Capture d’ADN environnemental (ADNe) à partir d’échantillons d’eau par floculation

Résumé

L’ADN environnemental (ADNe) est généralement capturé à partir d’échantillons d’eau par précipitation d’alcool, filtration ou floculation. Voici un protocole alternatif qui utilise du chlorure de lanthane pour permettre la collecte d’acides nucléiques dissous et liés aux particules à partir d’échantillons d’eau contenant des cellules eucaryotes, des cellules procaryotes et des virus.

Résumé

L’analyse de l’ADN environnemental (ADNe) est devenue une approche largement utilisée pour résoudre les problèmes dans la gestion des espèces. L’objectif est de détecter les espèces cryptiques, y compris les espèces envahissantes et les espèces en péril, généralement en analysant l’eau et les sédiments pour détecter la présence de signatures d’ADN caractéristiques. Des procédures fiables et efficaces pour la capture de l’ADNe sont nécessaires, en particulier celles qui peuvent être facilement exécutées sur le terrain par du personnel ayant une formation limitée et des scientifiques citoyens. La capture de l’ADNe à l’aide de la filtration membranaire est largement utilisée actuellement. Cette approche présente des problèmes inhérents qui incluent le choix du matériau filtrant et de la porosité, l’encrassement du filtre et le temps nécessaire sur site pour que le processus soit effectué. La floculation offre une alternative qui peut être facilement mise en œuvre et appliquée à des régimes d’échantillonnage qui s’efforcent de couvrir de vastes territoires en un temps limité.

Introduction

Avant le milieu des années 2000, le terme « ADN environnemental » était généralement utilisé pour désigner l’ADN obtenu à partir de microbes de l’eau et du sol, bien que certaines utilisations pour la détection de l’ADN humain et animal à des fins de suivi des sources fécales ou de détection d’espèces non indigènes aient commencé ^1,2,3. À l’heure actuelle, l’ADN environnemental est généralement utilisé pour décrire l’ADN des cellules provenant d’organismes eucaryotes, et l’analyse de cet ADN est devenue un outil de gestion largement utilisé. L’objectif est de détecter les espèces cryptiques, y compris celles qui sont envahissantes ou en péril, et on y parvient, généralement en analysant l’eau ou les sédiments pour détecter la présence des signatures ADN caractéristiques de l’espèce cible. Les études peuvent se concentrer sur une seule espèce d’intérêt à l’aide d’un test PCR spécifique (échantillonnage actif), ou plusieurs espèces peuvent être détectées simultanément à l’aide du métacodage à barres et du séquençage massivement parallèle.

De nombreuses améliorations ont été apportées à la collecte d’échantillons, au traitement des échantillons et à l’analyse des données associées à la recherche sur l’ADNe au cours des deux dernières décennies. Les premières études ont utilisé la précipitation de l’alcool pour capturer l’ADN d’échantillons d’eau³. Bien qu’elle ait fait ses preuves, la nécessité d’analyser de grands volumes d’eau pour augmenter la sensibilité du test rend cette méthode peu attrayante en raison de la nécessité typique de deux volumes d’éthanol pour chaque volume d’échantillon d’eau.

Des études ultérieures ont généralement utilisé la filtration membranaire, rationalisant que l’ADNe est présent dans un continuum d’états allant de l’ADN cellulaire à l’ADN librement dissous, mais que l’ADN dissous est sujet à une dégradation rapide et que l’ADN lié aux cellules représente donc la fraction la plus significative. L’optimisation du matériau filtrant et de la taille des pores est largement discutée et débattue, tout comme la ou les méthodes optimales pour l’extraction de l’ADNe capturé à partir du filtre ^4,5,6.

Une troisième approche de la capture de l’ADNe est la floculation, un processus utilisé depuis des siècles pour clarifier les liquides, notamment l’eau, la bière et le vin. Plusieurs études ont utilisé la floculation pour capturer le virus à partir de sources d’eau naturelle ou potable 7,8,9,10,11. Ces études ont généralement utilisé du lait écrémé préfloculé ou du chlorure de fer comme agents de capture. Les méthodes à base de chlorure de fer entraînent généralement des problèmes moléculaires d’analyse en aval dus à l’inhibition de la réaction PCR^12,13. Les méthodes utilisant du lait écrémé pré-floculé nécessitent la préparation préalable du floculant, le contrôle du pH et, jusqu’à présent, n’ont été appliquées qu’à la capture du virus ^7,8,9.

Récemment, la capture par floculation des bactéries et des virus basée sur l’utilisation de chlorure de lanthane (III) a été étudiée 12,13,14,15. Les auteurs ont démontré que des agents pathogènes viables pouvaient être prélevés par cette méthode, car la liaison du chlorure de lanthane était efficace à de faibles concentrations (0,2 mM). De plus, la floculation du lanthane est réversible par chélation dans des conditions douces, contrairement à celle du chlorure de fer.

Ainsi, la floculation à l’aide de chlorure de lanthane pour capturer les particules biologiques est attrayante étant donné que seule une petite quantité d’agent floculant concentré ajouté est nécessaire, qu’aucun contrôle strict du pH n’est nécessaire et que les volumes d’échantillon sont évolutifs de quelques millilitres à gallons. Appliqué à la capture de l’ADNe, l’ADN cellulaire, subcellulaire (mitochondries et chloroplastes) ainsi que l’ADN dissous sont facilement récupérés. Les bactéries et les virus sont collectés simultanément, ce qui permet d’effectuer des tests d’agents pathogènes et (ou) des études écologiques supplémentaires à partir d’un seul échantillon d’eau. Un protocole de floculation utilisant du chlorure de lanthane est présenté qui permet de collecter des acides nucléiques dissous et liés aux particules à partir d’échantillons d’eau.

Protocole

1. Décontamination de l’équipement et préparation du réactif de floculation

1. Lavez soigneusement toutes les bouteilles, tubes et autres équipements précédemment utilisés avec du détergent à vaisselle et de l’eau chaude.
2. Vaporisez toutes les bouteilles, les tubes et tout autre équipement précédemment utilisé avec une solution d’acide citrique à 6 % pour éliminer les dépôts minéraux, laissez reposer 20 minutes et rincez à l’eau du robinet.
3. Ajouter une solution d’eau de Javel domestique diluée 10 fois (concentration finale de 0,5 à 0,6 % d’hypochlorite de sodium) à toutes les bouteilles (environ 10 % du volume du contenant), agiter, laisser reposer au moins 1 h, puis égoutter et rincer à l’eau du robinet jusqu’à ce qu’il ne reste plus de trace d’eau de Javel. Rincez ensuite une fois à l’eau déminéralisée.
4. Séchez toutes les bouteilles.
5. Placez tous les flacons de collecte et les bouchons dans une enceinte de sécurité biologique et irradiez à l’aide de lampes germicides ultraviolettes pendant 2 h, en tournant chaque bouteille et bouchon d’un quart de tour toutes les demi-heures.
6. Placez les bouchons sur les bouteilles et vissez-les sans serrer. Pesez chaque bouteille et notez son poids à vide sur la bouteille.
7. Préparez une solution de 100 mM de chlorure de lanthane (III) heptahydraté en dissolvant 3,71 g dans 100 mL d’eau désionisée. Pour minimiser l’exposition du produit chimique à l’air, car le chlorure de lanthane est hygroscopique, fermez la bouteille avec du ruban adhésif entre les utilisations.
   ATTENTION : Le chlorure de lanthane porte le ou les mentions de danger d’avertissement. H315 provoque une irritation de la peau. H319 provoque une grave irritation des yeux. H335 peut provoquer une irritation respiratoire. Utilisez un équipement de protection individuelle. Pour plus d’informations, consultez la FDS du matériau.
8. Préparez une solution de 1 M de bicarbonate de sodium en dissolvant 84,01 g de bicarbonate de sodium dans 1 L d’eau désionisée. Filtrer, stériliser et conserver à température ambiante.

2. Prélèvement et floculation des échantillons

1. Prélever des échantillons de chaque site ainsi qu’un échantillon blanc (un échantillon contenant de l’eau potable rempli sur place pour contrôler la contamination) en remplissant des bouteilles de taille appropriée. Ajustez le nombre d’échantillons prélevés en fonction de la conception de l’expérience et de l’objectif visé. Ne remplissez pas trop les bouteilles au-delà de l’épaule de la bouteille pour permettre l’expansion si les échantillons doivent être congelés.
2. Enregistrez les métadonnées pertinentes, notamment la date, l’heure et la position GPS. Étiquetez les contenants d’échantillons.
3. Ajouter une solution de bicarbonate de sodium 1 M à chaque échantillon et à chaque blanc. Ajouter 10 mL par échantillon de 500 mL.
4. Bouchez les bouteilles et mélangez.
5. Ajouter 100 mM de chlorure de lanthane à chaque échantillon et à chaque blanc de champ. Ajouter 1 mL par échantillon de 500 mL.
6. Boucher et bien mélanger. Utilisez du ruban isolant pour fixer le bouchon.
7. Entreposer sur de la glace jusqu’à ce qu’ils retournent au laboratoire de terrain, puis les échantillons peuvent être entreposés toute la nuit, réfrigérés et debout pour permettre aux flocs de se déposer au fond du contenant, soit congelés à -20 °C pour être expédiés à un deuxième laboratoire pour un traitement ultérieur. Les échantillons doivent être congelés debout pour permettre l’expansion du liquide et éviter la rupture du contenant.

3. Traitement des flocs

1. Décongelez les échantillons congelés à température ambiante dans une glacière ou transférez les échantillons qui n’ont pas été congelés vers une table de travail appropriée qui comprend une pompe péristatique et une tubulure pour l’aspiration des surnageants d’échantillons. Assurez-vous que le tube traversant la pompe péristaltique se décharge dans un grand seau sur le sol. L’apport doit être équipé d’une paille en plastique propre pour contrôler l’apport.
2. Utilisez la pompe péristaltique pour éliminer le surnageant en utilisant la paille pour diriger l’aspiration d’abord juste sous la surface du liquide et en déplaçant l’admission de la paille vers le bas avec le niveau de liquide. Retirez le dernier surnageant en déplaçant soigneusement l’admission pour qu’elle repose sur le pontil (fossette en relief au fond de la bouteille). Cela permet une évacuation maximale du liquide tandis que les flocs s’accumulent autour de la périphérie (voir Figure 1).

Figure 1 : Collection de flocs déposés à l’unité de gravité. Les flocs contenant du matériel cellulaire et de l’ADNe se déposent au fond de la bouteille d’échantillon et sont prêts à être récupérés une fois le surnageant retiré. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Fixez une paille propre et répétez l’élimination du surnageant pour chaque échantillon.
4. À l’aide d’une pipette propre de 20 ml et d’un contrôleur de pipette, transférez complètement la suspension de floc dans un tube à centrifuger de 50 ml. Utilisez des rinçages à l’eau déminéralisée à faible volume (environ 5 ml) pour vous assurer que les flocs résiduels sont récupérés de la bouteille d’échantillon.
5. Ajustez tous les tubes de 50 mL à des volumes égaux à ceux de l’eau déminéralisée et recueillez les flocs par centrifugation à 2 500 x g pendant 20 min.
6. Versez le surnageant et faites reposer les tubes à l’envers sur une serviette en papier propre pour les égoutter.
7. Remettre les flocs en suspension dans 1 mL d’EDTA 0,5 M, pH 8,0 par mélange vortex, puis ajouter 4 mL de solution 1x TE, pH 8,0 et mélanger à nouveau. Transférez les flocs remis en suspension dans un tube à centrifuger conique de 15 ml, ajoutez 50 μL de polyacrylamide linéaire à 10 % et vortex. Ajouter 5 ml d’isopropanol à 100 %, mélanger et laisser reposer sur de la glace pendant 20 min.
8. Centrifugeuse à 6 000 x g pendant 20 min pour collecter l’ADN et les particules cellulaires. Videz les surnageants et laissez-le reposer à l’envers sur du papier absorbant propre pour l’égoutter. Laisser sécher légèrement, mais ne pas trop sécher.
9. Commencez le processus d’extraction de l’ADN floc à l’aide d’un kit commercial qui utilise le battage des billes et la liaison en colonne de spin d’une capacité de 25 μg.
   1. Tout d’abord, remettez en suspension les flocs dans 800 μL du tampon de lyse fourni avec le kit et transférez complètement la suspension dans un tube de battage de billes. La perle bat la suspension du floc pendant de courtes durées avec refroidissement entre les deux. Les homogénats peuvent être conservés congelés à ce stade ou continuer avec le protocole du kit.
   2. Elutez d’abord l’ADN de la colonne de spin avec 100 μL, puis recyclez l’éluat à travers le tube de spin.
   3. Enfin, éluez l’ADN résiduel de la colonne avec une aliquote supplémentaire de 100 μL de tampon d’élution pour obtenir un volume total de 200 μL. Cela maximise la récupération.
10. Collecter, préparer et analyser l’ADNe pour démontrer les performances de ce protocole et ses performances par rapport à la méthode de filtration largement utilisée.
    1. Préparez des réactions contenant 1 mélange maître qPCR, 25 μg/mL de thrombine bovine^14,16, 0,4 μM d’amorces directes et inverses et 2 μL de matrice (1 % de l’ADN de l’échantillon récupéré). Construisez des courbes standard en utilisant des dilutions en série d’amplicons PCR purifiés et quantifiés générés à l’aide d’ADN de référence. Alternativement, les cibles peuvent être synthétisées commercialement.
    2. Utiliser une méthode de quantification comparative si aucune norme n’est disponible. Pour cet exemple, effectuez un thermocyclage en utilisant des conditions de réaction de 95 °C pendant 10 min, suivies de 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 57 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, bien que ces conditions doivent être ajustées pour d’autres essais. Analysez les données à l’aide du logiciel du fabricant.

Résultats

Huit échantillons d’eau de 500 mL (450 mL chacun) prélevés dans un aquarium abritant deux tortues peintes de l’Est (Chrysemys picta picta) ont été utilisés pour préparer l’ADNe selon le protocole décrit. Huit autres échantillons d’eau de 500 mL ont été filtrés sur des filtres en fibre de verre de 47 mm de porosité de 1,5 μm ne contenant aucun liant et l’ADNe a été extrait à l’aide de la même méthode d’extraction que celle utilisée pour le protoc...

Discussion

Bien que cette technique soit simple, certaines étapes sont essentielles au succès. La collecte et le transfert des flocs doivent se faire complètement afin de ne pas perdre d’ADN. Les matières résiduelles doivent être récupérées à l’aide de rinçages stratégiques. Le protocole décrit utilise un kit d’extraction d’ADN commercial pour le traitement final de la matière floculée. D’autres méthodes d’extraction peuvent avoir des performances similaires ou supérieu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA, pH 8.0	Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0	Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge Tubes	Single use
16 oz. PET Clear Square Bottles	Reusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner	Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Single use
6% Citric Acid Solution	Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe Kit	Use inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate	100 mM Stock Solution
Peristaltic DC Pump	Any peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier	10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate	1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture