer. Fibroblasten können mit den drei unten beschriebenen Methoden isoliert werden.

2. Isolierung von Fibroblasten von Dereinzelsuspension

1. Fibroblastenisolierung: Differentialbeschichtung (Abbildung 1)
   1. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte vor, indem Sie 2 ml Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen und die Platte wirbeln, um den Brunnenboden zu bedecken.
   2. Resuspend Zellen in 1 ml Medien pro Herz. Platte 1 ml Zellsuspension pro Brunnen, so dass ein Herz (theoretisch) pro Brunnen plattiert wird. Zum Beispiel würden sechs Herzen in 6 ml Medien resuspendiert und dann in sechs Brunnen mit 1 ml Zellsuspension pro Brunnen plattiert.
   3. Wirbelplatte, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Fügen Sie ein zusätzliches 1–2 ml Medium pro Brunnen für ein Gesamtvolumen von bis zu 5 ml pro Bohrgut hinzu und brüten Bei 37 °C für 4 h.
   4. Fibroblasten werden durch selektive Haftung nach 4 h getrennt. Entfernen Sie ungebundene und abgestorbene Zellen, indem Sie Medien entfernen. Angebundene Zellen mit 2 ml PBS waschen und 2–4 ml sterile Fibroblastenmedien pro Brunnen hinzufügen. Bei 37 °C bis zur Konvergung inkubieren. Wechseln Sie alle 2–4 Tage die Medien.
2. Fibroblastisolation: FACS mit einem GFP-Reporter-Mausmodell (Abbildung 1)
   1. FACS-Puffer
      1. Bereiten Sie 15 ml von 5% fetalem Rinderserum (FBS) in dPBS ohne Ca²⁺ und Mg²⁺vor. Auf Eis oder bei 4°C aufbewahren.
   2. FC-Blockerlösung
      1. Bereiten Sie 0,5 L FC-Blocker (gereinigte Anti-Maus-CD16/CD32) in 25 l FACS (1:50 Verdünnung) vor. Pro Probe sind 25 L FC-Blockerlösung erforderlich. Auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
   3. Probenvorbereitung und Antikörperfärbung
      HINWEIS: Antikörperverdünnungen können im Voraus vorbereitet werden, aber dies kann Licht- oder Temperaturexposition riskieren.
      1. Bereiten Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 vor, das ist 2x die erforderliche Verdünnung im FACS-Puffer. Siehe Tabelle 1 für Antikörper und Verdünnungen.
      2. 500.000 frisch isolierte Zellen in 25 L FC-Blockerlösung aussetzen, um eine unspezifische Bindung der FC-Antikörperregion an einen FC-Rezeptor zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
      3. Fügen Sie 7AAD oder Ghost Dye violett 510 Antikörper auf das endige Volumen von 25 l Zellsuspension. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
      4. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min bei 4°C.
      5. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Diedurchflusszytometrierohr.
   4. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)
      HINWEIS: GFP-SMA Reportermäuse waren ein Beitrag von Dr. Ivo Kalajzic¹¹. Diese Maus drückt GFP unter dem Alpha-Glattmuskelzell-Promotor aus. SMA wurde als Marker für aktivierte Fibroblasten (Myofibroblasten)¹²verwendet.
      1. Für aktivierte Fibroblasten (SMA, die Myofibroblasten ausdrücken) Isolation, induzieren Myokardinfarkt bei 12 Wochen alten GFP-SMA-Mäusen durch koronare Arterienligation. Opfern Sie die Mäuse 8-10 Tage nach der Verletzung.
      2. Nach der einzelzelligen Suspension aus den verletzten Mäuseherzen sortieren Sie sMA^+ve Fibroblasten nach grünem fluoreszierendem Protein (GFP). Verwenden Sie unbefleckte, nicht verletzte Fibroblasten, um das Hintergrundsignal im GFP-Kanal nach der Kompensation einzustellen.
      3. Gate für lebende GFP^+ve Zellen durch Gating für 7AAD^-ve/GFP^+ve Zellen oder Ghost Dye violett 510^-ve/GFP^+ve Zellen und sortieren GFP exemitenklich sMA^+ve Myofibroblasten. Sammeln Sie die Zellen in Fibroblastenmedien.
3. Fibroblastenisolation: magnetische Perlenisolierung von Fibroblasten (Abbildung 1)
   1. Ausgleichspuffer
      HINWEIS: Bereiten Sie immer einen neuen Puffer für Isolierungen vor.
      1. Bereiten Sie 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS vor. Entgasen Sie den Puffer, indem Sie die Lösung rühren, während Sie ein Vakuum am Deckel des Behälters befestigen.
         HINWEIS: Rühren entfernt überschüssiges Gas aus der Lösung, die dann durch das Vakuum entfernt wird, so dass Blasen die Trennsäule bei der Verwendung nicht verstopfen.
   2. Magnetische Etikettierung: CD45⁺ hämatopoetische Zellen
      1. Zentrifuge isolierte Zellen von Mäuseherzen bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie den Überstand.
      2. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
      3. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie oben und setzen Sie das Zellpellet in 90 L Ausgleichspuffer pro 1 x 10⁷ Gesamtzellen wieder auf. Fügen Sie 10 L CD45⁺ magnetische Perlen pro 1 x 10⁷ Gesamtzellen hinzu. Gut mischen und mindestens 15 min bei 4°C inkubieren.
      4. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 10⁷ Gesamtzellen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 10 min bei 4°C.
      5. Überstand entfernen, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und bis zu 1 x 10⁷ Gesamtzellen in 2 ml Ausgleichspuffer wieder aussetzen. Wenn mehr als 10⁷ Zellen vorhanden sind, skalieren Sie den Puffer linear. Übergeben Sie Zellen durch einen 40-mm-Filter, um zu verhindern, dass Zellaggregationen die Trennsäulenmatrix verstopfen.
   3. Magnetische Trennung: CD45⁺ hämatopoetische Zellen
      1. Legen Sie die Trennsäule in das Magnetfeld eines geeigneten Separators und einer Ausgleichssäule mit mindestens 3 ml PBS.
      2. Sammeln Sie nicht beschriftete Zellen im Flowthrough (FT) und waschen Sie die Säule 3x mit 3 ml Ausgleichspuffer. Sammeln Sie Wähes mit FT. Entfernen Sie die Spalte aus dem Trennzeichen. Platzieren Sie die Säule auf einem 15 ml konischen Rohr.
      3. Spülen Sie magnetisch beschriftete CD45⁺ Zellen aus, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer auf die Säule pfeifen und die Zellen mit einem mit der Säule gelieferten Kolben fest eintauchen.
      4. Zentrifugeneluent sowie FT/Waschfraktionen bei 500 x g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
   4. Magnetische Etikettierung und Trennung: CD31⁺ Endothelzellen
      1. Wiederholungsprotokoll für CD45⁺ magnetische Etikettierung und Trennung (Abschnitte 2.3.2–2.3.3), außer CD31⁺ magnetische Perlen verwenden, um mit dem FT zu inkubieren und Teile aus der CD45⁺ Isolierung zu waschen.
   5. Magnetische Etikettierung und Trennung: MEFSK4⁺ Fibroblasten
      1. Wiederholen Sie das Protokoll für CD45⁺ magnetische Etikettierung mit dem MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper anstelle von Magnetperlen. Zentrifugieren Sie die FT- und Wash-Teile aus der CD31⁺ Isolierung bei 500 x g für 5 min, dann entfernen Sie Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Ausgleichspuffer aus, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
      2. Fügen Sie 10 L MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper pro 1 x 10⁷ Zellen hinzu. Mindestens 15 min bei 4 °C inkubieren.
      3. Waschen Sie MEFSK4-Antikörpergebundene Zellen, indem Sie 5 ml Ausgleichspuffer pro 1 x 10⁷ Gesamtzellen hinzufügen, dann Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
      4. Entfernen Sie Überstand und Resuspend in Anti-APC-Perlen, mit dem gleichen Volumen von MEFSK4 Anti-Feeder-APC-Antikörper verwendet. 15 min bei 4 °C auf Eis bebrüten.
      5. Zentrifugieren bei 500 x g für 10 min. Überstand entfernen, in 2 ml Gleichgewichtspuffer pro 1 x 10⁷ Gesamtzellen wieder aufsetzen und mit der magnetischen Trennung fortfahren, wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.3.3). Magnetisch getrennte MEFSK4^+ve/ CD45^-ve/CD31^-ve Fibroblasten können für Reinheitsanalysen und andere nachgeschaltete Anwendungen verwendet werden.

3. Reinheits- und Funktionsanalyse der isolierten Fibroblastenpopulation

1. FACS-Populationsreinheitsanalyse: SMA-GFP-Zellanalyse (Abbildung 2)
   1. Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l fc Blockerlösung ab, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
   2. Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
   3. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
   4. Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Cd31-PE-, CD45-APC- und AN2/NG2-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzufügen. 15 min auf Eis inkubieren (Tabelle 1).
   5. Waschen durch Erneutanhalten in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
   6. Fügen Sie Esel Anti-Ratte AlexaFluor 405 sekundären Antikörper zu den Zellen, die mit unkonjugierten primären Antikörper gekennzeichnet sind. 30 min auf Eis bebrüten.
   7. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
   8. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in ein beschriftetes Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
      HINWEIS: Die FACS-Analyse zur Charakterisierung der Expression von MEFSK4-Antigen auf isolierte Fibroblasten wird in Abschnitt 3.3 beschrieben.
2. Fibroblasten-Reinheitsanalyse: Immunfluoreszenz (Abbildung 3A)
   1. Samen 30.000 primäre Fibroblasten (P0-P1) pro Brunnen auf Decklippen in einer 24 Brunnenplatte und Kultur bis 80% konfluent platziert. Oder konzentrieren Sie sortierte CD45⁺ und CD31⁺ Zellen (30.000 Zellen pro Brunnen) auf einem Deckzettel von Cytospin bei 400 x x g (eine Methode, die verwendet wird, um Zellen direkt und gleichmäßig auf einen Deckzettel in einer 24-Well-Platte zu deponieren).
   2. Fix Zellen mit kaltem Aceton für 15 min. Waschen Sie 3x mal mit PBS.
   3. Blockrutschen in 10% Ziegenserum. Inkubationsschlitten mit primären Antikörpern über Nacht (Tabelle 2).
   4. Schlitten 3x in PBS waschen. Sekundärantikörper für 2 h inkubieren (Tabelle 2).
   5. Gegenfleck-Rutschen und mounten Sie mit einem Tropfen DAPI in langsam verblassenden Montagemedien.
3. FACS-Populationsreinheitsanalyse: MEFSK4-Sondierung (Abbildung 3B)
   1. Heben Sie frisch isolierte Zellen in 25 l FC-Blockerlösung aus, um die unspezifische Bindung von Antikörpern zu verhindern. 5 min bei RT inkubieren.
   2. Optional: Fügen Sie 25 L 7AAD oder Ghost Farbstoff violett 510 zur Zellsuspension hinzu. Inkubieren Sie für 30-60 min auf Eis im Dunkeln.
   3. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 500 x g für 5 min.
   4. Pellet in 50 L FACS-Puffer resuspendieren. Fügen Sie MEFSK4-Antikörper direkt zur Zellsuspension hinzu. 15 min auf Eis brüten (Tabelle 1).
   5. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
   6. Fügen Sie Ratte IgG-APC zu den Zellen hinzu (Tabelle 1). 30 min auf Eis bebrüten.
   7. Waschen durch Erneutaussetzen in 1 ml FACS-Puffer. Zentrifuge bei 400 x g für 5 min.
   8. Resuspend Pellet in empfohlener Durchflusszytometrie Probenvolumen des FACS-Puffers (300 l) und Übertragung in Durchflusszytometrierohr für die Strömungsanalyse.
4. Fibroblasten-Reinheitsanalyse: semiquantitative Echtzeit-rtPCR (Abbildung 3C)
   1. RNA-Isolation und semiquantitative Echtzeit-PCR
   2. Nach der Anreicherung von Fibroblasten kannen Sie RNA mit einem RNA-Isolationskit isolieren (siehe Tabelle der Materialien). Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
   3. Vervollständigen Sie die DNA-Synthese des ersten Strangs mit einem cDNA-Synthesekit (siehe Tabelle der Materialien),die den Anweisungen des Herstellers folgend.
   4. Führen Sie semiquantitative Echtzeit-PCR⁵durch.
5. Fibroblasten-Funktionsanalyse: Kollagen-Gel-Kontraktilitätstest (Abbildung 4)
   1. Kollagenlösung
      1. Bereiten Sie 20 mM HEPES und 44 mM NaHCO₃ in DMEM vor. 1,67 mg Rattenkollagen typ 1 pro 1 ml DMEM mit HEPES und NaHCO₃hinzufügen.
   2. TGF-ergänzung DMEM
      1. Bereiten Sie 10% FBS in DMEM mit Antibiotika und Anti-Pilz. Fügen Sie TGF zu einer Endkonzentration von 1 ng/ml hinzu.
   3. Zell/Kollagen-Mischung und Beschichtung
      1. Bereiten Sie die Zellsuspension (P3-P5) vor und bestimmen Sie das erforderliche Volumen, um 3,3 x 10⁵ Zellen zu erhalten.
      2. Fügen Sie das Suspensionsvolumen mit 3,3 x 10⁵ Zellen zu einer ausreichenden Kollagenlösung hinzu, um 1 ml Gesamtvolumen zu erhalten.
         HINWEIS: Die Konzentration von Rattenkollagen Typ 1 sollte jetzt 1,5 mg/ml betragen.
      3. In einer 48-Well-Platte, Samen 300 l Zell-Kollagen-Mix pro Brunnen (ca. 1 x 10⁵ Zellen/ Well). Bei 37 °C für 15–20 min inkubieren, bis gegelt wird.
      4. Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um Gel von den Brunnenwänden zu trennen. Fügen Sie jedem Brunnen 600 L TGF und FBS hinzu, die DMEM ergänzen. Bildschilder auf einem reflektierenden Scanner bei 24 h und 48 h.
         HINWEIS: Alle Immunfluoreszenzexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine durchgeführt, die mit drei Lasern (405 nm, 488 nm und 640 nm) ausgestattet ist. Die Daten wurden mit Hilfe einer Flow Data Acquiring Software (Tabelle der Materialien) erfasst. Weitere Datenanalysen wurden mit einer Flow-Data-Analyse-Software durchgeführt. AlexaFluor 405 und Ghost Dye Violet 510 wurden mit dem 405 nm Laser begeistert und mit einem 450/50 BP bzw. 525/50 BP Filter gesammelt. GFP und PE wurden durch den 488 nm Laser begeistert und mit den Filtern 530/30 BP bzw. 575/26 BP gesammelt. Entweder APC oder AlexaFluor 647 wurde durch den 640 nm Laser begeistert und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. Alle Zellsortierungsexperimente wurden an einer Durchflusszytometriemaschine(Materialtabelle) durchgeführt, die mit vier Lasern (405 nm, 488 nm, 561 nm und 640 nm) ausgestattet war. 7-AAD wurde mit dem 561 nm Laser aufgeregt und mit einem 670/14 BP Filter gesammelt. GFP und Ghost Dye Violet 510 wurden mit den gleichen Laser/Filter-Kombinationen wie oben beschrieben gesammelt. Alle Sortierexperimente nutzten eine 100 Umdüse mit einer 17 psi Druckkonfiguration für eine erhöhte nachgeschaltete Lebensfähigkeit der Zielzellen.

Ergebnisse

Strömungs-Gating-Schema demonstriert Myofibroblast-Isolation mit SMA-GFP-Reportermäusen
Unverletzte Herzen zeigten keine nachweisbaren GFP⁺ Zellen im Mausmodell des SMA-GFP-Reporters; Daher wurden sie verwendet, um ein Tor für das Hintergrundsignal des GFP-Kanals nach der Kompensation zu errichten (Abbildung 2). SMA⁺ Zellen wurden auf der Grundlage des Vorhandenseins der GFP-Expression aus dem verletzten linken Ventrikel 10 Tage nach MI sortiert. ...

Diskussion

Fibroblasten sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die durch verschiedene Marker identifiziert werden. Die Proteinmarker, die verwendet wurden, um Fibroblasten zu identifizieren, sind Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2), Fibronectin, Vimentin, Kollagen I und III und Thy1^{15,,16,17,18,19,20}. Während Vimentin verwendet wurde,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetone
Anti-fungal (Amphotericin B-solubilized; Fungizone)	Sigma Aldrich	A9528
Bovine Serium Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8
Calcium chloride
Citrate Buffer
Collagenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)	Roche Applied Science
DAPI
DDI water
DI water
DMEM-F12 with L-Glutamine and HEPES	Life technologies	11330057
Dnase I(20U/mL)	BioRad	7326828
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) without Ca2+ and Mg2+	Gibco	13190-144
70% Ethanol
FC Blocker (Purified anti-mouse CD16/CD32)	Tonbo Biosciences	70-0161
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16000044
10% goat serum
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) with Ca2+ and Mg2+	Corning	21-023-CV
1M HEPES	Corning	25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer powder	Sigma	K3753
Mycoplasma prophylactic (Plasmocin)	Invivogen	ant-mpp
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)
10x Red Blood Cell Lysis Buffer	Miltenyi	130-094-183
Slow-fade Mounting Media
Sodium azide
Sodium bicarbonate
TGFβ
Trypan Blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-061
Type 1 Rat Collagen
Antibodies
7AAD (stock: 1 mg/mL solution in DMSO)	Molecular Probes	A1310	dilution = 1:1000; RRID =
CD45-APC	BD Bioscience	559864	dilution = 1:200; RRID = AB_398672
CD31-PE	BD Bioscience	553373	dilution = 1:200; RRID = AB_394819
CD31	BD Biosciences	553370	dilution = 1:250; RRID = AB_394816
CD45	BD Biosciences	553076	dilution = 1:250; RRID = AB_394606
COL 1α1	MD Bioproducts	203002	dilution = 1:1000; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation: 1 uL/test in DMSO)	Tonbo Biosciences	13-0870	dilution = 1:1000; RRID =
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029	dilution = 1:200; RRID = AB_138404
Goat anti-rabbit-Cy3	Southern Biotech	4050-02	dilution = 1:200; RRID = AB_2795952
Goat anti-rabbit-FITC	Jackson Immunoresearch Laboratories	711-165-152	dilution = 1:200; RRID = AB_2307443
Goat anti-rat Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11006	dilution = 1:200; RRID = AB_2534074
Goat anti-rat Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	A21247	dilution = 1:200; RRID = AB_141778
Periostin	Santa Cruz	SC67233	dilution = 1:100; RRID = AB_2166650
Vimentin	Sigma Aldrich	V2258	dilution = 1:200; RRID = AB_261856
α-smooth muscle actin (αSMA)	Sigma Aldrich	A2547	dilution = 1:1000; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)	Millipore 07-2274	07-2274	dilution = 1:100; RRID = AB_10807552
CD45 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-052-301
CD31 Magnetic Beads	Miltenyi Biotec	130-087-418
Anti-feeder cells-APC (MEFSK4)	Miltenyi Biotec	130-102-900	dilution = 1:100; RRID = AB_2660619
anti-APC Beads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Rat IgG-APC	Miltenyi Biotec	130-103-034	dilution = 1:100; RRID = AB_2661598
Donkey anti-rat Alexa Fluor405	Abcam	ab175670	dilution = 1:100
anti-AN2/NG2	Miltenyi Biotec	130-097-455	dilution = 1:11; RRID = AB_2651235
Other Materials
0.22 µm Filter	Thermo Scientific	723-2520
10 cm2 Cell Culture Dish	Corning	430167
10 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11E
40 µm Cell Strainer	Fisherbrand	22363547
5 mL Pipet	Fisherbrand	13-678-11D
50 mL Conical Tube	Falcon	352070
6-well Plate	Corning	3506
Flow Cytometry Tubes	Falcon	352058
Forceps
Rocker
Single Edge Blade	PAL	62-0177
Surgical Scissors
GFP-αSMA Reporter Mice
MACS Separator Magnetic Field
MACS Separation Column
Coverslips
Qaigen Rneasy Mini Kit	Qaigen	74104
Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit	Ambion	AM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit	BioRad	1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)	BD Biosciences
4 Laser Flow Cytometry Machine (BD FACSAria III)	BD Biosciences
Flow Data Acquiring Software (BD FACSDiva Software v8.0a)	BD Biosciences
Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)	BD Biosciences