체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화

요약

여기서는 체외에서 감각 및 운동 신경에서 섬유아세포와 슈완 세포를 정화하는 방법을 제시합니다.

초록

말초 신경계의 주요 세포는 슈완 세포 (SCs) 및 섬유 아세포입니다. 이 세포 는 신경 성 위축인 유전자 발현 및 기타 생물학적 과정의 다른 패턴에 관여하는 감각 및 운동 표현형을 뚜렷하게 표현하여 신경 재생에 영향을 미칩니다. 본 연구는 고도로 정제된 쥐 감각및 운동 SCs 및 섬유아세포를 더 빠르게 얻기 위한 프로토콜을 설치했습니다. 신생아 쥐(7일)의 복부 근루(motor nerve)와 등쪽 뿌리(감각신경)는 4-5일 동안 배양되었고, 이어서 감각및 운동 섬유아세포 및 SC의 분리를 순차적으로 결합하였다. 면역 세포화학 및 유동 세포측정 분석 의 결과는 감각및 운동 SCs 및 섬유아세포의 순도가 >90%였다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 많은 수의 감각 및 운동 섬유아세포/SC를 더 빠르게 획득하는 데 사용될 수 있으며, 이는 감각 및 운동 신경 재생의 탐사에 기여합니다.

서문

말초 신경계에서, 신경 섬유는 주로 축축산, 슈완 세포 (SC) 및 섬유 아세포로 구성되며, 또한 소량의 대식세포, 미세 혈관 내피 세포 및 면역 세포^1을포함합니다. SC는 축축을 1:1 비율로 감싸고 엔도뉴리움이라고 하는 결합 조직 층에 의해 동봉됩니다. 축삭은 매심이라고 불리는 단을 형성하기 위하여 그 때 함께 묶이고, 각 근막은 회음관으로 알려져 있는 결합 조직 층으로 싸여 있습니다. 마지막으로, 전체 신경 섬유는 에피뇌란이라고 불리는 결합 조직의 층으로 싸여 있습니다. 엔도뉴리움에서, 전체 세포 인구는 48% SC로 이루어져 있고, 나머지 세포의 상당 부분은 섬유아세포^2를포함한다. 더욱이, 섬유아세포는 에피뇌리움, 회음관 및 엔도뉴리움^3을포함한 모든 신경 구획의 중요한 구성 요소입니다. 많은 연구는 SC와 섬유 아세포가 말초 신경 부상^후재생 과정에서 중요한 역할을 한다는 것을 지적했다^4,5,,6. 말초 신경의 편부 후, 천동맥 섬유아세포는 SC와 섬유아세포 사이의 에클레인-B/EphB2 신호 전달 경로를 통해 세포 분류를 조절하여 상처^5를통해 축축재를 더욱 안내한다. 말초 신경 섬유아세포는 테나신-C 단백질을 분비하고 β1-integrin 신호 전달 경로를 통해 신경 재생 중 SC의 이동을^{향상시킨다 7.} 그러나, 위의 연구에서 사용된 SCs및 섬유아세포는 감각과 운동 신경을 모두 포함하는 상골 신경에서 파생되었습니다.

말초 신경계에서 감각 신경(afferent neuros)은 수용체에서 중추 신경계(CNS)까지 감각 신호를 실시하며, 모터 신경(efferent nerves)은 CNS에서 근육으로 신호를 전한다. 이전 연구는 SC가 뚜렷한 모터 및 감각 표현형을 표현하고 말초 신경^재생을지원하기 위하여 신경 영양인을 분비한다는 것을^8,9를표시했습니다. 최근 연구에 따르면, 섬유아세포는 또한 다른 모터와 감각 표현형을 표현하고 SC^10의이동에 영향을 미친다. 따라서, 모터와 감각 신경 섬유아세포/SC 간의 차이의 탐구는 말초 신경 특정 재생의 복잡한 근본적인 분자 메커니즘을 연구할 수 있게 해줍니다.

현재, 항체 매개 세포분석^11,,12,순차면역파닝¹³ 및 라미닌 서브스트라툼(14)의 적용을 포함하여 SC 및 섬유아세포를 정화하는 여러 가지 방법이 있다.¹⁴ 그러나, 위의 모든 방법은 섬유아세포를 제거하고 SC만 보존합니다. 고도로 정제된 SC 및 섬유아세포는 유동 세포측정 선별^{기술(15)에}의해 얻어질 수 있지만, 시간이 많이 소요되고 비용이 많이 드는 기술이다. 따라서, 본 연구에서는, 많은 수의 섬유아세포와 SC를 더 빠르게 얻기 위해 감각과 운동 신경 섬유아세포 및 SC를 정화및 분리하기 위한 간단한 차동 소화 및 차분 준수 방법이 개발되었다.

프로토콜

이 연구는 난통 대학의 제도적 동물 관리 지침에 따라 수행되었다. 동물 과목을 포함한 모든 절차는 중국 장쑤성 실험동물 관리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 모터 및 감각 신경 섬유아세포 및 SC의 격리 및 문화

1. 중국 난통 대학의 실험 동물 센터에서 제공하는 7일 된 스프라그-Dawley(SD) 쥐(n=4)를 사용하십시오. 쥐를 5% 이소플루란을 함유한 탱크에 2-3분 동안 놓고, 동물이 천천히 숨을 쉬고 독립적인 활동이 없는 다음, 참수 전에 75%의 에탄올을 사용하여 소독합니다.
2. 가위를 사용하여 뒤쪽 피부를 약 3cm 동안 자르고 척추를 제거하십시오. 척수를 노출하기 위해 신중하게 척추 운하를 엽니 다.
3. 60mm 페트리 접시에 2-3mL의 얼음 차가운 D-행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 척수를 유지합니다.
4. 해부학 적 구조에 기초하여, 해부 현미경에서 복부 뿌리 (모터 신경)와 다음 등대 뿌리 (감각 신경)를 소비한다. 다음으로, 얼음 차가운 D-행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)에 넣습니다.
5. HBSS를 제거한 후, 신경을 가위로 3-5mm 조각으로 자르고 18-20 분 동안 37 °C에서 0.25 %(w /v) 트립신으로 소화하십시오. 다음으로, 소화를 막기 위해 10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유한 DMEM3-4mL로 보충한다.
6. 혼합물을 약 10회 위아래로 부드럽게 피펫하고 원심분리기는 800 x g에서 5분간 피펫을 합니다. 그 후, 상체를 버리고 10 % FBS로 보충 DMEM의 2-3 mL에서 침전을 중단합니다.
7. 400 메쉬 필터를 사용하여 셀 서스펜션을 필터링한 다음, 5% CO_2의존재시 37°C에서 60mm 페트리 접시 및 배양으로 세포를 접종한다. 배양 4-5일 후, 90%에 도달한 후 0(p0) 섬유아세포 및 SC를 분리한다.
8. SC의 격리 및 문화(그림 1)
   1. 1x PBS를 사용하여 세포를 한 번 씻으시면 됩니다. 60mm 페트리 접시당 0.25%(w/v) 트립신(37°C)의 1mL을 추가하여 실온에서 8-10s의 세포를 소화합니다. 그 후, 추가 3 DMEM의 mL 10% FBS 소화를 중지.
   2. 혼합물을 부드럽게 날려 서 파이펫으로 SC를 분리합니다. 그런 다음 5 분 동안 800 x g에서 SC를 수집하고 원심 분리합니다.
   3. 상체를 버리고 10% FBS, 1% 페니실린/연쇄상구, 2 μM 포스콜린 및 10 ng/mL HRG로 DMEM의 3mL에서 침전을 중단한 다음, 코팅되지 않은 60mm 페트리 접시로 세포를 접종한다. 30-45분 동안 37°C에서 배양한 후 섬유아세포(몇 가지 섬유아세포가 SC로 소화)를 접시 바닥에 부착합니다.
   4. 상체(SC 포함)를 다른 폴리 L-리신(PLL)-코팅 된 중간 접시 및 배양에 2 일 동안 37 °C로 옮김한다.
9. 섬유아세포의 격리 및 배양(도 1)
   1. SC를 제거한 후(1.8단계와 같이) 1x PBS로 접시에 남은 섬유아세포를 세척한 다음 트립신 1mL을 추가하여 37°C에서 2분 동안 섬유아세포를 소화합니다.
   2. 소화를 종료하려면 10% FBS로 보충된 DMEM을 추가합니다. 파이펫을 사용하여 섬유아세포를 날려 버리고 수집하여 원심분리기를 800 x g에서 5분 동안 수집합니다.
   3. 상체를 버리고, 10% FBS를 함유하는 DMEM의 2mL로 침전을 중단한 다음, 코팅되지 않은 60mm 페트리 접시에서 세포를 접종한다. 37°C에서 30-45분 동안 배양한 후 섬유아세포가 접시의 바닥에 부착한다. 상체(몇 가지 수의 SC 포함)를 폐기합니다. 그런 다음 2 일 동안 37 °C에서 섬유 아세포 접시 및 문화에 10 % FBS로 보충 된 DMEM 3 mL을 추가합니다.
10. p1 세포를 90%의 합류에 도달할 때까지 통과합니다. 그런 다음 1.8 및 1.9 섹션에 설명된 대로 차동 소화 및 차동 준수로 다시 정화합니다.
11. 2 일 동안 배양 한 후 p2 섬유 아세포 및 SC를 소화 한 다음 세포를 수집, 카운트 및 면역 세포 화학 (ICC)에 대한 PLL 코팅 슬라이드에 1 x 10⁵ 숫자 / 잘 접종.

2. 세포 순도의 식별을위한 ICC

1. 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하고 모터 및 감각 섬유아세포 및 SC의 차동 소화 및 차동 준수 후 ICC 염색을 수행한다.
2. 모터와 감각 섬유아세포 및 SC를 1x PBS로 세척하고 실온에서 18분 동안 4% 파라포름데히드(pH 7.4)의 200 μL/well에서 수정합니다.
3. 블로킹 버퍼(0.1% 트리톤 X-100 in 0.01 M PBS의 5% 염소 세럼 포함)로 시료 섬유아세포(0.01 M PBS 포함 5% 염소 세럼 포함)를 PBS 세이미로 세척한 후 37°C에서 45분 동안 차단 버퍼로 시료 섬유아스트를 차단한다.
4. 차단 버퍼를 제거하고 다음 1 차 항체로 배양하십시오 : 마우스 단일 클론 항 CD90 항체 (섬유 아세포에 대한 특정 마커) (1:1000) 섬유 아세포 및 마우스 항 S100 항체 (SC에 대한 특정 마커) (1:400) 4 °C에서 하룻밤 사이에 SCs에 대한.
5. 1차 항체를 버리고, PBS 세 번 세척하고, 다음 이차 항체와 함께 배양하십시오: 알렉사 플루어 594 염소 항마우스 IgG (1:400) 섬유아세포용 및 488-공주 염소 항마우스 IgG (1:400) 실온에서 SCs용 1.5 h.
6. 샘플을 PBS로 세 번 세척하고 실온에서 10 분 동안 5 μg / mL Hoechst 33342 염료로 핵을 얼룩지게하십시오. 1x PBS로 샘플을 세 번 세척하고 유리 슬라이드에 장착 매체 (20 μL / 슬라이드)를 사용하여 장착하십시오.
7. 각 웰에 대한 세 임의의 필드에 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 셀 사진을 촬영합니다. 총 핵 및 CD90 양성 세포, S100 양성 세포의 수를 평가한 다음 CD90 양성 세포 및 S100 양성 세포의 백분율을 각각 계산합니다. 삼중에서 염색을 수행합니다.

3. 세포 순도의 식별을 위한 유동 세포 분석(FCA)

1. FCA^16에의해 이전에 설명된 바와 같이 모터 및 감각 섬유아세포 및 SC의 순도를 평가한다. 간략하게, p2 모터와 감각 섬유아세포 및 SC를 0.25%(w/v) 트립신으로 소화하고, 세포 펠릿을 재일시 중단하고 15분 동안 실온에서 고정 매체로 배양한다.
2. 섬유아세포 및 마우스 항S100 항체(1:400, 200 μL)를 위해 마우스 단클론 항체(0.1 μg/10^6세포, 200 μL)를 사용하여 충류 배지 및 프로브로 세포를 배양하여 30분 동안 실온에서 SC용으로 배양한다.
3. 488-접합 염소 안티 마우스 IgG로 세포를 30 분 동안 배양. FACS 구경을 사용하여 흐름 세포 측정을 수행하고 셀 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하십시오.
4. 488-접합 염소 안티 마우스 IgG (섬유 아세포 그룹) 및 마우스 IgG1 카파 [MOPC-21] (FITC) - 등형 제어 (SCs 그룹)로만 세포를 배양하여 부정적인 대조군역할을합니다.

4. 통계 분석

1. 모든 데이터를 의미 ±SEM으로 제시합니다. t p&0.05에서 통계적 유의성 설정. p 트리플리케이트로 모든 에세이를 수행합니다.

결과

가벼운 현미경 관찰
SCs와 섬유아세포는 신경 조직에서 1차 세포 배양에서 얻어진 2개의 주요 세포 집단입니다. 1h 접종 후 대부분의 세포가 접시의 바닥에 부착되고 세포 형태가 둥글고 타원형으로 변경되었습니다. 24시간 배양 후, SC는 양극성 또는 삼극성 형태를 나타내었고, 이들의 길이는 100에서 200 μm 사이입니다. 48 h 후, 세포의 집계 및 증식이 발생, 많?...

토론

말초 신경의 2개의 중요한 세포 인구는 SCs와 섬유아세포를 포함했습니다. 주로 배양 된 섬유 아세포 및 SC는 말초 신경 발달 및 재생 중에 섬유 아세포 및 SC의 생리학모델링을 정확하게 지원할 수 있습니다. 연구 결과는 P7 쥐 sciatic 신경 세포가 S100 양성 SCs의 대략 85%, OX7 양성 섬유세포의 13% 및 OX42 양성 대식세포의 단지 1.5%를 포함하는 것을 보여주었습니다^13. 섬유아세포의 수는 S...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Life Technologies	A11005	Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-1	Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
Cell Quest software	Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Dissecting microscope	Olympus	SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium	Abcam	ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium	Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD	GAS005
Flow cytometry	Becton Dickinson Biosciences	FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control	Abcam	ab106163	Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody	Abcam	ab225	Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody	Abcam	ab212816	Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)	Sigma	P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein	R&D Systems	396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin	Gibco	25200-072