JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم طريقة لتنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر.

Abstract

الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي المحيطي هي خلايا Schwann (SCs) والخلايا الليفية. كل من هذه الخلايا تعبر بوضوح عن الأنماط الظاهرية الحسية والحركية المشاركة في أنماط مختلفة من التعبير الجيني عامل العصبية والعمليات البيولوجية الأخرى، مما يؤثر على تجديد الأعصاب. وقد وضعت هذه الدراسة بروتوكولا للحصول على درجة عالية من تنقية الفئران الحسية والمحركات SCs والالخلايا الليفية بسرعة أكبر. تم فصل الجذر البطني (العصب الحركي) والجذر الظهري (العصب الحسي) للفئران الوليدية (7 أيام من العمر) وتم استزراع الخلايا لمدة 4-5 أيام ، تليها عزل الخلايا الليفية الحسية والحركية وSCs من خلال الجمع بين الهضم التفاضلي وأساليب الالتزام التفاضلي بشكل تسلسلي. أظهرت نتائج التحليلات في الكيمياء المناعية والتدفق للخلايا أن نقاء الـ SCs الحسية والحركية والليفية كانت >90٪. يمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على عدد كبير من الخلايا الليفية الحسية والحركية /SCs بسرعة أكبر ، مما يساهم في استكشاف تجديد الأعصاب الحسية والحركية.

Introduction

في الجهاز العصبي المحيطي ، تتكون الألياف العصبية بشكل رئيسي من محاور عصبية وخلايا Schwann (SCs) ، والخلايا الليفية ، وتحتوي أيضًا على عدد قليل من الضامة والخلايا البطانية الدقيقة الوعائية والخلايا المناعية1. SCs التفاف محاور عصبية في نسبة 1:1 وترفق من قبل طبقة النسيج الضام يسمى endoneurium. ثم يتم تجميع المحاور معًا لتشكيل مجموعات تسمى كراسات، ويتم تغليف كل كراسة في طبقة نسيج الضامة المعروفة باسم perineurium. وأخيرا، يتم لف الألياف العصبية كلها في طبقة من النسيج الضام، والذي يطلق عليه الإبينوريوم. في endoneurium ، وتتألف من مجموع الخلايا كلها 48 ٪ SCs ، وجزء كبير من الخلايا المتبقية ينطوي على الخلايا الليفية2. وعلاوة على ذلك، الخلايا الليفية هي مكونات هامة لجميع مقصورات الأعصاب، بما في ذلك الإبينوريوم، والبيرينوريوم، و endoneurium3. وقد أشارت العديد من الدراسات إلى أن SCs والخلايا الليفية تلعب دورا حاسما في عملية التجديد بعد إصابات الأعصاب الطرفية4,5,6. بعد نقل العصب المحيطي، ينظم الخلايا الليفية المحيطة فرز الخلايا عبر مسار إشارة ephrin-B/EphB2 بين SCs واللوثريات الليفية، وتوجيه المزيد من إعادة نمو محور عصبي من خلال الجروح5. الخلايا الليفية العصبية الطرفية تفرز بروتين tenascin-C وتعزز هجرة SCs أثناء تجديد الأعصاب من خلال β1-integrin signals pathway7. ومع ذلك، استمدت SCs و الليفية المستخدمة في الدراسات المذكورة أعلاه من العصب الوركي، والذي يشمل كلا من الأعصاب الحسية والحركية.

في الجهاز العصبي المحيطي، تقوم الأعصاب الحسية (الأعصاب المُعَدّة) بإجراء إشارات حسية من المستقبلات إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بينما تقوم الأعصاب الحركية (الأعصاب المُفَرّضة) بإجراء إشارات من الجهاز المركزي للعضلات. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن SCs التعبير عن أنواع ظاهرية الحركية والحسية متميزة وإفراز العوامل العصبية لدعم تجديد الأعصاب الطرفية8,9. وفقا لدراسة حديثة، الليفية أيضا التعبير عن مختلف الحركية والأنماط الظاهرية الحسية وتؤثر على هجرة SCs10. وهكذا، فإن استكشاف الاختلافات بين الخلايا الليفية العصبية الحركية والحسية/الخلايا العصبية العصبية يسمح لنا بدراسة الآليات الجزيئية الأساسية المعقدة للتجديد المحددة للأعصاب الطرفية.

في الوقت الحاضر، وهناك العديد من الطرق لتنقية SCs والخلايا الليفية، بما في ذلك تطبيق العوامل المضادة للmitotic، والخلايا التي تعمل بوساطة الأجسام المضادة11،12، مناعة متتابعة13 و لامينين substratum14. ومع ذلك، جميع الأساليب المذكورة أعلاه إزالة الخلايا الليفية والحفاظ على SCs فقط. SCs المنقى للغاية والليفية يمكن الحصول عليها عن طريق تدفق تكنولوجيا فرز الخلايا15، لكنه تقنية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. ومن ثم، في هذه الدراسة، تم تطوير عملية هضم التفاضلية البسيطة وطريقة الالتزام التفاضلي لتنقية وعزل الخلايا الليفية العصبية الحسية والحركية وSCs من أجل الحصول على عدد كبير من الخلايا الليفية والـ SCs بسرعة أكبر.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية الحيوانات في جامعة نانتونغ. وقد وافقت لجنة ادارة الحيوانات التجريبية بمقاطعة جيانغسو الصينية اخلاقيا على جميع الاجراءات بما فيها الاجراءات الحيوانية .

1. العزلة والثقافة من الخلايا الليفية العصبية الحركية والحسية وSCs

  1. استخدام سبعة أيام من العمر Sprague-Dawley (SD) الفئران (n = 4) التي قدمها مركز الحيوانات التجريبية من جامعة نانتونغ في الصين. ضع الفئران في خزان يحتوي على 5٪ ايزوفلوران لمدة 2-3 دقائق، والسماح للحيوانات التنفس ببطء وليس لها نشاط مستقل، ثم تطهير باستخدام الإيثانول 75٪ قبل قطع الرأس.
  2. استخدم المقص لقطع الجلد الخلفي لمدة 3 سم وإزالة العمود الفقري. افتح القناة الفقرية بعناية لفضح الحبل الشوكي.
  3. الحفاظ على الحبل الشوكي في طبق بيتري 60 مم مع 2-3 مل من الجليد الباردة D-هانكس 'محلول الملح المتوازن (HBSS).
  4. استنادا إلى بنية التشريحية، استئصال الجذر البطني (العصب المحرك) ومن ثم الجذر الظهري (العصب الحسي) تحت مجهر تشريح. بعد ذلك ، ضعها في محلول ملح D-Hanks المتوازن للجليد (HBSS).
  5. بعد إزالة HBSS، شريحة الأعصاب إلى 3-5 ملم قطع مع مقص وهضم مع 1 مل من 0.25٪ (ث / الخامس) التربسين في 37 درجة مئوية لمدة 18-20 دقيقة. المقبل, تكملة مع 3-4 مل من DMEM تحتوي على 10% مصل الأبقار الجنين (FBS) لوقف الهضم.
  6. الميette الخليط صعودا وهبوطا بلطف حوالي 10 مرات والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، تجاهل المكبر وتعليق الترسب في 2-3 مل من DMEM تكملها 10٪ FBS.
  7. تصفية تعليق الخلية باستخدام مرشح شبكة 400، ومن ثم تلقيح الخلايا في 60 ملم بتري طبق والثقافة في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2. بعد 4-5 أيام من زراعة، عزل مرور 0 (ع) الخلايا الليفية وSCs بعد الوصول إلى التقاء 90٪.
  8. عزلة وثقافة الـ SCs (الشكل 1)
    1. غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1X PBS. إضافة 1 مل من 0.25٪ (ث / الخامس) التربسين (37 درجة مئوية) لكل 60 ملم طبق بيتري لهضم الخلايا لمدة 8-10 ثانية في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، إضافة 3 مل من DMEM تكملها 10٪ FBS لوقف الهضم.
    2. ضربة بلطف الخليط لفصل SCs مع ماصة. ثم جمع والطرد المركزي SCs في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
    3. تجاهل supernatant وتعليق الترسب في 3 مل من DMEM مع 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / ستربتوميسين، 2 μM forskolin و 10 نانوغرام / مل HRG، ومن ثم تلقيح الخلايا في طبق بيتري غير المصقول 60 مم. بعد زراعة في 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة ، تلتهز الخلايا الليفية (عدد قليل من الخلايا الليفية مع SCs) إلى الجزء السفلي من الطبق.
    4. نقل سوبرنات (بما في ذلك SCs) إلى آخر بولي L-ليسين (PLL) المغلفة طبق متوسطة والثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
  9. العزلة وثقافة الخلايا الليفية (الشكل 1)
    1. بعد إزالة SCs (كما هو موضح في الخطوة 1.8)، قم بغسل الخلايا الليفية المتبقية في الأطباق مع 1x PBS ثم أضف 1 مل من 0.25٪ (ث / الخامس) التربسين لهضم الخلايا الليفية لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. إضافة DMEM تكملها مع 10٪ FBS لإنهاء عملية الهضم. ضربة الخلايا الليفية باستخدام ماصة، ومن ثم جمع والطرد المركزي لهم في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
    3. تخلص من المكبر، واوقف الترسب مع 2 مل من DMEM يحتوي على 10٪ FBS، ثم تلقيح الخلايا في طبق بيتري غير المصقول عيار 60 ملم. الخلايا الليفية بعد زراعة لمدة 30-45 دقيقة في 37 °C نعلق على الجزء السفلي من الطبق. تجاهل المُنَاط (بما في ذلك عدد قليل من SCs). ثم إضافة 3 مل من DMEM تكملها 10٪ FBS في طبق الخلايا الليفية والثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
  10. مرور الخلايا P1 حتى وصلت إلى التقاء 90٪. ثم تنقيتها عن طريق الهضم التفاضلي والالتزام التفاضلي مرة أخرى كما هو موضح في القسمين 1.8 و 1.9.
  11. استوعب الخلايا الليفية P2 وSCs بعد الاستزراع لمدة يومين ، ثم جمع الخلايا ، والعد والتلقح في 1 × 105 أرقام / جيدا على الشرائح المغلفة PLL للكيمياء المناعية (ICC).

2- غرفة التجارة الدولية لتحديد نقاء الخلية

  1. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية وأداء ICC تلطيخ بعد الهضم التفاضلي والالتزام التفاضلي من الخلايا الليفية الحركية والحسية وSCs.
  2. غسل الخلايا الليفية الحركية والحسية وSCs مع 1X PBS وإصلاحها في 200 ميكرولتر / بئر من 4٪ شبهformaldehyde (درجة حرارة 7.4) لمدة 18 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. كتلة عينة SCs مع العازلة حظر (0.1٪ تريتون X-100 في 0.01 M PBS تحتوي على مصل الماعز 5٪ ) ومنع الخلايا الليفية العينة مع العازلة حظر (0.01 M برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الماعز 5٪ ) لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية بعد غسلها مع PBS ثلاث مرات.
  4. إزالة العازلة حظر، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية التالية: الماوس أحادية النسيلة المضادة للأجسام CD90 (علامة محددة للليفية) (1:1000) للأجسام الليفية والماوس المضادة S100 (علامة محددة لSCS) (1:400) لSCs في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  5. تخلص من الأجسام المضادة الأولية ، واغسل مع PBS ثلاث مرات ، واحتضان الأجسام المضادة الثانوية التالية: Alexa Fluor 594 الماعز المضادة للماوس IgG (1:400) للروبوتات الليفية و 488-مترافق مع الماعز المضادة للماوس IgG (1:400) لSCS في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة.
  6. غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، وصمة عار النوى مع 5 ميكروغرام / مل Hoechst 33342 صبغة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل العينة بـ 1x PBS ثلاث مرات واركبها باستخدام الوسيلة المتصاعدة (20 ميكرولتر/شريحة) على الشريحة الزجاجية.
  7. التقاط الصور الفوتوغرافية الخلية بواسطة المجهر ليزر confocal المسح الضوئي في ثلاثة حقول عشوائية لكل بئر. تقييم العدد الإجمالي للخلايا النوى والخلايا إيجابية CD90، الخلايا الإيجابية S100 ومن ثم حساب النسبة المئوية للخلايا إيجابية CD90 والخلايا الإيجابية S100، على التوالي. أداء تلطيخ في ثلاثية.

3. تدفق تحليل القياس الخلوي (FCA) لتحديد نقاء الخلية

  1. تقييم نقاء الخلايا الليفية الحركية والحسية والـ SCs كما سبق وصفه من قبل FCA16. بإيجاز, هضم p2 المحرك والليفي الحسية وSCs مع 0.25% (ث / الخامس) التربسين, resuspend الكريات الخلية واحتضان لهم في وسط التثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. احتضان الخلايا مع متوسط permeabilization والتحقيق باستخدام الماوس أحادية النسيلة المضادة للأجسام CD90 (0.1 ميكروغرام / 106 الخلايا ، 200 ميكرولتر) للأورام الليفية والماوس المضادة لS100 (1:400 ، 200 ميكرولتر) لSCs في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، على التوالي.
  3. احتضان الخلايا مع 488-المقترنة الماعز المضادة للماوس IgG لمدة 30 دقيقة. استخدام عيار FACS لأداء تدفق القياس الخلوي، وتحليل البيانات باستخدام برنامج الخلية كويست.
  4. احتضان الخلايا فقط مع 488-مترافق الماعز المضادة للماوس IgG (مجموعة الخلايا الليفية) والفأرة IgG1 كابا [موك-21] (FITC) - التحكم Isotype (مجموعة SCs)، الذي يعمل بمثابة التحكم السلبي.

4 - التحليل الإحصائي

  1. تقديم جميع البيانات كوسيلة ± SEM. تقييم الاختلافات الإحصائية في البيانات بواسطة غير مُزَدِّد t-test باستخدام GraphPad Prism 6.0. تعيين الأهمية pالإحصائية في <0.05. إجراء جميع المقايسات في ثلاث ة.

النتائج

الملاحظة المجهرية الخفيفة
SCs والخلايا الليفية هما الخلايا الرئيسية التي تم الحصول عليها في ثقافة الخلية الأولية من الأنسجة العصبية. بعد تلقيح 1 ساعة ، انضمت معظم الخلايا إلى الجزء السفلي من الطبق ، وتغيرت مورفولوجيا الخلية من جولة إلى بيضاوية. بعد زراعة لمدة 24 ...

Discussion

وشملت المجموعتين الخلايا الرئيسية للأعصاب الطرفية SCs والخلايا الليفية. يمكن للخلايا الليفية المستزرعة في المقام الأول وSCs أن تساعد بدقة في نمّام فسيولوجيا الخلايا الليفية والـ SCs أثناء تطوير الأعصاب المحيطية وتجديدها. وأظهرت الدراسة أن الخلايا العصبية الوركية الفئران P7 تحتوي على حوالي 85...

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذه الدراسة البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (منحة رقم 2017YFA0104703)، المؤسسة الوطنية الطبيعية في الصين (منحة رقم 31500927).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Life TechnologiesA11005Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)ProteintechSA00013-1Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscopeLeica MicrosystemsTCS SP5
Cell Quest softwareBecton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solutionGibco14170112
DMEMCorning10-013-CV
Dissecting microscopeOlympusSZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)Gibco10099-141C
ForskolinSigmaF6886-10MG
Fluoroshield Mounting MediumAbcamab104135
Fixation medium/Permeabilization mediumMulti Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTDGAS005
Flow cytometryBecton Dickinson BiosciencesFACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype ControlAbcamab106163Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibodyAbcamab225Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibodyAbcamab212816Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)SigmaP4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain ProteinR&D Systems396-HB-050
0.25% (w/v) trypsinGibco25200-072

References

  1. Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
  2. Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
  3. Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
  4. Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
  5. Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
  6. Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
  7. Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
  8. Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
  9. Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
  10. He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
  11. Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
  12. Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
  13. Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
  14. Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
  15. Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
  16. He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
  17. Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

159

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved