Captura de ADN ambiental (eDNA) de muestras de agua por floculación

Resumen

El ADN ambiental (eDNA) generalmente se captura de muestras de agua mediante precipitación, filtración o floculación de alcohol. Aquí se presenta un protocolo alternativo que utiliza cloruro de lantano para permitir la recolección de ácidos nucleicos disueltos y unidos a partículas de muestras de agua que contienen células eucariotas, células procariotas y virus.

Resumen

El análisis del ADN ambiental (eDNA) se ha convertido en un enfoque ampliamente utilizado para la resolución de problemas en la gestión de especies. El objetivo es la detección de especies crípticas, incluidas las invasoras y/o las especies en riesgo, que normalmente se logran mediante el análisis del agua y los sedimentos para detectar la presencia de firmas características de ADN. Se requieren procedimientos confiables y eficientes para la captura de eDNA, especialmente aquellos que pueden ser realizados fácilmente en el campo por personal con capacitación limitada y científicos ciudadanos. La captura de eDNA mediante filtración por membrana es ampliamente utilizada en la actualidad. Este enfoque tiene problemas inherentes que incluyen la elección del material del filtro y la porosidad, el ensuciamiento del filtro y el tiempo requerido en el sitio para que se realice el proceso. La floculación ofrece una alternativa que puede implementarse y aplicarse fácilmente a los regímenes de muestreo que se esfuerzan por cubrir amplios territorios en un tiempo limitado.

Introducción

Antes de mediados de la década de 2000, el término "ADN ambiental" se utilizaba generalmente para referirse al ADN obtenido de los microbios del agua y del suelo, aunque se había comenzado a utilizar para la detección de ADN humano y animal con fines de rastreo de fuentes fecales o detección de especies no autóctonas ^1,2,3. En la actualidad, el ADN ambiental se utiliza generalmente para describir el ADN de las células desprendidas de organismos eucariotas, y el análisis de este ADN se ha convertido en una herramienta de gestión ampliamente utilizada. El objetivo es la detección de especies crípticas, incluidas las invasoras o las especies en peligro, que normalmente se logran mediante el análisis del agua o los sedimentos para detectar la presencia de las firmas de ADN características de la especie objetivo. Los estudios pueden centrarse en una sola especie de interés utilizando un ensayo de PCR específico (muestreo activo), o muchas especies pueden detectarse simultáneamente utilizando metabarcoding y secuenciación masiva en paralelo.

Durante las últimas dos décadas se han realizado muchas mejoras en la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y el análisis de datos asociados con la investigación del eDNA. Los primeros estudios emplearon la precipitación de alcohol para capturar ADN^{de muestras de} agua. Si bien está probado y es cierto, la necesidad de analizar grandes volúmenes de agua para aumentar la sensibilidad del ensayo hace que este método sea poco atractivo debido al requisito típico de dos volúmenes de etanol por cada volumen de muestra de agua.

Estudios posteriores han utilizado generalmente la filtración por membrana, racionalizando que el eDNA está presente en un continuo de estados, desde el unido a las células hasta el disuelto libremente, pero que el ADN disuelto está sujeto a una rápida degradación y, por lo tanto, el ADN unido a las células representa la fracción más significativa. La optimización del material del filtro y del tamaño de los poros es ampliamente discutida y debatida, así como el método o métodos óptimos para la extracción del ADNe capturado del filtro ^4,5,6.

Un tercer enfoque para la captura de eDNA es la floculación, un proceso que se ha utilizado durante siglos para clarificar líquidos, como el agua, la cerveza y el vino. Varios estudios han utilizado la floculación para capturar virus de fuentes de agua natural o potable 7,8,9,10,11. Por lo general, en estos estudios se ha utilizado leche descremada prefloculada o cloruro de hierro como agentes de captura. Los métodos con cloruro de hierro suelen dar lugar a problemas moleculares de análisis posteriores debido a la inhibición de la reacción de PCR^12,13. Los métodos que utilizan leche descremada prefloculada requieren la preparación previa del floculante, el control del pH y, hasta ahora, solo se han aplicado a la captura del virus ^7,8,9.

Recientemente, se ha estudiado la captura por floculación de bacterias y virus basada en el uso de cloruro de lantano (III) 12,13,14,15. Los autores demostraron que los patógenos viables podían ser recolectados por este método, ya que la unión del cloruro de lantano era efectiva a baja concentración (0,2 mM). Además, la floculación del lantano es reversible mediante quelación en condiciones suaves, a diferencia del cloruro de hierro.

Por lo tanto, la floculación con cloruro de lantano para capturar partículas biológicas es atractiva dado que solo se requiere una pequeña cantidad de agente floculante concentrado agregado, no se necesita un control estricto del pH y los volúmenes de muestra son escalables de mililitros a galones. Cuando se aplica a la captura de eDNA, el ADN celular, subcelular (mitocondrias y cloroplastos) y disuelto se recupera fácilmente. Las bacterias y los virus se recolectan simultáneamente, lo que permite realizar pruebas de patógenos y/o estudios ecológicos adicionales a partir de una sola muestra de agua. Se presenta un protocolo de floculación con cloruro de lantano que permite la recolección de ácidos nucleicos disueltos y unidos a partículas de muestras de agua.

Protocolo

1. Descontaminación de equipos y preparación de reactivos de floculación

1. Lave a fondo todas las botellas, tubos y otros equipos utilizados anteriormente con detergente para lavar platos y agua caliente.
2. Rocíe todas las botellas, tubos y otros equipos utilizados anteriormente con una solución de ácido cítrico al 6% para eliminar los depósitos minerales, deje reposar 20 minutos y enjuague con agua del grifo.
3. Añadir una solución de lejía doméstica diluida 10 veces (0,5-0,6% de concentración final de hipoclorito de sodio) a todos los biberones (aproximadamente el 10% del volumen del recipiente), agitar, dejar reposar al menos 1 hora, luego escurrir y enjuagar con agua del grifo hasta que no queden restos de lejía. Luego enjuague una vez con agua desionizada.
4. Seque todas las botellas.
5. Coloque todos los frascos y tapones de recolección en un armario de seguridad biológica e irradie con lámparas germicidas ultravioleta durante 2 h rotando cada frasco y tapón un cuarto de vuelta cada media hora.
6. Coloque las tapas en las botellas y enrósquelas sin apretar. Pese cada botella y registre su peso en vacío en la botella.
7. Prepare una solución de 100 mM de cloruro de lantano (III) heptahidratado disolviendo 3,71 g en 100 mL de agua desionizada. Para minimizar la exposición del producto químico al aire, ya que el cloruro de lantano es higroscópico, selle la botella con cinta adhesiva entre usos.
   PRECAUCIÓN: El cloruro de lantano lleva la palabra de advertencia de advertencia. H315 causa irritación de la piel. El H319 causa irritación ocular grave. El H335 puede causar irritación respiratoria. Usar equipo de protección personal. Consulte la FDS del material para obtener más información.
8. Prepare una solución 1 M de bicarbonato de sodio disolviendo 84,01 g de bicarbonato de sodio en 1 L de agua desionizada. Filtre, esterilice y almacene a temperatura ambiente.

2. Recogida de muestras y floculación

1. Recoja muestras de cada sitio más un blanco de campo (una muestra que contiene agua potable llenada en el sitio para controlar la contaminación) llenando botellas del tamaño adecuado. Ajustar el número de muestras tomadas de acuerdo con el diseño experimental y el propósito previsto. No llene demasiado los frascos más allá del hombro del frasco para permitir la expansión si se van a congelar las muestras.
2. Registre los metadatos pertinentes, como la fecha, la hora y la ubicación GPS. Etiquete los recipientes de muestras.
3. Agregue 1 M de solución de bicarbonato de sodio a cada muestra y blanco de campo. Agregue 10 mL por muestra de 500 mL.
4. Tape las botellas y mezcle.
5. Agregue 100 mM de cloruro de lantano a cada muestra y blanco de campo. Agregue 1 mL por cada 500 mL de muestra.
6. Tape y mezcle bien. Use cinta aislante para asegurar la tapa.
7. Almacenarse en hielo hasta que se devuelvan al laboratorio de campo, luego las muestras pueden almacenarse durante la noche refrigeradas y en posición vertical para permitir que los flóculos se depositen en el fondo del contenedor o congelarse a -20 °C para su envío a un segundo laboratorio para su posterior procesamiento. Las muestras deben congelarse en posición vertical para permitir la expansión del líquido y evitar la rotura del recipiente.

3. Procesamiento de flóculos

1. Descongele las muestras congeladas a temperatura ambiente en un refrigerador o traslade las muestras que no se congelaron a un área de banco de trabajo adecuada que incluya una bomba peristática y una configuración de tubos para la aspiración de sobrenadantes de muestras. Asegúrese de que la tubería que atraviesa la bomba peristáltica descargue en un balde grande en el piso. La ingesta debe estar equipada con una pajita de plástico limpia para controlar la ingesta.
2. Utilice la bomba peristáltica para eliminar el sobrenadante utilizando la pajita para dirigir la succión primero justo debajo de la superficie del líquido y moviendo la entrada de la pajilla hacia abajo con el nivel del líquido. Retire lo último del sobrenadante moviendo con cuidado la ingesta para que descanse sobre el pontil (hoyuelo elevado en el fondo de la botella). Esto permite la máxima eliminación de líquido mientras los flóculos se acumulan alrededor de la periferia (ver Figura 1).

Figura 1: Colección de flóculos asentados en la unidad de gravedad. Los flóculos que contienen material celular y ADNe se depositan en el fondo del frasco de muestra y están listos para ser recuperados después de que se elimina el sobrenadante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Coloque una pajita limpia y repita la extracción del sobrenadante para cada muestra.
4. Utilice una pipeta limpia de 20 mL y un controlador de pipeta para transferir completamente la suspensión de flóculos a un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilice enjuagues de agua desionizada de bajo volumen (aproximadamente 5 ml) para asegurarse de que se recuperen los flóculos residuales del frasco de muestra.
5. Ajuste todos los tubos de 50 mL para igualar volúmenes con el agua desionizada y recoja los flóculos por centrifugación a 2.500 x g durante 20 min.
6. Vierta el sobrenadante y haga que los tubos queden invertidos sobre una toalla de papel limpia para escurrir.
7. Vuelva a suspender los flóculos en 1 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0 mediante mezcla de vórtice y luego agregue 4 mL de solución 1x TE, pH 8,0 y mezcle nuevamente. Transfiera los flóculos resuspendidos a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL, agregue 50 μL de poliacrilamida lineal al 10% y vórtice. Agrega 5 mL de isopropanol 100%, mezcla y deja reposar sobre hielo durante 20 min.
8. Centrifugar a 6.000 x g durante 20 min para recoger el ADN y las partículas celulares. Vierta los sobrenadantes y déjelo reposar invertido sobre toallas de papel limpias para escurrir. Deje secar un poco, pero no lo seque demasiado.
9. Comience el proceso de extracción de ADN en flóculos utilizando un kit comercial que emplea el batido de cuentas y la unión de la columna de centrifugación con una capacidad de 25 μg.
   1. En primer lugar, vuelva a suspender los flóculos en 800 μL del tampón de lisis suministrado con el kit y transfiera completamente la suspensión a un tubo de batido de perlas. Bead venció a la suspensión de flóculos en períodos cortos con enfriamiento entre ellos. Los homogeneizados pueden almacenarse congelados en este punto o continuar con el protocolo del kit.
   2. Eluya el ADN de la columna de centrifugación primero con 100 μL, luego recicle el eluido a través del tubo de centrifugación.
   3. Finalmente, eluya el ADN residual de la columna con una alícuota adicional de 100 μL de tampón de elución para obtener un volumen total de 200 μL. Esto maximiza la recuperación.
10. Recopile, prepare y analice eDNA para demostrar el rendimiento de este protocolo y su rendimiento en relación con el método de filtración ampliamente utilizado.
    1. Prepare reacciones que contengan 1x mezcla maestra de qPCR, 25 μg/mL de trombina bovina^14,16, 0,4 μM de cebadores directos e inversos y 2 μL de molde (1% del ADN de la muestra recuperada). Construya curvas estándar utilizando diluciones en serie de amplicones de PCR purificados y cuantificados generados con ADN de cupón. Alternativamente, los objetivos se pueden sintetizar comercialmente.
    2. Utilice un método de cuantificación comparativa si no se dispone de un estándar. Para este ejemplo, realice el termociclo utilizando condiciones de reacción de 95 °C durante 10 min seguidas de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 57 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s, aunque estas condiciones deben ajustarse para otros ensayos. Analice los datos utilizando el software del fabricante.

Resultados

Se utilizaron ocho muestras de agua de 500 mL (450 mL cada una) tomadas de un acuario que albergaba dos tortugas pintadas orientales (Chrysemys picta picta) para preparar el eDNA utilizando el protocolo descrito. Otras ocho muestras de agua de 500 mL se filtraron sobre filtros de fibra de vidrio de 47 mm de porosidad de 1,5 μm que no contenían aglutinante y se extrajo el eDNA utilizando el mismo método de extracción utilizado para el protocolo de floculación. El ADN prepara...

Discusión

Aunque esta técnica es sencilla, algunos pasos son fundamentales para el éxito. La recolección y transferencia de los flóculos debe hacerse por completo para no perder el ADN. El material residual debe recogerse mediante enjuagues estratégicos. El protocolo descrito utiliza un kit comercial de extracción de ADN para el procesamiento final del material floculado. Otros métodos de extracción pueden tener un rendimiento similar o pueden ser superiores en rendimiento, pero las modifi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA, pH 8.0	Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0	Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge Tubes	Single use
16 oz. PET Clear Square Bottles	Reusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner	Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Single use
6% Citric Acid Solution	Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe Kit	Use inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate	100 mM Stock Solution
Peristaltic DC Pump	Any peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier	10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate	1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture