Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode zur Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in vitro.

Zusammenfassung

Die Hauptzellen im peripheren Nervensystem sind die Schwann-Zellen (SCs) und die Fibroblasten. Beide Zellen drücken deutlich die sensorischen und motorischen Phänotypen aus, die an verschiedenen Mustern der neurotrophen Faktorgenexpression und anderen biologischen Prozessen beteiligt sind, was die Nervenregeneration beeinflusst. Die vorliegende Studie hat ein Protokoll erstellt, um hochgereinigte Ratinsensorische und motorische Cs und Fibroblasten schneller zu erhalten. Die ventrale Wurzel (Motornerv) und die Rückenwurzel (Sensornerv) von neonatalen Ratten (7 Tage alt) wurden dissoziiert und die Zellen wurden für 4-5 Tage kultiviert, gefolgt von isolierungs- und motorischen Fibroblasten und SCs durch die Kombination von Differentialverdauung und Differentialhaftungsmethoden nacheinander. Die Ergebnisse der Immunzytochemie und der Durchflusszytometrie-Analysen zeigten, dass die Reinheit der sensorischen und motorischen SCs und Fibroblasten >90% betrug. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine große Anzahl von sensorischen und motorischen Fibroblasten/SCs schneller zu erhalten und so zur Erforschung der sensorischen und motorischen Nervenregeneration beizutragen.

Einleitung

Im peripheren Nervensystem bestehen die Nervenfasern hauptsächlich aus Axonen, Schwann-Zellen (SCs) und Fibroblasten und enthält auch eine kleine Anzahl von Makrophagen, mikrovaskulären Endothelzellen und Immunzellen¹. SCs wickeln die Axone in einem Verhältnis von 1:1 und werden von einer Bindegewebsschicht namens Endoneurium umschlossen. Die Axone werden dann zu Gruppen gebündelt, die Faszikel genannt werden, und jedes Faszikel wird in eine Bindegewebsschicht eingewickelt, die als Perineurium bekannt ist. Schließlich wird die gesamte Nervenfaser in eine Schicht aus Bindegewebe eingewickelt, die als Epineurium bezeichnet wird. Im Endoneurium besteht die gesamte Zellpopulation aus 48% SCs, und ein erheblicher Teil der verbleibenden Zellen umfasst Fibroblasten². Darüber hinaus sind Fibroblasten wichtige Bestandteile aller Nervenkompartimente, einschließlich des Epineuriums, des Perineuriums und des Endoneuriums³. Viele Studien haben gezeigt, dass SCs und Fibroblasten eine entscheidende Rolle im Regenerationsprozess nach peripheren Nervenverletzungen^4,5,6spielen. Nach der Transektion des peripheren Nervs regulieren die perineurialen Fibroblasten die Zellsortierung über den Ephrin-B/EphB2-Signalweg zwischen SCs und Fibroblasten und leiten das axonale Nachwachsen durch Wunden⁵. Periphere Nervenfibroblasten sezernieren Tenascin-C-Protein und verbessern die Migration von SCs während der Nervenregeneration durch den Signalweg⁷. Die in den oben genannten Studien verwendeten SCs und Fibroblasten wurden jedoch vom Ischiasnerv abgeleitet, der sowohl sensorische als auch motorische Nerven umfasst.

Im peripheren Nervensystem leiten die Sinnesnerven (afferent nerven) sensorische Signale von den Rezeptoren an das zentralnervousische System (ZNS), während die motorischen Nerven (effeente Nerven) Signale vom ZNS an die Muskeln leiten. Frühere Studien haben gezeigt, dass SCs unterschiedliche motorische und sensorische Phänotypen exprimieren und neurotrophe Faktoren absondern, um die periphere Nervenregeneration zu unterstützen^8,9. Laut einer aktuellen Studie exprimieren Fibroblasten auch verschiedene motorische und sensorische Phänotypen und beeinflussen die Migration von SCs¹⁰. So ermöglicht uns die Erforschung von Unterschieden zwischen motorischen und sensorischen Nervenfibroblasten/SCs, die komplizierten zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der peripheren nervenspezifischen Regeneration zu untersuchen.

Derzeit gibt es viele Möglichkeiten, SCs und Fibroblasten zu reinigen, einschließlich der Anwendung von Antimitatika, Antikörper-vermittelte Zytolyse^11,12, sequentielle Immunpanning¹³ und Laminin substratum¹⁴. Alle oben genannten Methoden entfernen jedoch Fibroblasten und bewahren nur die SCs. Hochgereinigte SCs und Fibroblasten können durch Durchflusszytometrie-Sortiertechnologie¹⁵erhalten werden, aber es ist eine zeitaufwändige und kostspielige Technik. Daher wurde in dieser Studie eine einfache Differentialverdauungs- und Differentialhaftungsmethode zur Reinigung und Isolierung von sensorischen und motorischen Nervenfibroblasten und SCs entwickelt, um eine große Anzahl von Fibroblasten und SCs schneller zu erhalten.

Protokoll

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Institutional Animal Care Guidelines der Universität Nantong durchgeführt. Alle Verfahren einschließlich der tierischen Subjekte wurden vom Verwaltungsausschuss für Versuchstiere in der Provinz Jiangsu, China, ethisch genehmigt.

1. Isolation und Kultur von motorischen und sensorischen Nerven-Fibroblasten und SCs

1. Verwenden Sie sieben Tage alte Sprague-Dawley (SD) Ratten (n=4), die vom Experimental Animal Center der Nantong University of China bereitgestellt werden. Legen Sie die Ratten in einen Tank mit 5% Isofluran für 2-3 Minuten, lassen Sie die Tiere langsam atmen und haben keine unabhängige Aktivität, und dann mit 75% Ethanol vor der Enthauptung desinsieren.
2. Verwenden Sie eine Schere, um die hintere Haut für ca. 3 cm zu schneiden und die Wirbelsäule zu entfernen. Öffnen Sie den Wirbelkanal sorgfältig, um das Rückenmark freizulegen.
3. Bewahren Sie das Rückenmark in einer 60 mm Petrischale mit 2-3 ml eiskalter D-Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS) auf.
4. Basierend auf der anatomischen Struktur, verbrauchen Sie die ventrale Wurzel (Motornerv) und dann die Rückenwurzel (Sensornerv) unter einem Sezieren des Mikroskops. Als nächstes legen Sie sie in eine eiskalte D-Hanks'-Ausgewogene Salzlösung (HBSS).
5. Nach dem Entfernen des HBSS die Nerven mit einer Schere in 3-5 mm Stücke schneiden und mit 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin bei 37 °C für 18-20 min verdauen. Als nächstes, Ergänzung mit 3-4 ml DMEM enthält 10% fetales Rinderserum (FBS), um die Verdauung zu stoppen.
6. Die Mischung etwa 10 Mal vorsichtig auf und ab pipette und bei 800 x g 5 min zentrieren. Danach den Überstand entsorgen und den Niederschlag in 2-3 ml DMEM, ergänzt mit 10% FBS, aussetzen.
7. Filtern Sie die Zellsuspension mit einem 400-Mesh-Filter, und impfen Sie dann die Zellen in 60 mm Petrischale und Kultur bei 37 °C in Gegenwart von 5%_CO2. Nach 4-5 Tagen Kultivierung isolieren Sie den Durchgang 0 (p0) Fibroblasten und SCs, nachdem sie 90% Zusammenfluss erreicht haben.
8. Isolation und Kultur von SCs (Abbildung 1)
   1. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin (37 °C) pro 60 mm Petrischale hinzu, um die Zellen für 8-10 s bei Raumtemperatur zu verdauen. Danach fügen Sie 3 ml DMEM mit 10% FBS ergänzt, um die Verdauung zu stoppen.
   2. Die Mischung vorsichtig blasen, um die SCs mit einer Pipette zu lösen. Dann sammeln und zentrifugieren Sie die SCs bei 800 x g für 5 min.
   3. Den Überstand entsorgen und den Niederschlag in 3 ml DMEM mit 10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 2 'M Forskolin und 10 ng/mL HRG aussetzen und dann die Zellen in unbeschichteter 60 mm Petrischale impfen. Nach der Kultivierung bei 37 °C für 30-45 min werden die Fibroblasten (einige Fibroblasten werden mit SCs verdaut) an der Unterseite der Schale befestigt.
   4. Übertragen Sie den Überstand (einschließlich der SCs) für 2 Tage auf eine andere Poly-L-Lysin (PLL)-beschichtete mittlere Schale und Kultur bei 37 °C.
9. Isolation und Kultur von Fibroblasten (Abbildung 1)
   1. Nach dem Entfernen der SCs (wie in Schritt 1.8 gezeigt) die restlichen Fibroblasten in den Schüsseln mit 1x PBS waschen und dann 1 ml 0,25% (w/v) Trypsin hinzufügen, um die Fibroblasten 2 min bei 37 °C zu verdauen.
   2. Fügen Sie DMEM ergänzt mit 10% FBS, um die Verdauung zu beenden. Blasen Sie die Fibroblasten mit einer Pipette, und zentrifugieren Sie sie dann bei 800 x g für 5 min.
   3. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie den Niederschlag mit 2 ml DMEM mit 10% FBS aus und impfen Sie dann die Zellen in einer unbeschichteten 60 mm Petrischale. Die Fibroblasten nach der Kultivierung für 30-45 min bei 37 °C an der Unterseite der Schale befestigen. Entsorgen Sie den Überstand (einschließlich einiger SCs). Dann fügen Sie 3 ml DMEM mit 10% FBS in die Fibroblasten Schale und Kultur bei 37 °C für 2 Tage.
10. Durchfahrt der p1-Zellen, bis sie 90% Zusammenfluss erreichten. Reinigen Sie sie dann wieder durch Differentialverdauung und Differentialhaftung, wie in den Abschnitten 1.8 und 1.9 beschrieben.
11. Verdauen Sie die p2-Fibroblasten und SCs nach der Kultivierung für 2 Tage, und sammeln Sie dann die Zellen, zählen und impfen in 1 x 10⁵ Zahlen/gut auf PLL-beschichteten Dias für die Immunzytochemie (ICC).

2. ICC zur Identifizierung der Zellreinheit

1. Kultur die Zellen für 24 h bei 37 °C und ICC Färbung nach Differentialverdauung und Differentialhaftung von motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs durchführen.
2. Waschen Sie die motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs mit 1x PBS und fixieren Sie sie in 200 l/Well von 4% Paraformaldehyd (pH 7.4) für 18 min bei Raumtemperatur.
3. Blockieren Sie die Proben-SCs mit Sperrpuffer (0,1% Triton X-100 in 0,01 M PBS mit 5% Ziegenserum) und blockieren Sie die Proben-Fibroblasten mit Sperrpuffer (0,01 M PBS mit 5% Ziegenserum) für 45 min bei 37 °C nach dem Waschen mit PBS dreimal.
4. Entfernen Sie den Sperrpuffer und inkubieren Sie ihn mit den folgenden primären Antikörpern: Maus monoklonaler Anti-CD90-Antikörper (ein spezifischer Marker für Fibroblasten) (1:1000) für Fibroblasten und Maus-Anti-S100-Antikörper (ein spezifischer Marker für SCs) (1:400) für SCs bei 4 °C über Nacht.
5. Entsorgen Sie die primären Antikörper, waschen Sie sie dreimal mit PBS und inkubieren Sie sie mit den folgenden sekundären Antikörpern: Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Maus-IgG (1:400) für Fibroblasten und 488-konjugiertes Ziegenanti-Maus-IgG (1:400) für SCs bei Raumtemperatur für 1,5 h.
6. Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS, und färben Sie die Kerne mit 5 'g/mL Hoechst 33342 Farbstoff für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Probe dreimal mit 1x PBS und montieren Sie sie mit dem Montagemedium (20 l/Rutsche) auf dem Glasschlitten.
7. Nehmen Sie die Zellfotos mit dem konfokalen Laserscanning-Mikroskop in drei zufälligen Feldern für jeden Brunnen auf. Bewerten Sie die Gesamtzahl der Kerne und CD90-positiven Zellen, S100-positive Zellen, und berechnen Sie dann den Prozentsatz der CD90-positiven Zellen bzw. S100-positiven Zellen. Führen Sie die Färbung in dreifacher Ausführung durch.

3. Durchflusszytometrie-Analyse (FCA) zur Identifizierung der Zellreinheit

1. Bewerten Sie die Reinheit von motorischen und sensorischen Fibroblasten und SCs, wie zuvor von FCA¹⁶beschrieben. Kurz gesagt, verdauen Sie die p2-Motor und sensorische Fibroblasten und SCs mit 0,25% (w/v) Trypsin, setzen Sie die Zellpellets wieder auf und inkubieren Sie sie in Fixationsmedium bei Raumtemperatur für 15 min.
2. Inkubieren Sie die Zellen mit Permeabilisationsmedium und Sonde mit Mausmonoklonen-Anti-CD90-Antikörper (0,1 g/10⁶ Zellen, 200 l) für Fibroblasten und Maus-Anti-S100-Antikörper (1:400, 200 l) für SCs bei Raumtemperatur für 30 min.
3. Inkubieren Sie die Zellen mit 488-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG für 30 min. Verwenden Sie das KALIBER FACS, um die Durchflusszytometrie durchzuführen und die Daten mit der Cell Quest-Software zu analysieren.
4. Inkubieren Sie die Zellen nur mit 488-konjugierter Ziege Anti-Maus-IgG (Fibroblasten-Gruppe) und Maus IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype-Steuerung (SCs-Gruppe), die als Negativkontrolle dient.

4. Statistische Analyse

1. Präsentieren Sie alle Daten als Mittel - SEM. Bewerten Sie statistische Unterschiede in den Daten durch ungepaarten t-Testmit GraphPad Prism 6.0. Legen Sie die statistische Signifikanz auf p<0.05 fest. Führen Sie alle Assays in dreifacher Ausführung durch.

Ergebnisse

Leichte mikroskopische Beobachtung
Die SCs und Fibroblasten sind die beiden Hauptzellpopulationen, die in der primären Zellkultur aus Nervengeweben gewonnen werden. Nach der Impfung für 1 h, die meisten der Zellen an der Unterseite der Schale haften, und die Zellmorphologie änderte sich von rund zu oval. Nach der Kultivierung für 24 h zeigten die SCs eine bipolare oder tripolare Morphologie, deren Länge zwischen 100 und 200 m lag. Nach 48 h kam es zu Aggregation u...

Diskussion

Zu den beiden Hauptzellpopulationen peripherer Nerven gehörten SCs und Fibroblasten. Die hauptsächlich kultivierten Fibroblasten und SCs können bei der Modellierung der Physiologie von Fibroblasten und SCs während der peripheren Nervenentwicklung und -regeneration genau helfen. Die Studie zeigte, dass P7-Ratten-Schitik-Nervenzellen etwa 85% der S100-positiven SCs, 13% der OX7-positiven Fibroblasten und nur 1,5% der OX42-positiven Makrophagen¹³enthielten. Obwohl die Anzahl der Fibroblasten klei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Life Technologies	A11005	Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-1	Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
Cell Quest software	Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Dissecting microscope	Olympus	SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium	Abcam	ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium	Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD	GAS005
Flow cytometry	Becton Dickinson Biosciences	FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control	Abcam	ab106163	Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody	Abcam	ab225	Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody	Abcam	ab212816	Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)	Sigma	P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein	R&D Systems	396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin	Gibco	25200-072