Su Örneklerinden Flokülasyon ile Çevresel DNA'nın (eDNA) Yakalanması

Özet

Çevresel DNA (eDNA) tipik olarak alkol çökeltme, filtreleme veya flokülasyon kullanılarak su örneklerinden yakalanır. Burada, ökaryotik hücreler, prokaryotik hücreler ve virüs içeren su örneklerinden çözünmüş ve partiküle bağlı nükleik asitlerin toplanmasını sağlamak için lantan klorür kullanan alternatif bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Çevresel DNA'nın (eDNA) analizi, tür yönetiminde problem çözmede yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. İstilacı ve (veya) risk altındaki türler de dahil olmak üzere kriptik türlerin tespiti, tipik olarak karakteristik DNA imzalarının varlığı için su ve tortunun test edilmesiyle gerçekleştirilen amaçtır. eDNA'nın yakalanması için güvenilir ve verimli prosedürler gereklidir, özellikle de sınırlı eğitime sahip personel ve vatandaş bilim adamları tarafından sahada kolayca gerçekleştirilebilecek olanlar. Membran filtrasyonu kullanılarak eDNA'nın yakalanması şu anda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yaklaşımın, filtre malzemesi seçimi ve gözeneklilik, filtre kirlenmesi ve işlemin gerçekleştirilmesi için sahada gereken süreyi içeren doğal sorunları vardır. Flokülasyon, sınırlı bir süre içinde geniş alanları kapsamaya çalışan örnekleme rejimlerine kolayca uygulanabilecek ve uygulanabilecek bir alternatif sunar.

Giriş

2000'li yılların ortalarından önce, "çevresel DNA" terimi genellikle su ve toprak mikroplarından elde edilen DNA'ya atıfta bulunmak için kullanılıyordu, ancak dışkı kaynağı takibi veya yerli olmayan türlerin tespiti amacıyla insan ve hayvan DNA'sının tespiti için bazı kullanımlar başlamıştı ^1,2,3. Şu anda, çevresel DNA genellikle ökaryotik organizmalardan alınan hücrelerden elde edilen DNA'yı tanımlamak için kullanılmaktadır ve bu DNA'nın analizi yaygın olarak kullanılan bir yönetim aracı haline gelmiştir. İstilacı olanlar veya risk altındaki türler de dahil olmak üzere kriptik türlerin tespiti, tipik olarak hedef türün karakteristik DNA imzalarının varlığı için su veya tortunun test edilmesiyle gerçekleştirilen amaçtır. Çalışmalar, belirli bir PCR testi (aktif örnekleme) kullanarak tek bir ilgilenilen türe odaklanabilir veya metabarkodlama ve büyük ölçüde paralel dizileme kullanılarak birçok tür aynı anda tespit edilebilir.

Son yirmi yılda eDNA araştırmalarıyla ilişkili örnek toplama, örnek işleme ve veri analizinde birçok iyileştirme yapılmıştır. İlk çalışmalar, su örneklerinden DNA yakalamak için alkol çökeltmesini kullandı³. Denenmiş ve doğru olsa da, tahlil hassasiyetini artırmak için büyük su hacimlerini analiz etme ihtiyacı, her bir su numunesi hacmi için iki hacim etanol için tipik gereksinim nedeniyle bu yöntemi çekici hale getirir.

Daha sonraki çalışmalar genellikle zar filtrasyonunu kullanmış, eDNA'nın hücreye bağlı durumdan serbestçe çözünmüş duruma kadar bir durum sürekliliğinde mevcut olduğunu, ancak çözünmüş DNA'nın hızlı bozunmaya maruz kaldığını ve bu nedenle hücreye bağlı DNA'nın en önemli fraksiyonu temsil ettiğini rasyonelleştirmiştir. Filtre malzemesi ve gözenek boyutu optimizasyonu, yakalanan eDNA'nın filtre ^4,5,6'dan çıkarılması için en uygun yöntem(ler) gibi geniş çapta tartışılır ve tartışılır.

eDNA yakalamaya yönelik üçüncü bir yaklaşım, su, bira ve şarap dahil olmak üzere sıvıları berraklaştırmak için yüzyıllardır kullanılan bir süreç olan flokülasyondur. Birkaç çalışma, doğal veya içilebilir su kaynaklarından^virüsü yakalamak için flokülasyon kullanmıştır 7,8,9,10,11. Bu çalışmalarda tipik olarak yakalama ajanları olarak önceden topaklanmış yağsız süt veya demir klorür kullanılmıştır. Demir klorür yöntemleri tipik olarak PCR reaksiyon inhibisyonu^12,13 nedeniyle aşağı akış analizi moleküler problemlerine neden olur. Önceden floküle edilmiş yağsız süt kullanan yöntemler, topaklaştırıcının önceden hazırlanmasını, pH kontrolünü gerektirir ve şimdiye kadar sadece virüs ^7,8,9'un yakalanması için uygulanmıştır.

Son zamanlarda, lantan (III) klorür kullanımına dayalı olarak bakteri ve virüsün flokülasyon yakalaması incelenmiştir 12,13,14,15. Yazarlar, lantan klorürün bağlanması düşük konsantrasyonda (0.2 mM) etkili olduğu için canlı patojenlerin bu yöntemle toplanabileceğini gösterdi. Ayrıca, lantan flokülasyonu, demir klorürün aksine hafif koşullar altında şelasyon yoluyla geri dönüşümlüdür.

Bu nedenle, biyolojik partikülleri yakalamak için lantan klorür kullanılarak yapılan flokülasyon, yalnızca az miktarda ilave konsantre topaklaştırıcı ajanın gerekli olduğu, sıkı pH kontrolüne gerek olmadığı ve numune hacimlerinin mililitreden galona kadar ölçeklendirilebildiği göz önüne alındığında çekicidir. eDNA'nın yakalanmasına uygulandığında, hücresel, hücre altı (mitokondri ve kloroplastlar) ve çözünmüş DNA kolayca geri kazanılır. Bakteriler ve virüsler aynı anda toplanır ve tek bir su örneğinden patojen testine ve (veya) ek ekolojik çalışmalara izin verilir. Su örneklerinden çözünmüş ve partiküle bağlı nükleik asitlerin toplanmasını sağlayan lantan klorür kullanan bir flokülasyon protokolü sunulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Ekipmanın dekontaminasyonu ve flokülasyon reaktifi hazırlanması

1. Tüm şişeleri, hortumları ve daha önce kullanılmış diğer ekipmanları bulaşık deterjanı ve sıcak suyla iyice yıkayın.
2. Mineral birikintilerini gidermek için tüm şişelere, borulara ve daha önce kullanılan diğer ekipmanlara %6 sitrik asit solüsyonu püskürtün, 20 dakika bekletin ve musluk suyuyla durulayın.
3. Tüm şişelere (kap hacminin yaklaşık% 10'u) 10 kat seyreltilmiş ev tipi çamaşır suyu (% 0.5-0.6 nihai sodyum hipoklorit konsantrasyonu) çözeltisi ekleyin, çalkalayın, en az 1 saat bekletin, ardından süzün ve çamaşır suyu izi kalmayana kadar musluk suyuyla durulayın. Daha sonra deiyonize su ile bir kez durulayın.
4. Tüm şişeleri kurutun.
5. Tüm toplama şişelerini ve kapaklarını biyolojik bir güvenlik kabinine yerleştirin ve ultraviyole antiseptik lambalar kullanarak 2 saat boyunca ışınlayın, her bir şişeyi ve kapağı her yarım saatte bir çeyrek tur döndürün.
6. Kapakları şişelerin üzerine yerleştirin ve gevşek bir şekilde vidalayın. Her şişeyi tartın ve boş ağırlığını şişeye kaydedin.
7. 3.71 g'ı 100 mL deiyonize suda çözerek 100 mM'lik bir lantan (III) klorür heptahidrat çözeltisi hazırlayın. Lantan klorür higroskopik olduğundan, kimyasalın havaya maruz kalmasını en aza indirmek için, kullanımlar arasında şişeyi bantla kapatın.
   DİKKAT: Lantan klorür, uyarı tehlike ifadesi/ifadeleri sinyal kelimesini taşır. H315 cilt tahrişine neden olur. H319 ciddi göz tahrişine neden olur. H335 solunum yolu tahrişine neden olabilir. Kişisel koruyucu ekipman kullanın. Daha fazla bilgi için malzemenin SDS'sine bakın.
8. 84.01 g sodyum bikarbonatı 1 L deiyonize suda çözerek 1 M'lik bir sodyum bikarbonat çözeltisi hazırlayın. Filtre, sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın.

2. Numune toplama ve flokülasyon

1. Uygun büyüklükteki şişeleri doldurarak her sahadan ve bir boş alandan (kontaminasyonu kontrol etmek için sahada doldurulmuş içme suyu içeren bir numune) numune toplayın. Alınan numune sayısını deney tasarımına ve amaçlanan amaca göre ayarlayın. Numunelerin dondurulması gerekiyorsa genleşmeye izin vermek için şişeleri şişenin omzunun ötesinde aşırı doldurmayın.
2. Tarih, saat ve GPS konumu dahil olmak üzere ilgili meta verileri kaydedin. Numune kaplarını etiketleyin.
3. Her numuneye 1 M sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve boş alan ekleyin. 500 mL numune başına 10 mL ekleyin.
4. Şişeleri kapatın ve karıştırın.
5. Her numuneye 100 mM lantan klorür ekleyin ve alan boşluğu doldurun. 500 mL numune başına 1 mL ekleyin.
6. Kapağını kapatın ve iyice karıştırın. Kapağı sabitlemek için elektrik bandı kullanın.
7. Saha laboratuvarına dönene kadar buz üzerinde saklayın, daha sonra numuneler ya gece boyunca buzdolabında saklanabilir ve topakların kabın dibine çökmesini sağlamak için dik durabilir ya da daha sonraki işlemler için ikinci bir laboratuvara gönderilmek üzere -20 °C'de dondurulabilir. Sıvı genleşmesine izin vermek ve kabın yırtılmasını önlemek için numuneler dik durarak dondurulmalıdır.

3. Flokların işlenmesi

1. Dondurulmuş numuneleri oda sıcaklığında bir soğutucuda çözdürün veya donmamış numuneleri, numune süpernatantlarının aspirasyonu için peristatik bir pompa ve boru kurulumu içeren uygun bir tezgah alanına taşıyın. Peristaltik pompadan geçen borunun zemindeki büyük bir kovaya boşaldığından emin olun. Giriş, alımı kontrol etmek için temiz, plastik bir pipet ile donatılmalıdır.
2. Önce sıvı yüzeyinin hemen altına emmeyi yönlendirmek için içme pipetini kullanarak ve saman girişini sıvı seviyesiyle birlikte aşağı hareket ettirerek süpernatanı çıkarmak için peristaltik pompayı kullanın. Girişi pontil üzerinde duracak şekilde dikkatlice hareket ettirerek süpernatantın sonuncusunu çıkarın (şişenin dibinde kabarık çukur). Bu, topaklar çevre çevresinde toplanırken maksimum sıvı uzaklaştırmasına izin verir (bkz. Şekil 1).

Şekil 1: Birim graviteye oturan topakların toplanması. Hücresel materyal ve eDNA içeren topaklar, numune şişesinin dibine yerleştirilir ve süpernatan çıkarıldıktan sonra geri kazanılmaya hazırdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Temiz bir pipet takın ve her numune için süpernatan çıkarma işlemini tekrarlayın.
4. Flok süspansiyonunu tamamen 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarmak için temiz bir 20 mL pipet ve pipet kontrolörü kullanın. Numune şişesinden kalan topakların geri kazanıldığından emin olmak için düşük hacimli deiyonize su durulamaları (yaklaşık 5 mL) kullanın.
5. Tüm 50 mL'lik tüpleri deiyonize su ile eşit hacimlere ayarlayın ve topakları 20 dakika boyunca 2.500 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
6. Süpernatanı dökün ve tüpleri boşaltmak için temiz bir kağıt havlu üzerinde ters çevrilmiş halde durun.
7. 1 mL 0.5 M EDTA, pH 8.0 içinde girdap karıştırma ile topakları yeniden süspanse edin ve daha sonra 4 mL 1x TE çözeltisi, pH 8.0 ekleyin ve tekrar karıştırın. Yeniden süspanse edilmiş topakları 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın, 50 μL% 10 lineer poliakrilamid ve girdap ekleyin. 5 mL %100 izopropanol ekleyin, karıştırın ve 20 dakika buz üzerinde bekletin.
8. DNA ve hücresel partikülleri toplamak için 20 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları dökün ve boşaltması için temiz kağıt havluların üzerinde ters çevrilmiş halde durmasına izin verin. Hafifçe kurumasına izin verin, ancak fazla kurumayın.
9. 25 μg kapasiteli boncuk çırpma ve döndürme sütunu bağlama kullanan ticari bir kit kullanarak flok DNA ekstraksiyon işlemine başlayın.
   1. İlk olarak, kit ile birlikte verilen lizis tamponunun 800 μL'sindeki topakları yeniden süspanse edin ve süspansiyonu tamamen bir boncuk çırpma tüpüne aktarın. Boncuk, aralarında soğutma ile kısa sürelerde flok süspansiyonu yendi. Homojenatlar bu noktada donmuş olarak saklanabilir veya kit protokolü ile devam edilebilir.
   2. DNA'yı önce 100 μL ile spin kolonundan kaldırın, ardından elüatı spin tüpünden geri dönüştürün.
   3. Son olarak, toplam 200 μL'lik bir hacim elde etmek için artık DNA'yı kolondan ek bir 100 μL alikot elüsyon tamponu ile elüte edin. Bu, iyileşmeyi en üst düzeye çıkarır.
10. Bu protokolün performansını ve yaygın olarak kullanılan filtreleme yöntemine göre performansını göstermek için eDNA'yı toplayın, hazırlayın ve analiz edin.
    1. 1x qPCR ana karışımı, 25 μg/mL sığır trombini^14,16, 0.4 μM ileri ve geri primerler ve 2 μL şablon (geri kazanılan numune DNA'sının %1'i) içeren reaksiyonları hazırlayın. Kupon DNA kullanılarak oluşturulan saflaştırılmış ve niceliklendirilmiş PCR amplikonlarının seri dilüsyonlarını kullanarak standart eğriler oluşturun. Alternatif olarak, hedefler ticari olarak sentezlenebilir.
    2. Herhangi bir standart yoksa karşılaştırmalı bir niceleme yöntemi kullanın. Bu örnek için, 10 dakika boyunca 95 ° C'lik reaksiyon koşullarını ve ardından 10 saniye boyunca 95 ° C'lik 40 döngü, 30 saniye boyunca 57 ° C ve 30 saniye boyunca 72 ° C'lik reaksiyon koşullarını kullanarak termodöngü gerçekleştirin, ancak bu koşulların diğer testler için ayarlanması gerekir. Üreticinin yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İki Doğu boyalı kaplumbağası (Chrysemys picta picta) barındıran bir akvaryumdan alınan sekiz adet 500 mL su örneği (her biri 450 mL), açıklanan protokol kullanılarak eDNA hazırlamak için kullanıldı. Sekiz adet 500 mL su numunesi, bağlayıcı içermeyen 1.5 μm gözenekliliğe sahip 47 mm cam elyaf filtreler üzerinde filtrelendi ve flokülasyon protokolü için kullanılanla aynı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak eDNA ekstrakte edildi. Her iki yöntem kullan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu teknik basit olsa da, bazı adımlar başarı için kritik öneme sahiptir. DNA'yı kaybetmemek için flokların toplanması ve aktarılması eksiksiz yapılmalıdır. Artık malzeme stratejik durulamalar kullanılarak toplanmalıdır. Açıklanan protokol, topaklanmış materyalin son işlenmesi için ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanır. Diğer ekstraksiyon yöntemleri benzer şekilde performans gösterebilir veya performans açısından üstün olabilir, ancak protokolün bu ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA, pH 8.0	Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0	Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge Tubes	Single use
16 oz. PET Clear Square Bottles	Reusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner	Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Single use
6% Citric Acid Solution	Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe Kit	Use inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate	100 mM Stock Solution
Peristaltic DC Pump	Any peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier	10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate	1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture