Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro

Resumo

Aqui, apresentamos um método para purificar fibroblastos e células Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro.

Resumo

As principais células do sistema nervoso periférico são as células Schwann (SCs) e os fibroblastos. Ambas as células expressam claramente os fenótipos sensoriais e motores envolvidos em diferentes padrões de expressão genética de fator neurotrófico e outros processos biológicos, afetando a regeneração nervosa. O presente estudo estabeleceu um protocolo para obter SCs sensoriais e motores de ratos altamente purificados e mais rapidamente. A raiz ventral (nervo motor) e a raiz dorsal (nervo sensorial) de ratos neonatais (7 dias de idade) foram dissociadas e as células foram cultivadas por 4-5 dias, seguidas pelo isolamento de fibroblastos sensoriais e motores e SCs, combinando métodos diferenciais de digestão e adesão diferencial sequencialmente. Os resultados das análises de imunocytoquímica e citometria de fluxo mostraram que a pureza das SCs sensoriais e motoras e dos fibroblastos foi de >90%. Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de fibroblastos/SCs sensoriais e motores mais rapidamente, contribuindo para a exploração da regeneração sensorial e do nervo motor.

Introdução

No sistema nervoso periférico, as fibras nervosas consistem principalmente de axônios, células schwann (SCs) e fibroblastos, e também contém um pequeno número de macrófagos, células endoteliais microvasculares e células imunes¹. Os SCs envolvem os axônios em uma proporção de 1:1 e são fechados por uma camada de tecido conjuntivo chamada endoneurium. Os axônios são então empacotados para formar grupos chamados fascicles, e cada fascículo é envolto em uma camada de tecido conjuntivo conhecida como perineúrio. Finalmente, toda a fibra nervosa é envolta em uma camada de tecido conjuntivo, que é denominada como epineurium. No endônio, toda a população celular é composta por 48% de SCs, e uma parte substancial das células remanescentes envolve fibroblastos². Além disso, os fibroblastos são componentes importantes de todos os compartimentos nervosos, incluindo o epineurium, o perineúrio e o endônio³. Muitos estudos indicaram que as SCs e os fibroblastos desempenham um papel crucial no processo de regeneração após as lesões nervosas periféricas^4,,5,6. Após a transeção do nervo periférico, os fibroblastos perineurial regulam a classificação celular através da via de sinalização efrinina-B/EphB2 entre SCs e fibroblastos, orientando ainda mais o recrescimento axonal através das feridas⁵. Os fibroblastos nervosos periféricos secretam a proteína tenascin-C e aumentam a migração de SCs durante a regeneração nervosa através da via de sinalização β1-integrin⁷. No entanto, os SCs e os fibroblastos utilizados nos estudos acima foram derivados do nervo ciático, que inclui nervos sensoriais e motores.

No sistema nervoso periférico, os nervos sensoriais (nervos aferentes) conduzem sinalização sensorial dos receptores para o sistema nervoso central (SNC), enquanto os nervos motores (nervos eferentes) conduzem sinais do SNC aos músculos. Estudos anteriores indicaram que as SCs expressam fenótipos motores e sensoriais distintos e secretam fatores neurotróficos para suportar a regeneração nervosa periférica^8,,9. De acordo com um estudo recente, os fibroblastos também expressam diferentes fenótipos motores e sensoriais e afetam a migração das SCs¹⁰. Assim, a exploração das diferenças entre fibroblastos/SCs motores e nervosos sensoriais nos permite estudar os complicados mecanismos moleculares subjacentes da regeneração específica do nervo periférico.

Atualmente, existem muitas maneiras de purificar SCs e fibroblastos, incluindo a aplicação de agentes antimitóticos, citolise mediada por anticorpos^11,,12, imunopanning sequencial¹³ e substrato de laminina¹⁴. No entanto, todos os métodos acima removem fibroblastos e preservam apenas os SCs. SCs e fibroblastos altamente purificados podem ser obtidos pela tecnologia de classificação de citometria de fluxo^15,mas é uma técnica demorada e cara. Assim, neste estudo, foi desenvolvido um método simples de digestão diferencial e adesão diferencial para purificar e isolar fibroblastos sensoriais e motores e SCs, a fim de obter um grande número de fibroblastos e SCs mais rapidamente.

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as Diretrizes Institucionais de Cuidados Com Animais da Universidade de Nantong. Todos os procedimentos, incluindo os animais, foram eticamente aprovados pelo Comitê de Administração de Animais Experimentais, província de Jiangsu, China.

1. Isolamento e cultura de fibroblastos motores e sensoriais e SCs

1. Use ratos esponjosos de sete dias de idade (SD) fornecidos pelo Centro Animal Experimental da Universidade de Nantong da China. Coloque os ratos em um tanque contendo 5% de isoflurane por 2-3 minutos, permita que os animais respirem lentamente e não tenham atividade independente e, em seguida, higienize usando 75% de etanol antes da decapitação.
2. Use uma tesoura para cortar a pele traseira por cerca de 3 cm e remover a coluna vertebral. Abra o canal vertebral cuidadosamente para expor a medula espinhal.
3. Mantenha a medula espinhal em uma placa de Petri de 60 mm com 2-3 mL de solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).
4. Com base na estrutura anatômica, extirve a raiz ventral (nervo motor) e, em seguida, a raiz dorsal (nervo sensorial) sob um microscópio dissecando. Em seguida, coloque-os em uma solução de sal balanceada D-Hanks (HBSS).
5. Depois de remover o HBSS, corte os nervos em pedaços de 3-5 mm com tesoura e digerir com 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin a 37 °C por 18-20 min. Em seguida, suplemento com 3-4 mL de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) para parar a digestão.
6. Pipeta a mistura para cima e para baixo suavemente cerca de 10 vezes e centrífuga a 800 x g por 5 min. Depois disso, descarte o supernasal e suspenda o precipitado em 2-3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS.
7. Filtre a suspensão da célula usando um filtro de malha de 400 e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm e cultura a 37 °C na presença de 5% de CO₂. Após 4-5 dias de cultivo, isole a passagem 0 (p0) de fibroblastos e SCs após atingir 90% de confluência.
8. Isolamento e cultura das SCs (Figura 1)
   1. Lave as células uma vez usando 1x PBS. Adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trippsina (37 °C) por placa de Petri de 60 mm para digerir as células para 8-10 s em temperatura ambiente. Depois disso, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS para parar a digestão.
   2. Sopre suavemente a mistura para separar os SCs com uma pipeta. Em seguida, colete e centrifuge os SCs a 800 x g por 5 min.
   3. Descarte o supernasciante/estreptomicina, 2 μM forskolin e 10 ng/mL HRG, e depois inocula as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Depois de culminar a 37 °C por 30-45 min, os fibroblastos (um número de fibroblastos são digeridos com SCs) anexam ao fundo do prato.
   4. Transfira o supernasciente (incluindo os SCs) para outro prato médio revestido de poli-L(PLL) e cultura a 37 °C por 2 dias.
9. Isolamento e cultura de fibroblastos (Figura 1)
   1. Depois de remover os SCs (como mostrado na etapa 1.8), lave os fibroblastos restantes nos pratos com 1x PBS e, em seguida, adicione 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin para digerir os fibroblastos por 2 min a 37 °C.
   2. Adicione DMEM suplementado com 10% de FBS para acabar com a digestão. Exploda os fibroblastos usando uma pipeta, e depois colete e centrifuge-os a 800 x g por 5 min.
   3. Descarte o supernasce, suspenda o precipitado com 2 mL de DMEM contendo 10% de FBS e, em seguida, inocular as células em placa de Petri de 60 mm não revestida. Os fibroblastos após a colheita por 30-45 min a 37 °C anexam ao fundo do prato. Descarte o supernatante (incluindo alguns números de SCs). Em seguida, adicione 3 mL de DMEM suplementado com 10% de FBS no prato e cultura dos fibroblastos a 37 °C por 2 dias.
10. Passagem das células p1 até atingirem 90% de confluência. Em seguida, purificá-los por digestão diferencial e adesão diferencial novamente como descrito nas seções 1.8 e 1.9.
11. Digerir os fibroblastos p2 e SCs após a colheita por 2 dias e, em seguida, coletar as células, contar e inocular em 1 x 10⁵ números/bem em lâminas revestidas de PLL para imunocitoquímica (ICC).

2. ICC para identificação da pureza celular

1. Cultuize as células por 24h a 37 °C e realize a coloração do ICC após digestão diferencial e adesão diferencial de fibroblastos motor e sensoriais e SCs.
2. Lave os fibroblastos motor e sensorial e os SCs com 1x PBS e fixe-os em 200 μL/well de 4% de paraformaldeído (pH 7.4) por 18 minutos à temperatura ambiente.
3. Bloqueie os SCs amostrais com tampão de bloqueio (0,1% Triton X-100 em 0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) e bloqueie os fibroblastos amostrais com tampão de bloqueio (0,01 M PBS contendo 5% de soro de cabra) por 45 min a 37 °C depois de lavá-los com PBS três vezes.
4. Remova o tampão de bloqueio e incuba com os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (um marcador específico para fibroblastos) (1:1000) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (um marcador específico para SCs) (1:400) para SCs a 4 °C durante a noite.
5. Descarte os anticorpos primários, lave com PBS três vezes e incuba com os seguintes anticorpos secundários: Alexa Fluor 594 igG anti-rato de cabra (1:400) para fibroblastos e IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 (1:400) para SCs à temperatura ambiente por 1,5 h.
6. Lave as amostras três vezes com PBS e manche os núcleos com 5 μg/mL Hoechst 33342 de corante por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave a amostra com 1x PBS três vezes e monte-as usando o meio de montagem (20 μL/slide) na lâmina de vidro.
7. Tire as fotografias celulares pelo microscópio de varredura a laser confocal em três campos aleatórios para cada poço. Avalie o número total de núcleos e células CD90 positivas, células S100 positivas e, em seguida, calcule a porcentagem de células CD90 positivas e células S100 positivas, respectivamente. Realize a coloração em triplicado.

3. Análise da citometria de fluxo (FCA) para identificação da pureza celular

1. Avalie a pureza dos fibroblastos motor e sensoriais e dos SCs, conforme descrito anteriormente pela FCA¹⁶. Brevemente, digerir os fibroblastos motor e sensorial P2 e SCs com trippsina de 0,25%, resuspensar as pelotas celulares e incubar-as em meio de fixação à temperatura ambiente por 15 minutos.
2. Incubar as células com meio de permeabilização e sonda utilizando anticorpo anti-CD90 monoclonal do rato (0,1 μg/10⁶ células, 200 μL) para fibroblastos e anticorpos anti-S100 do rato (1:400, 200 μL) para SCs à temperatura ambiente por 30 min, respectivamente.
3. Incubar as células com IgG anti-rato de cabra conjugado de 488 por 30 minutos. Use o calibre FACS para realizar a citometria de fluxo e analise os dados usando o software Cell Quest.
4. Incubar as células apenas com IgG anti-rato de cabra conjugada de 488 (fibroblastos Group) e mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Controle de isótipo (grupo SCs), que serve como controle negativo.

4. Análise estatística

1. Apresentar todos os dados como meio ± SEM. Avaliar diferenças estatísticas nos dados por t-testenão pago usando GraphPad Prism 6.0. Definir significância estatística em p<0,05. Realize todos os ensaios em triplicado.

Resultados

Observação microscópica leve
As SCs e os fibroblastos são as duas principais populações celulares obtidas na cultura celular primária a partir de tecidos nervosos. Após a inoculação por 1h, a maioria das células aderiu ao fundo do prato, e a morfologia celular mudou de redonda para oval. Após a colheita por 24 h, os SCs apresentaram uma morfologia bipolar ou tripolar e o comprimento destes variou de 100 a 200 μm. Após 48 h, ocorreu a agregação e prolife...

Discussão

As duas principais populações celulares de nervos periféricos incluíam SCs e fibroblastos. Os fibroblastos e SCs principalmente cultivados podem auxiliar com precisão na modelagem da fisiologia de fibroblastos e SCs durante o desenvolvimento e regeneração do nervo periférico. O estudo mostrou que as células nervosas ciáticas de ratos P7 continham cerca de 85% das SCs S100-positivas, 13% dos fibroblastos OX7 positivos e apenas 1,5% dos macrófagos OX42 positivos¹³. Embora o número de fib...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Life Technologies	A11005	Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-1	Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
Cell Quest software	Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Dissecting microscope	Olympus	SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium	Abcam	ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium	Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD	GAS005
Flow cytometry	Becton Dickinson Biosciences	FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control	Abcam	ab106163	Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody	Abcam	ab225	Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody	Abcam	ab212816	Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)	Sigma	P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein	R&D Systems	396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin	Gibco	25200-072