Fibroblastların ve Schwann Hücrelerinin İn vitro duyusal ve motor sinirlerden arındırması

Özet

Burada, fibroblastlar ve Schwann hücrelerini in vitro olarak duyusal ve motor sinirlerden arındırmak için bir yöntem salıyoruz.

Özet

Periferik sinir sistemindeki başlıca hücreler Schwann hücreleri (SCs) ve fibroblastlardır. Her iki hücre de sinir rejenerasyonunu etkileyen nörotrofik faktör gen ekspresyonu ve diğer biyolojik süreçlerin farklı desenlerinde yer alan duyusal ve motor fenotipleri belirgin bir şekilde ifade eder. Bu çalışma, yüksek oranda saflaştırılmış sıçan duyusal ve motor SC'leri ve fibroblastları daha hızlı elde etmek için bir protokol oluşturmuştur. Yenidoğan sıçanlarının ventral kökü (motor sinir) ve dorsal kökü (duyusal sinir) ayrıştırıldı ve hücreler 4-5 gün boyunca kültürlendi, ardından ayırıcı sindirim ve diferansiyel yapışma yöntemlerini sırayla birleştirerek duyusal ve motor fibroblastlar ve SC'lerin izolasyonu yapıldı. İmmünositokimya ve akış sitometrisi analizlerinin sonuçları duyusal ve motor SC'lerin ve fibroblastların saflığının %gt;90 olduğunu gösterdi. Bu protokol duyusal ve motor sinir rejenerasyonu keşfine katkıda, duyusal ve motor fibroblastlar / SCs çok sayıda elde etmek için kullanılabilir.

Giriş

Periferik sinir sisteminde, sinir lifleri esas olarak akson oluşur, Schwann hücreleri (SCs), ve fibroblastlar, ve aynı zamanda makrofajlar az sayıda içerir, mikrovasküler endotel hücreleri, ve bağışıklık hücreleri¹. SC'ler aksonlar1:1 oranında sarılır ve endoneurium adı verilen bağ dokusu tabakası ile çevrilidir. Aksonlar daha sonra fasikül adı verilen gruplar oluşturmak için bir araya toplanır ve her fasikül perineurium olarak bilinen bir bağ dokusu tabakasına sarılır. Son olarak, tüm sinir lifi bağ dokusu bir tabaka sarılır, hangi epineurium olarak denir. Endoneurium'da, tüm hücre popülasyonu %48'lik SC'lerden oluşur ve kalan hücrelerin²önemli bir kısmı fibroblastlar 2'dir. Ayrıca, fibroblastlar epineurium, perineurium ve endoneurium³dahil olmak üzere tüm sinir kompartmanlarının önemli bileşenleridir. Birçok çalışma, SCs ve fibroblastlar periferik sinir yaralanmaları sonra rejenerasyon sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir^4,5,6. Periferik sinirin ranzeksiyonundan sonra, perineurial fibroblastlar SC'ler ve fibroblastlar arasındaki efrin-B/EphB2 sinyal yolu üzerinden hücre sıralamasını düzenler, yaralar la aksonal yeniden büyümeye rehberlik eder⁵. Periferik sinir fibroblastları tenascin-C proteini salgılar ve β1-integrin sinyal^yolu7 ile sinir rejenerasyonu sırasında SC'lerin göçünü artırır. Ancak, yukarıdaki çalışmalarda kullanılan SCs ve fibroblastlar siyatik sinir türetilmiştir, hangi duyusal ve motor sinirler hem de içerir.

Periferik sinir sisteminde, duyusal sinirler (afferent sinirler) merkezi sinir sistemi (CNS) reseptörlerinden duyusal sinyal yapmak, motor sinirler (efferent sinirler) kaslara CNS sinyalleri ilerlerken. Önceki çalışmalar, SCs farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve periferik sinir rejenerasyon desteklemek için nörotrofik faktörler salgılar^{göstermiştir 8,9}. Yakın tarihli bir araştırmaya göre, fibroblastlar da farklı motor ve duyusal fenotipler ifade ve SCs göç etkiler¹⁰. Böylece, motor ve duyusal sinir fibroblastları/SC'leri arasındaki farkların araştırılması, periferik sinir spesifik rejenerasyonunun karmaşık altta yatan moleküler mekanizmalarını incelememizi sağlar.

Şu anda, antimitotik ajanların uygulanması da dahil olmak üzere, SCs ve fibroblastlar arındırmak için birçok yolu vardır, antikor aracılı sitoz^11,12, sıralı immünpanning¹³ ve laminin substratum¹⁴. Ancak, yukarıdaki tüm yöntemler fibroblastlar kaldırmak ve sadece SCs korumak. Yüksek saflaştırılmış SCs ve fibroblastlar akış sitometri sıralama teknolojisi¹⁵elde edilebilir , ama zaman alıcı ve pahalı bir tekniktir. Bu nedenle, bu çalışmada, duyusal ve motor sinir fibroblastları ve SC'leri daha hızlı bir şekilde elde etmek için basit bir diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık yöntemi geliştirilmiştir.

Protokol

Bu çalışma Nantong Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan denekleri de dahil olmak üzere tüm prosedürler etik Deneysel Hayvanlar, Jiangsu Eyaleti, Çin İdare Komitesi tarafından onaylandı.

1. Motor ve duyusal sinir fibroblastları ve SC'lerin izolasyonu ve kültürü

1. Çin Nantong Üniversitesi Deneysel Hayvan Merkezi tarafından sağlanan yedi günlük Sprague-Dawley (SD) sıçanlarını (n=4) kullanın. Sıçanları %5 izofluran içeren bir tanka 2-3 dakika yerleştirin, hayvanların yavaşça nefes almasına ve bağımsız bir aktivitesi olmamasına izin verin ve sonra kafa kesmeden önce %75 etanol kullanarak dezenfekte edin.
2. Yaklaşık 3 cm için arka deri kesmek ve omurilik kaldırmak için makas kullanın. Omuriliği ortaya çıkarmak için vertebrakanalını dikkatlice açın.
3. Omuriliği 60 mm'lik petri kabında 2-3 mL buz gibi d-Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile koruyun.
4. Anatomik yapıya dayanarak, ventral kök (motor sinir) ve daha sonra dorsal kök (duyusal sinir) bir diseksiyon mikroskop altında çıkarmak. Daha sonra, buz gibi d-Hanks 'dengeli tuz çözeltisi (HBSS) yerleştirin.
5. HBSS'yi çıkardıktan sonra sinirleri makasla 3-5 mm'ye bölün ve 1 mL %0,25 (w/v) tripsin ile 37 °C'de 18-20 dk. Daha sonra, sindirimi durdurmak için % 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 3-4 mL DMEM ile ek.
6. Pipet karışımı yavaşça yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı ve santrifüj 800 x g 5 dakika için. Bundan sonra, supernatant atın ve DMEM 2-3 mL% 10 FBS ile takviye çökelti askıya.
7. Hücre süspansiyonuna 400 örgü filtre kullanarak filtre uygulayın ve 60 mm Petri kabındaki hücreleri ve kültürü %5 CO₂varlığında 37 °C'de aşılamak. 4-5 günlük bir kültü nden sonra % 90 birleştiğinde 0 (p0) fibroblast ve SC'yi izole edin.
8. SC'lerin izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)
   1. Hücreleri 1x PBS kullanarak bir kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 8-10 s sindirmek için 60 mm Petri kabıbaşına %0,25 (w/v) tripsin (37 °C) 1 mL ekleyin. Bundan sonra, sindirimi durdurmak için % 10 FBS ile desteklenen 3 mL DMEM ekleyin.
   2. SC'leri pipetle ayırmak için karışımı hafifçe üfler. Daha sonra 5 dk için 800 x g'da SC'leri toplayın ve santrifüj edin.
   3. Supernatant atın ve% 10 FBS ile DMEM 3 mL çökelti askıya, 1% penisilin / streptomisin, 2 μM forskolin ve 10 ng / mL HRG, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri kabı. 37 °C'de 30-45 dakika küllettikten sonra, fibroblastlar (birkaç sayıda fibroblast SC ile sindirilir) yemeğin dibine bağlanır.
   4. Supernatant 'ı (SC'ler dahil) 37 °C'de başka bir poli-L-l-lizin (PLL) kaplamalı orta yemek ve kültüre 2 gün aktarın.
9. Fibroblastların izolasyonu ve kültürü (Şekil 1)
   1. SC'leri çıkardıktan sonra (adım 1.8'de gösterildiği gibi), kalan fibroblastları 1x PBS ile yıkayın ve daha sonra fibroblastları 37 °C'de 2 dk sindirmek için %0,25 (w/v) trypsin 1 mL ekleyin.
   2. Sindirimi sona erdirmek için %10 FBS ile desteklenen DMEM ekleyin. Bir pipet kullanarak fibroblastlar darbe ve sonra toplamak ve 5 dakika için 800 x g onları santrifüj.
   3. Süpernatant atın, % 10 FBS içeren DMEM 2 mL ile çökelti askıya, ve sonra kaplamasız hücreleri aşılamak 60 mm Petri çanak. 37 °C'de 30-45 dk.'da kültürden sonra fibroblastlar yemeğin dibine bağlanır. Supernatant atın (SCs birkaç sayı dahil). Daha sonra 37 °C'de fibroblastlar yemeğine ve kültürüne %10 FBS ile takviye edilmiş 3 mL DMEM ekleyin.
10. P1 hücrelerini %90'a ulaşana kadar iletin. Daha sonra bölüm 1.8 ve 1.9'da açıklandığı gibi diferansiyel sindirim ve diferansiyel bağlılık ile tekrar arındırın.
11. 2 gün boyunca kültürden sonra p2 fibroblastlar ve SCs sindirin ve sonra hücreleri toplamak, saymak ve 1 x 10⁵ sayı / iyi immünositokimya (ICC) için PLL kaplı slaytlar üzerinde.

2. Hücre saflığının belirlenmesi için ICC

1. 37 °C'de hücreleri 24 saat kültüre ve diferansiyel sindirim ve motor ve duyusal fibroblastlar ve SC'lerin diferansiyel yapışması sonrasında ICC boyama gerçekleştirin.
2. Motor ve duyusal fibroblastları ve SC'leri 1x PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 18 dakika boyunca %4 paraformaldehit (pH 7.4) 200 μL/iyi olarak düzeltin.
3. Numune SC'lerini bloke edici tamponile (%0,1 Triton X-100% 0,01 M PBS içinde %5 keçi serumu içeren) bloke edin ve numune fibroblastlarını %5 keçi serumu içeren blokajlı (%5 keçi serumu içeren 0,01 M PBS) 37 °C'de 45 dk'da PBS üç kez yıkayarak engelleyin.
4. Engelleme tamponunu çıkarın ve aşağıdaki birincil antikorlarla kuluçkaya yatın: fare monoklonal anti-CD90 antikor (fibroblastlar için özel bir belirteç) (1:1000) fibroblastlar ve fare anti-S100 antikorları (SC'ler için özel bir belirteç) (1:400) gecede 4 °C'de SC'ler için.
5. Birincil antikorları atın, PBS ile üç kez yıkayın ve aşağıdaki ikincil antikorlarla kuluçkaya yatın: Fibroblastlar için Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG (1:400) ve 488 konjuge keçi anti-fare IgG (1:400) oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca sc'ler için.
6. Numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca çekirdekleri 5 μg/mL Hoechst 33342 boya ile lekeleyin. Numuneyi üç kez 1x PBS ile yıkayın ve cam kaydırak üzerine montaj ortamını (20 μL/slayt) kullanarak monte edin.
7. Her kuyu için üç rasgele alanda confocal lazer tarama mikroskobu ile hücre fotoğrafları çekin. Toplam çekirdek ve CD90 pozitif hücre sayısını, S100-pozitif hücreleri değerlendirin ve ardından sırasıyla CD90-pozitif hücrelerin ve S100-pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Boyamayı triplicate olarak gerçekleştirin.

3. Hücre saflığının belirlenmesi için akış sitometri analizi (FCA)

1. FCA¹⁶tarafından daha önce açıklandığı gibi motor ve duyusal fibroblastların ve SC'lerin saflığını değerlendirin. Kısaca, p2 motor ve duyusal fibroblastlar ve SCs% 0.25 (w / v) tripsin ile sindirmek, hücre pelet resuspend ve 15 dakika oda sıcaklığında fiksasyon ortamda onları kuluçka.
2. Permeabilizasyon ortamı olan hücreleri kuluçkaya yatırın ve fibroblastlar için fare monoklonal anti-CD90 antikorunu (0.1 μg/10⁶ hücre, 200 μL) ve 30 dakika oda sıcaklığındaki SC'ler için fare anti-S100 antikor (1:400, 200 μL) kullanarak sonda yıkıntın.
3. Hücreleri 488 konjuge keçi anti-fare IgG ile 30 dk. Akış sitometrisi gerçekleştirmek için FACS kalibrekullanın ve Cell Quest yazılımı kullanarak verileri analiz.
4. Hücreleri sadece 488 konjuge keçi anti-fare IgG (fibroblastlar Grubu) ve fare IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - İzotip kontrolü (SCs grubu), negatif kontrol olarak hizmet veren ile kuluçkaya yatırın.

4. İstatistiksel analiz

1. Tüm verileri ± SEM. GraphPad Prism 6.0 kullanarak eşleşmemiş t-testi ile verilerdeki istatistiksel farklılıkları değerlendirin. P<0.05'te istatistiksel anlamlılığı ayarlayın. Tüm tahlilleri triplicate olarak gerçekleştirin.

Sonuçlar

Işık mikroskobik gözlem
SC'ler ve fibroblastlar sinir dokularından primer hücre kültüründe elde edilen iki ana hücre popülasyonudur. 1 saat için aşılama sonra, hücrelerin çoğu çanak altına yapışmış ve hücre morfolojisi yuvarlak oval değişti. 24 saat kültürden sonra, SC'ler bipolar veya tripolar morfoloji sergilediler ve bunların uzunluğu 100 ile 200 m arasında değişmektedir. 48 saat sonra, hücrelerin toplanması ve çoğalması meydana ...

Tartışmalar

Periferik sinirlerin iki büyük hücre popülasyonları SCs ve fibroblastlar dahil. Öncelikle kültürlü fibroblastlar ve SCs doğru periferik sinir gelişimi ve rejenerasyon sırasında fibroblastlar ve SCs fizyolojisi modelleme yardımcı olabilir. Çalışma, P7 sıçan siyatik sinir hücrelerinin S100-pozitif SC'lerin yaklaşık %85'ini, OX7-pozitif fibroblastların %13'ünü ve OX42-pozitif makrofajların sadece %1,5'ini^13'üiçerdiğini göstermiştir. Fibroblast ların sayısı SC'lerden...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Life Technologies	A11005	Dilution: 1:400
CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Proteintech	SA00013-1	Dilution: 1:400
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
Cell Quest software	Becton Dickinson Biosciences
D-Hank's balanced salt solution	Gibco	14170112
DMEM	Corning	10-013-CV
Dissecting microscope	Olympus	SZ2-ILST
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099-141C
Forskolin	Sigma	F6886-10MG
Fluoroshield Mounting Medium	Abcam	ab104135
Fixation medium/Permeabilization medium	Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD	GAS005
Flow cytometry	Becton Dickinson Biosciences	FACS Calibur
Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Isotype Control	Abcam	ab106163	Dilution: 1:400
Mouse monoclonal anti-CD90 antibody	Abcam	ab225	Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt
Mouse anti-S100 antibody	Abcam	ab212816	Dilution: 1:400
Polylysine (PLL)	Sigma	P4832
Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein	R&D Systems	396-HB-050
0.25% (w/v) trypsin	Gibco	25200-072