Erfassung von Umwelt-DNA (eDNA) aus Wasserproben durch Flockung

Zusammenfassung

Umwelt-DNA (eDNA) wird in der Regel aus Wasserproben durch Alkoholfällung, Filtration oder Flockung gewonnen. Hier wird ein alternatives Protokoll vorgestellt, das Lanthanchlorid verwendet, um die Entnahme von gelösten und partikelgebundenen Nukleinsäuren aus Wasserproben zu ermöglichen, die eukaryotische Zellen, prokaryotische Zellen und Viren enthalten.

Zusammenfassung

Die Analyse von Umwelt-DNA (eDNA) hat sich zu einem weit verbreiteten Ansatz zur Problemlösung im Artenmanagement entwickelt. Das Ziel ist die Detektion kryptischer Arten, einschließlich invasiver und (oder) gefährdeter Arten, die in der Regel durch die Untersuchung von Wasser und Sedimenten auf das Vorhandensein charakteristischer DNA-Signaturen erreicht wird. Es sind zuverlässige und effiziente Verfahren für die Erfassung von eDNA erforderlich, insbesondere solche, die vor Ort von Personal mit begrenzter Ausbildung und Bürgerwissenschaftlern leicht durchgeführt werden können. Die Abscheidung von eDNA mittels Membranfiltration ist derzeit weit verbreitet. Dieser Ansatz hat inhärente Probleme, zu denen die Wahl des Filtermaterials und der Porosität, die Filterverschmutzung und die vor Ort erforderliche Zeit für die Durchführung des Prozesses gehören. Die Flockung bietet eine Alternative, die leicht implementiert und auf Probenahmeverfahren angewendet werden kann, die darauf abzielen, weite Gebiete in begrenzter Zeit abzudecken.

Einleitung

Vor Mitte der 2000er Jahre wurde der Begriff "Umwelt-DNA" im Allgemeinen verwendet, um sich auf DNA zu beziehen, die aus Wasser- und Bodenmikroben gewonnen wurde, obwohl einige Verwendungen für den Nachweis von menschlicher und tierischer DNA zum Zwecke der Verfolgung von Fäkalienquellen oder zum Nachweis nicht-einheimischer Arten begonnen hatten ^1,2,3. Gegenwärtig wird Umwelt-DNA im Allgemeinen verwendet, um DNA aus Zellen zu beschreiben, die von eukaryotischen Organismen abgestoßen wurden, und die Analyse dieser DNA ist zu einem weit verbreiteten Managementinstrument geworden. Das Ziel ist die Detektion kryptischer Spezies, einschließlich invasiver oder gefährdeter Arten, die in der Regel durch Untersuchung von Wasser oder Sedimenten auf das Vorhandensein der charakteristischen DNA-Signaturen der Zielspezies erreicht wird. Die Studien können sich unter Verwendung eines spezifischen PCR-Assays auf eine einzelne Spezies von Interesse konzentrieren (aktive Probenahme), oder viele Spezies können gleichzeitig mittels Metabarcoding und massiv paralleler Sequenzierung nachgewiesen werden.

In den letzten zwei Jahrzehnten wurden viele Verbesserungen bei der Probenentnahme, der Probenverarbeitung und der Datenanalyse im Zusammenhang mit der eDNA-Forschung erzielt. Frühe Studien verwendeten Alkoholfällung, um DNA aus Wasserproben zu erfassen³. Die Notwendigkeit, große Wassermengen zu analysieren, um die Empfindlichkeit des Assays zu erhöhen, macht diese Methode zwar bewährt, aber unattraktiv, da in der Regel zwei Volumina Ethanol für jedes Volumen einer Wasserprobe erforderlich sind.

Spätere Studien haben im Allgemeinen Membranfiltration verwendet, um zu rationalisieren, dass eDNA in einem Kontinuum von zellgebunden bis frei aufgelöst vorliegt, dass gelöste DNA jedoch einem schnellen Abbau unterliegt und daher zellulär gebundene DNA den bedeutendsten Teil darstellt. Die Optimierung des Filtermaterials und der Porengröße wird ausführlich diskutiert und diskutiert, ebenso wie die optimale(n) Methode(n) zur Extraktion der eingefangenen eDNA aus dem Filter ^4,5,6.

Ein dritter Ansatz zur eDNA-Erfassung ist die Flockung, ein Verfahren, das seit Jahrhunderten zur Klärung von Flüssigkeiten wie Wasser, Bier und Wein verwendet wird. In mehreren Studien wurde die Flockung verwendet, um Viren aus natürlichen oder Trinkwasserquellen einzufangen 7,8,9,10,11. In diesen Studien wurden in der Regel vorausgeflockte Magermilch oder Eisenchlorid als Abscheidungsmittel verwendet. Eisenchlorid-Methoden führen in der Regel zu molekularen Problemen bei der nachgelagerten Analyse aufgrund der Hemmung der PCR-Reaktion^12,13. Methoden, bei denen vorgeflockte Magermilch verwendet wird, erfordern die vorherige Vorbereitung des Flockungsmittels und die pH-Kontrolle und wurden bisher nur beim Einfangen von Viren ^7,8,9 angewendet.

In jüngster Zeit wurde die Flockungserfassung von Bakterien und Viren auf der Grundlage der Verwendung von Lanthan(III)-chlorid untersucht 12,13,14,15. Die Autoren zeigten, dass mit dieser Methode lebensfähige Erreger gewonnen werden konnten, da die Bindung von Lanthanchlorid bereits in geringer Konzentration (0,2 mM) wirksam war. Darüber hinaus ist die Lanthanflockung im Gegensatz zu Eisenchlorid unter milden Bedingungen über Chelatbildung reversibel.

Daher ist die Flockung mit Lanthanchlorid zur Abscheidung biologischer Partikel attraktiv, da nur eine kleine Menge des zugesetzten konzentrierten Flockungsmittels erforderlich ist, keine strenge pH-Kontrolle erforderlich ist und die Probenvolumina von Millilitern bis Gallonen skalierbar sind. Bei der Erfassung von eDNA kann sowohl zelluläre, subzelluläre (Mitochondrien und Chloroplasten) als auch gelöste DNA leicht zurückgewonnen werden. Bakterien und Viren werden gleichzeitig gesammelt, was Erregertests und (oder) zusätzliche ökologische Studien aus einer einzigen Wasserprobe ermöglicht. Es wird ein Flockungsprotokoll mit Lanthanchlorid vorgestellt, das die Entnahme von gelösten und partikelgebundenen Nukleinsäuren aus Wasserproben ermöglicht.

Protokoll

1. Dekontamination der Ausrüstung und Vorbereitung des Flockungsreagenzes

1. Waschen Sie alle Flaschen, Schläuche und andere zuvor verwendete Geräte gründlich mit Geschirrspülmittel und heißem Wasser.
2. Besprühen Sie alle Flaschen, Schläuche und andere zuvor verwendete Geräte mit 6%iger Zitronensäurelösung, um mineralische Ablagerungen zu entfernen, lassen Sie sie 20 Minuten stehen und spülen Sie sie mit Leitungswasser ab.
3. Geben Sie eine Lösung aus 10-fach verdünntem Haushaltsbleichmittel (0,5-0,6 % Endkonzentration Natriumhypochlorit) in alle Flaschen (ca. 10 % des Behältervolumens), schütteln Sie, lassen Sie es mindestens 1 h stehen, lassen Sie es dann abtropfen und spülen Sie es mit Leitungswasser ab, bis keine Spur von Bleiche mehr übrig ist. Spülen Sie dann einmal mit entionisiertem Wasser ab.
4. Trocknen Sie alle Flaschen.
5. Legen Sie alle Sammelflaschen und Verschlüsse in eine biologische Sicherheitswerkbank und bestrahlen Sie mit keimtötenden UV-Lampen 2 Stunden lang, wobei Sie jede Flasche und jeden Verschluss alle halbe Stunde eine Viertelumdrehung drehen.
6. Setzen Sie die Verschlüsse auf die Flaschen und schrauben Sie sie locker fest. Wiegen Sie jede Flasche und notieren Sie ihr Leergewicht auf der Flasche.
7. Bereiten Sie eine 100 mM Lösung von Lanthan(III)-chlorid-Heptahydrat vor, indem Sie 3,71 g in 100 mL deionisiertem Wasser auflösen. Um die Exposition der Chemikalie gegenüber der Luft zu minimieren, da Lanthanchlorid hygroskopisch ist, verschließen Sie die Flasche zwischen den Anwendungen mit Klebeband.
   ACHTUNG: Lanthanchlorid trägt das Signalwort Warnhinweis(e). H315 verursacht Hautreizungen. H319 verursacht schwere Augenreizungen. H335 kann die Atemwege reizen. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung. Weitere Informationen finden Sie im Sicherheitsdatenblatt des Materials.
8. Bereiten Sie eine 1 M Lösung von Natriumbikarbonat vor, indem Sie 84,01 g Natriumbikarbonat in 1 l entionisiertem Wasser auflösen. Filtrieren, sterilisieren und bei Raumtemperatur lagern.

2. Probenentnahme und Flockung

1. Entnehmen Sie Proben von jedem Standort plus ein leeres Feld (eine Probe mit Trinkwasser, die vor Ort abgefüllt wird, um sie auf Kontamination zu kontrollieren), indem Sie Flaschen in geeigneter Größe füllen. Passen Sie die Anzahl der entnommenen Proben entsprechend dem Versuchsdesign und dem Verwendungszweck an. Überfüllen Sie die Flaschen nicht über die Schulter der Flasche hinaus, um die Ausdehnung zu ermöglichen, wenn Proben eingefroren werden sollen.
2. Zeichnen Sie relevante Metadaten wie Datum, Uhrzeit und GPS-Standort auf. Beschriften Sie Probenbehälter.
3. Geben Sie 1 M Natriumbicarbonatlösung zu jeder Probe und jedem Feldleerzeichen. Fügen Sie 10 mL pro 500 mL Probe hinzu.
4. Verschließen Sie die Flaschen und mischen Sie.
5. Geben Sie 100 mM Lanthanchlorid zu jeder Probe und jedem Feldblind. Fügen Sie 1 mL pro 500 mL Probe hinzu.
6. Verschließen und gründlich mischen. Verwenden Sie Isolierband, um die Kappe zu sichern.
7. Bis zur Rückkehr ins Feldlabor auf Eis lagern, dann können die Proben entweder über Nacht gekühlt und aufrecht stehend gelagert werden, damit sich die Flocken am Boden des Behälters absetzen können, oder bei -20 °C eingefroren werden, um sie zur weiteren Verarbeitung in ein zweites Labor zu transportieren. Die Proben müssen aufrecht stehend eingefroren werden, um die Ausdehnung der Flüssigkeit zu ermöglichen und ein Reißen des Behälters zu verhindern.

3. Verarbeitung von Flocken

1. Tauen Sie gefrorene Proben bei Raumtemperatur in einem Kühler auf oder bringen Sie Proben, die nicht eingefroren wurden, in einen geeigneten Arbeitsbereich, der eine peristatische Pumpe und eine Schlaucheinrichtung für die Aspiration von Probenüberständen umfasst. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche, die durch die Schlauchpumpe verlaufen, in einen großen Eimer auf dem Boden abfließen. Die Einnahme sollte mit einem sauberen Trinkhalm aus Kunststoff ausgestattet sein, um die Aufnahme zu kontrollieren.
2. Verwenden Sie die Schlauchpumpe, um den Überstand zu entfernen, indem Sie mit dem Trinkhalm zuerst knapp unter die Flüssigkeitsoberfläche saugen und den Strohhalmeinzug mit dem Flüssigkeitsstand nach unten bewegen. Entfernen Sie den letzten Überstand, indem Sie den Einlass vorsichtig so bewegen, dass er auf dem Pontil aufliegt (erhabenes Grübchen am Boden der Flasche). Dies ermöglicht eine maximale Flüssigkeitsentfernung, während sich die Flocken an der Peripherie sammeln (siehe Abbildung 1).

Abbildung 1: Ansammlung von Flocken, die sich bei der Einheitsgravitation abgesetzt haben. Flocken, die Zellmaterial und eDNA enthalten, werden am Boden der Probenflasche abgesetzt und können nach Entfernen des Überstands zurückgewonnen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Befestigen Sie einen sauberen Trinkhalm und wiederholen Sie die Entfernung des Überstands für jede Probe.
4. Verwenden Sie eine saubere 20-ml-Pipette und eine Pipettensteuerung, um die Flockensuspension vollständig in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Verwenden Sie Spülungen mit deionisiertem Wasser in geringem Volumen (ca. 5 ml), um sicherzustellen, dass alle Flockenreste aus der Probenflasche zurückgewonnen werden.
5. Stellen Sie alle 50-ml-Röhrchen auf das gleiche Volumen mit deionisiertem Wasser ein und sammeln Sie die Flocken durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 20 Minuten.
6. Gießen Sie den Überstand ab und stellen Sie die Röhrchen zum Abtropfen umgedreht auf ein sauberes Papiertuch.
7. Resuspendieren Sie die Flocken in 1 mL 0,5 M EDTA, pH 8,0 durch Vortex-Mischen und fügen Sie dann 4 mL 1x TE Lösung, pH 8,0 hinzu und mischen Sie erneut. Die resuspendierten Flocken werden in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt, 50 μl 10 % lineares Polyacrylamid hinzugefügt und vortext. Fügen Sie 5 ml 100% Isopropanol hinzu, mischen Sie es und lassen Sie es 20 Minuten auf Eis stehen.
8. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 6.000 x g, um DNA und zelluläre Partikel zu sammeln. Überstände abgießen und umgedreht auf sauberen Küchenpapier abtropfen lassen. Etwas trocknen lassen, aber nicht zu stark trocknen.
9. Beginnen Sie den Floc-DNA-Extraktionsprozess mit einem kommerziellen Kit, das Bead-Beating und Spin-Column-Bindung mit einer Kapazität von 25 μg verwendet.
   1. Zuerst werden die Flocken in 800 μl des mit dem Kit gelieferten Lysepuffers resuspendiert und die Suspension vollständig in ein Bead-Schlagröhrchen überführt. Wulst schlagen Sie die Flockensuspension in kurzen Zeiträumen mit Abkühlung dazwischen. Homogenate können zu diesem Zeitpunkt gefroren gelagert werden oder mit dem Kit-Protokoll fortfahren.
   2. Eluieren Sie die DNA zuerst mit 100 μl aus der Spin-Säule und recyceln Sie dann das Eluat durch das Spin-Röhrchen.
   3. Zum Schluss eluieren Sie die verbleibende DNA aus der Säule mit zusätzlichen 100 μl aliquotem Elutionspuffer, um ein Gesamtvolumen von 200 μl zu erhalten. Dadurch wird die Wiederherstellung maximiert.
10. Sammeln, Vorbereiten und Analysieren von eDNA, um die Leistung dieses Protokolls und seine Leistung im Vergleich zur weit verbreiteten Filtrationsmethode zu demonstrieren.
    1. Bereiten Sie Reaktionen vor, die 1x qPCR-Mastermix, 25 μg/ml Rinderthrombin^14,16, 0,4 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimer und 2 μl Template (1 % der zurückgewonnenen Proben-DNA) enthalten. Erstellen Sie Standardkurven unter Verwendung von seriellen Verdünnungen von gereinigten und quantifizierten PCR-Amplikons, die mit Gutschein-DNA erzeugt wurden. Alternativ können Ziele kommerziell synthetisiert werden.
    2. Verwenden Sie eine vergleichende Quantifizierungsmethode, wenn kein Standard verfügbar ist. Für dieses Beispiel führen Sie das Thermocycling unter Reaktionsbedingungen von 95 °C für 10 min durch, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s, 57 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, obwohl diese Bedingungen für andere Assays angepasst werden müssen. Analysieren Sie die Daten mit der Software des Herstellers.

Ergebnisse

Acht 500-ml-Wasserproben (je 450 ml), die aus einem Aquarium entnommen wurden, in dem zwei Östliche Buntschildkröten (Chrysemys picta picta) lebten, wurden verwendet, um eDNA unter Verwendung des beschriebenen Protokolls herzustellen. Weitere acht 500-ml-Wasserproben wurden über 47-mm-Glasfaserfilter mit einer Porosität von 1,5 μm filtriert, die kein Bindemittel enthielten, und die eDNA wurde mit der gleichen Extraktionsmethode extrahiert, die auch für das Flockungsprotoko...

Diskussion

Obwohl diese Technik unkompliziert ist, sind einige Schritte entscheidend für den Erfolg. Die Entnahme und Übertragung der Flocken muss vollständig erfolgen, um keine DNA zu verlieren. Restmaterial muss durch strategische Spülungen aufgefangen werden. Das beschriebene Protokoll verwendet ein kommerzielles DNA-Extraktionskit für die abschließende Verarbeitung von ausgeflocktem Material. Andere Extraktionsmethoden können eine ähnliche Leistung erbringen oder in ihrer Leistung über...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA, pH 8.0	Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0	Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge Tubes	Single use
16 oz. PET Clear Square Bottles	Reusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner	Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Single use
6% Citric Acid Solution	Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe Kit	Use inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate	100 mM Stock Solution
Peristaltic DC Pump	Any peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier	10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate	1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture