JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عادة ما يتم التقاط الحمض النووي البيئي (eDNA) من عينات المياه باستخدام ترسيب الكحول أو الترشيح أو التلبد. يتم تقديم بروتوكول بديل يستخدم كلوريد اللانثانم لتمكين جمع الأحماض النووية الذائبة والمرتبطة بالجسيمات من عينات المياه التي تحتوي على خلايا حقيقية النواة والخلايا بدائية النواة والفيروسات.

Abstract

أصبح تحليل الحمض النووي البيئي (eDNA) نهجا مستخدما على نطاق واسع لحل المشكلات في إدارة الأنواع. الهدف هو اكتشاف الأنواع المشفرة بما في ذلك الأنواع الغازية و (أو) المعرضة للخطر ، وعادة ما يتم تحقيقه عن طريق اختبار المياه والرواسب لوجود بصمات الحمض النووي المميزة. ويلزم وجود إجراءات موثوقة وفعالة لالتقاط الحمض النووي الإلكتروني، لا سيما تلك التي يمكن إجراؤها بسهولة في الميدان من قبل موظفين ذوي تدريب محدود وعلماء مواطنين. يستخدم التقاط eDNA باستخدام الترشيح الغشائي على نطاق واسع حاليا. يحتوي هذا النهج على مشكلات متأصلة تشمل اختيار مادة المرشح والمسامية ، وقاذورات المرشح ، والوقت اللازم في الموقع لتنفيذ العملية. يوفر التلبد بديلا يمكن تنفيذه بسهولة وتطبيقه على أنظمة أخذ العينات التي تسعى جاهدة لتغطية مناطق واسعة في وقت محدود.

Introduction

قبل منتصف عام 2000 ، كان مصطلح "الحمض النووي البيئي" يستخدم بشكل عام للإشارة إلى الحمض النووي الذي تم الحصول عليه من ميكروبات الماء والتربة على الرغم من أن بعض الاستخدامات للكشف عن الحمض النووي البشري والحيواني لأغراض تتبع مصدر البراز أو اكتشاف الأنواع غير الأصلية قد بدأت1،2،3. في الوقت الحاضر ، يستخدم الحمض النووي البيئي بشكل عام لوصف الحمض النووي من الخلايا المأخوذة من الكائنات حقيقية النواة ، وأصبح تحليل هذا الحمض النووي أداة إدارة مستخدمة على نطاق واسع. الهدف هو اكتشاف الأنواع المشفرة بما في ذلك الأنواع الغازية أو الأنواع المعرضة للخطر ، وعادة ما يتم تحقيقه عن طريق اختبار الماء أو الرواسب لوجود بصمات الحمض النووي المميزة للأنواع المستهدفة. قد تركز الدراسات على نوع واحد ذي أهمية باستخدام اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد (أخذ العينات النشطة) ، أو يمكن اكتشاف العديد من الأنواع في وقت واحد باستخدام الترميز الشريطي والتسلسل المتوازي على نطاق واسع.

تم إجراء العديد من التحسينات في جمع العينات ومعالجة العينات وتحليل البيانات المرتبطة بأبحاث الحمض النووي الإلكتروني خلال العقدين الماضيين. استخدمت الدراسات المبكرة ترسيب الكحول لالتقاط الحمض النووي من عينات المياه3. على الرغم من تجربتها وصحتها ، فإن الحاجة إلى تحليل كميات كبيرة من المياه لزيادة حساسية الفحص تجعل هذه الطريقة غير جذابة بسبب المتطلبات النموذجية لمجلدين من الإيثانول لكل حجم من عينة الماء.

استخدمت الدراسات اللاحقة بشكل عام الترشيح الغشائي ، مما يبرر أن الحمض النووي الإلكتروني موجود في سلسلة متصلة من الحالات من الارتباط الخلوي إلى المذاب بحرية ، لكن هذا الحمض النووي المذاب يخضع للتدهور السريع وبالتالي يمثل الحمض النووي المرتبط بالخلوي الجزء الأكثر أهمية. تتم مناقشة ومناقشة مواد المرشح وتحسين حجم المسام على نطاق واسع كما هو الحال بالنسبة للطريقة (الطريقات) المثلى لاستخراج الحمض النووي الإلكتروني الملتقط من المرشح4،5،6.

الطريقة الثالثة لالتقاط الحمض النووي الإلكتروني هي التلبد ، وهي عملية تم استخدامها لعدة قرون لتوضيح السوائل بما في ذلك الماء والبيرة والنبيذ. استخدمت العديد من الدراسات التلبد لالتقاط الفيروس من مصادر المياه الطبيعية أو الصالحةللشرب 7،8،9،10،11. عادة ما تستخدم هذه الدراسات الحليب الخالي من الدسم أو كلوريد الحديد التلبد مسبقا كعوامل احتجاز. عادة ما تؤدي طرق كلوريد الحديد إلى مشاكل جزيئية في تحليل المصب بسبب تثبيط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل12،13. تتطلب الطرق التي تستخدم الحليب الخالي من الدسم التلبد مسبقا التحضير المسبق للندف ، والتحكم في الأس الهيدروجيني ، وحتى الآن تم تطبيقها فقط على التقاط الفيروس 7،8،9.

في الآونة الأخيرة ، تمت دراسة التقاط التلبد للبكتيريا والفيروسات على أساس استخدام كلوريد اللانثانم (III)12،13،14،15. أظهر المؤلفون أنه يمكن جمع مسببات الأمراض القابلة للحياة بهذه الطريقة لأن ارتباط كلوريد اللانثانم كان فعالا عند تركيز منخفض (0.2 مللي مولار). علاوة على ذلك ، يمكن عكس تلبد اللانثانم عن طريق الاستخلاب في ظل ظروف معتدلة على عكس كلوريد الحديد.

وبالتالي ، فإن التلبد باستخدام كلوريد اللانثانم لالتقاط الجسيمات البيولوجية أمر جذاب نظرا لأنه لا يلزم سوى كمية صغيرة من عامل التلبد المركز المضاف ، ولا يلزم التحكم الصارم في الأس الهيدروجيني ، وأحجام العينات قابلة للتطوير من المليلتر إلى الجالون. كما هو مطبق على التقاط الحمض النووي الإلكتروني ، يتم استرداد الخلايا الخلوية وتحت الخلوية (الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء) وكذلك الحمض النووي المذاب بسهولة. يتم جمع البكتيريا والفيروسات في وقت واحد مما يسمح باختبار مسببات الأمراض و (أو) الدراسات البيئية الإضافية من عينة مياه واحدة. يتم تقديم بروتوكول التلبد باستخدام كلوريد اللانثانم الذي يتيح جمع الأحماض النووية الذائبة والمرتبطة بالجسيمات من عينات المياه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. تطهير المعدات وإعداد كاشف التلبد

  1. اغسل جميع الزجاجات والأنابيب وغيرها من المعدات المستخدمة سابقا جيدا بمنظف غسل الصحون والماء الساخن.
  2. رش جميع الزجاجات والأنابيب والمعدات الأخرى المستخدمة سابقا بمحلول حامض الستريك بنسبة 6٪ لإزالة الرواسب المعدنية ، واتركها لمدة 20 دقيقة ، واشطفها بماء الصنبور.
  3. أضف محلولا من المبيض المنزلي المخفف بمقدار 10 أضعاف (0.5-0.6٪ تركيز نهائي من هيبوكلوريت الصوديوم) إلى جميع الزجاجات (حوالي 10٪ من حجم الحاوية) ، ورجها ، واتركها لمدة ساعة على الأقل ، ثم صفيها واشطفها بماء الصنبور حتى لا يتبقى أي أثر للتبييض. ثم اشطفها مرة واحدة بالماء منزوع الأيونات.
  4. جفف جميع الزجاجات.
  5. ضع جميع زجاجات وأغطية التجميع في خزانة أمان بيولوجية وقم بإشعاعها باستخدام مصابيح مبيدات الجراثيم بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين ، مع تدوير كل زجاجة وتغطية ربع دورة كل نصف ساعة.
  6. ضع الأغطية على الزجاجات وقم بتثبيتها بشكل غير محكم. قم بوزن كل زجاجة وسجل وزنها الفارغ على الزجاجة.
  7. قم بإعداد محلول 100 ملي مولار من سباعي هيدرات كلوريد اللانثانم (III) عن طريق إذابة 3.71 جم في 100 مل من الماء منزوع الأيونات. لتقليل تعرض المادة الكيميائية للهواء ، نظرا لأن كلوريد اللانثانم استرطابي ، أغلق الزجاجة بشريط لاصق بين الاستخدامات.
    تنبيه: يحمل كلوريد اللانثانم بيان (بيانات) التحذير من مخاطر كلمة الإشارة. H315 يسبب تهيج الجلد. H319 يسبب تهيجا خطيرا للعين. قد يسبب H335 تهيجا في الجهاز التنفسي. استخدم معدات الحماية الشخصية. راجع SDS للمادة لمزيد من المعلومات.
  8. تحضير محلول 1 متر من بيكربونات الصوديوم عن طريق إذابة 84.01 جم بيكربونات الصوديوم في 1 لتر ماء منزوع الأيونات. الفلتر والتعقيم والتخزين في درجة حرارة الغرفة.

2. جمع العينات والتلبد

  1. اجمع عينات من كل موقع بالإضافة إلى حقل واحد فارغ (عينة تحتوي على مياه الشرب مملوءة في الموقع للتحكم في التلوث) عن طريق ملء زجاجات ذات حجم مناسب. اضبط عدد العينات المأخوذة وفقا للتصميم التجريبي والغرض المقصود. لا تملأ الزجاجات أكثر من اللازم خارج كتف الزجاجة للسماح بالتمدد إذا كان سيتم تجميد العينات.
  2. سجل البيانات الوصفية ذات الصلة بما في ذلك التاريخ والوقت وموقع GPS. حاويات عينة الملصق.
  3. أضف 1 م محلول بيكربونات الصوديوم إلى كل عينة وحقل فارغ. أضف 10 مل لكل عينة سعة 500 مل.
  4. أغطي الزجاجات واخلطيها.
  5. أضف 100 ملي مولار من كلوريد اللانثانم إلى كل عينة وحقل فارغ. أضف 1 مل لكل عينة سعة 500 مل.
  6. غطيها واخلطيها جيدا. استخدم شريطا كهربائيا لتأمين الغطاء.
  7. يحفظ على الثلج حتى العودة إلى المختبر الميداني ، ثم يمكن تخزين العينات طوال الليل في الثلاجة والوقوف في وضع مستقيم للسماح للكتل بالاستقرار في قاع الحاوية أو تجميدها عند -20 درجة مئوية لشحنها إلى مختبر ثان لمزيد من المعالجة. يجب تجميد العينات واقفة في وضع مستقيم للسماح بتمدد السائل ومنع تمزق الحاوية.

3. معالجة الكتل

  1. قم بإذابة العينات المجمدة في درجة حرارة الغرفة في مبرد أو انقل العينات التي لم يتم تجميدها إلى منطقة طاولة عمل مناسبة تتضمن مضخة بريستاتيكية وإعداد أنابيب لشفط العينات الطافية تأكد من أن الأنبوب الذي يمر عبر المضخة التمعجية يتم تصريفه في دلو كبير على الأرض. يجب أن يكون المدخول مجهزا بقش شرب بلاستيكي نظيف للتحكم في المدخول.
  2. استخدم المضخة التمعجية لإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة الشرب لتوجيه الشفط أولا أسفل سطح السائل مباشرة وتحريك كمية المصاصة لأسفل مع مستوى السائل. قم بإزالة آخر المادة الطافية عن طريق تحريك المدخل بعناية ليستقر على الجسر (غمازة مرتفعة في قاع الزجاجة). يسمح هذا بإزالة السوائل القصوى بينما تتجمع الكتل حول المحيط (انظر الشكل 1).

figure-protocol-3561
الشكل 1: مجموعة الكتل المستقرة عند وحدة الجاذبية. يتم تسوية الكتل التي تحتوي على مادة خلوية و eDNA في الجزء السفلي من زجاجة العينة وتكون جاهزة للاسترداد بعد إزالة المادة الطافية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بتوصيل ماصة شرب نظيفة وكرر إزالة المادة الطافية لكل عينة.
  2. استخدم ماصة نظيفة سعة 20 مل ووحدة تحكم ماصة لنقل تعليق الكتلة بالكامل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. استخدم شطف الماء منزوع الأيونات منخفض الحجم (حوالي 5 مل) لضمان استرداد أي كتل متبقية من زجاجة العينة.
  3. اضبط جميع الأنابيب سعة 50 مل على أحجام متساوية مع الماء منزوع الأيونات واجمع الكتل عن طريق الطرد المركزي عند 2,500 × جم لمدة 20 دقيقة.
  4. اسكب المادة الطافية واجعل الأنابيب مقلوبة على منشفة ورقية نظيفة لتصريفها.
  5. أعد تعليق الكتل في 1 مل من 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0 عن طريق الخلط الدوامي ثم أضف 4 مل 1x محلول TE ، درجة الحموضة 8.0 واخلطها مرة أخرى. انقل الكتل المعلقة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل ، وأضف 50 ميكرولتر من 10٪ بولي أكريلاميد خطي ودوامة. أضف 5 مل 100٪ من الأيزوبروبانول ، واخلطه واتركه على الثلج لمدة 20 دقيقة.
  6. جهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 20 دقيقة لجمع الحمض النووي والجسيمات الخلوية. اسكب المواد الطافية واتركها مقلوبة على مناشف ورقية نظيفة لتصريفها. اتركيه ليجف قليلا ، لكن لا تجف أكثر من اللازم.
  7. ابدأ عملية استخراج الحمض النووي للكتلة باستخدام مجموعة تجارية تستخدم ضرب الخرزة وربط عمود الدوران بسعة 25 ميكروجرام.
    1. أولا ، قم بإعادة تعليق الكتل في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المزود بالمجموعة وانقل التعليق بالكامل إلى أنبوب ضرب الخرز. تغلبت حبة على تعليق الكتلة في فترات قصيرة مع التبريد بينهما. يمكن تخزين المتجانسات مجمدة في هذه المرحلة أو الاستمرار في بروتوكول المجموعة.
    2. قم بإزالة الحمض النووي من عمود الدوران أولا ب 100 ميكرولتر ، ثم أعد تدوير المصفاة من خلال أنبوب الدوران.
    3. أخيرا ، قم بإزالة الحمض النووي المتبقي من العمود بكمية إضافية من 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف لتكوين حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر. هذا يزيد من التعافي.
  8. جمع وإعداد وتحليل eDNA لإثبات أداء هذا البروتوكول وأدائه بالنسبة لطريقة الترشيح المستخدمة على نطاق واسع.
    1. قم بإعداد التفاعلات التي تحتوي على 1x qPCR مزيج رئيسي ، و 25 ميكروغرام / مل من الثرومبين البقري14،16 ، و 0.4 ميكرومتر من البادئات الأمامية والعكسية ، و 2 ميكرولتر من القالب (1٪ من الحمض النووي للعينة المستردة). قم ببناء منحنيات قياسية باستخدام التخفيفات التسلسلية لأضخمات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقاة والكمية التي تم إنشاؤها باستخدام الحمض النووي للقسيمة. بدلا من ذلك ، يمكن تصنيع الأهداف تجاريا.
    2. استخدم طريقة القياس الكمي المقارن إذا لم يكن هناك معيار متاح. على سبيل المثال ، قم بإجراء التدوير الحراري باستخدام ظروف تفاعل تبلغ 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعة ب 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، على الرغم من أنه يجب تعديل هذه الشروط لفحوصات أخرى. تحليل البيانات باستخدام برنامج الشركة المصنعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم استخدام ثماني عينات من الماء سعة 500 مل (450 مل لكل منها) مأخوذة من حوض مائي يضم سلحفاة مطلية شرقية (Chrysemys picta picta) لإعداد الحمض النووي الإلكتروني باستخدام البروتوكول الموصوف. تم ترشيح ثماني عينات أخرى من المياه سعة 500 مل على مرشحات ألياف زجاجية 47 مم ذات مسامية 1.5 ميكروم?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

على الرغم من أن هذه التقنية واضحة ، إلا أن بعض الخطوات حاسمة للنجاح. يجب أن يتم جمع ونقل الكتل بالكامل حتى لا تفقد الحمض النووي. يجب جمع المواد المتبقية باستخدام الشطف الاستراتيجي. يستخدم البروتوكول الموصوف مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية للمعالجة النهائية للمواد ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلف ليس لديه ما يكشف عنه.

Acknowledgements

تم الانتهاء من هذا العمل بتمويل من هيئة المسح الجيولوجي الأمريكية.

أي استخدام لأسماء التجارة أو الشركات أو المنتجات هو لأغراض وصفية فقط ولا يعني تأييد حكومة الولايات المتحدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5M EDTA, pH 8.0Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge TubesSingle use
16 oz. PET Clear Square BottlesReusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive LinerLeave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge TubesSingle use
6% Citric Acid SolutionUse to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe KitUse inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate100 mM Stock Solution
Peristaltic DC PumpAny peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture

References

  1. Mathes, M. V., et al. Presumptive Sources of Fecal Contamination in Four Tributaries to the New River Gorge National River, West Virginia, 2004. , Report No. 2007-1107 (2007).
  2. Caldwell, J. M., Raley, M. E., Levine, J. F. Mitochondrial Multiplex Real-Time PCR as a Source Tracking Method in Fecal-Contaminated Effluents. Environmental Science & Technology. 41 (9), 3277-3283 (2007).
  3. Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology Letters. 4 (4), 423-425 (2008).
  4. Djurhuus, A., et al. Evaluation of Filtration and DNA Extraction Methods for Environmental DNA Biodiversity Assessments across Multiple Trophic Levels. Frontiers in Marine Science. 4 (314), (2017).
  5. Hinlo, R., Gleeson, D., Lintermans, M., Furlan, E. Methods to maximise recovery of environmental DNA from water samples. PLOS One. 12 (6), 0179251(2017).
  6. Majaneva, M., et al. Environmental DNA filtration techniques affect recovered biodiversity. Scientific reports. 8 (1), 4682(2018).
  7. Aguado, D., et al. A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. Journal of Visualized Experiments. (147), e58463(2019).
  8. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  9. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
  10. Payment, P., Fortin, S., Trudel, M. Ferric chloride flocculation for nonflocculating beef extract preparations. Applied Environmental Microbiology. 47 (3), 591-592 (1984).
  11. Poulos, B. T., John, S. G., Sullivan, M. B. Iron Chloride Flocculation of Bacteriophages from Seawater. Methods Molecular Biology. 1681, 49-57 (2018).
  12. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Lanthanum-based concentration and microrespirometric detection of microbes in water. Water Research. 44 (11), 3385-3392 (2010).
  13. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Hu, Z. Determination of low-density Escherichia coli and Helicobacter pylori suspensions in water. Water Research. 46 (7), 2140-2148 (2012).
  14. Schill, W. B., Galbraith, H. S. Detecting the undetectable: Characterization, optimization, and validation of an eDNA detection assay for the federally endangered dwarf wedgemussel, Alasmidonta heterodon (Bivalvia: Unionoida). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 29 (4), 603-611 (2019).
  15. Zhang, Y., Riley, L. K., Lin, M., Purdy, G. A., Hu, Z. Development of a virus concentration method using lanthanum-based chemical flocculation coupled with modified membrane filtration procedures. Journal of Virology Methods. 190 (1-2), 41-48 (2013).
  16. Zhang, Y., et al. Bovine thrombin enhances the efficiency and specificity of polymerase chain reaction. BioTechniques. 57 (6), 289-294 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

EDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved