Захват ДНК окружающей среды (eDNA) из проб воды методом флокуляции

Резюме

ДНК окружающей среды (эДНК) обычно захватывается из проб воды с помощью осаждения спирта, фильтрации или флокуляции. Здесь представлен альтернативный протокол, в котором хлорид лантана используется для сбора растворенных и связанных с частицами нуклеиновых кислот из образцов воды, содержащих эукариотические клетки, прокариотические клетки и вирусы.

Аннотация

Анализ ДНК окружающей среды (эДНК) стал широко используемым подходом к решению проблем в управлении видами. Обнаружение загадочных видов, включая инвазивные и (или) виды, находящиеся под угрозой, является целью, обычно достигаемой путем тестирования воды и отложений на наличие характерных сигнатур ДНК. Необходимы надежные и эффективные процедуры захвата eDNA, особенно те, которые могут быть легко выполнены в полевых условиях персоналом с ограниченной подготовкой и гражданскими учеными. В настоящее время широко используется захват eDNA с помощью мембранной фильтрации. Такой подход имеет неотъемлемые проблемы, которые включают в себя выбор фильтрующего материала и пористости, загрязнение фильтра и время, необходимое для выполнения процесса на месте. Флокуляция представляет собой альтернативу, которая может быть легко реализована и применена к режимам отбора проб, стремящимся охватить обширные территории за ограниченное время.

Введение

До середины 2000-х годов термин «экологическая ДНК» обычно использовался для обозначения ДНК, полученной из водных и почвенных микробов^{, хотя некоторые виды} уже начали использовать его для обнаружения ДНК человека и животных с целью отслеживания источников фекалий или обнаружения неместных видов. В настоящее время ДНК окружающей среды обычно используется для описания ДНК клеток, отслаивающихся от эукариотических организмов, и анализ этой ДНК стал широко используемым инструментом управления. Обнаружение загадочных видов, в том числе инвазивных или подверженных риску видов, обычно достигается путем тестирования воды или отложений на наличие характерных сигнатур ДНК целевых видов. Исследования могут быть сосредоточены на одном виде, представляющем интерес, с использованием специфического ПЦР-анализа (активного отбора проб), или многие виды могут быть обнаружены одновременно с помощью метабаркодирования и массово-параллельного секвенирования.

За последние два десятилетия было достигнуто множество улучшений в сборе образцов, обработке образцов и анализе данных, связанных с исследованиями eDNA. В ранних исследованиях для захвата ДНК из образцов воды использовалось осаждение алкоголя³. Несмотря на то, что этот метод проверен и верен, необходимость анализа больших объемов воды для повышения чувствительности анализа делает его непривлекательным из-за типичного требования к двум объемам этанола на каждый объем пробы воды.

В более поздних исследованиях обычно использовалась мембранная фильтрация, объясняя, что эДНК присутствует в континууме состояний от связанной с клеткой до свободно растворенной, но что растворенная ДНК подвержена быстрой деградации, и поэтому связанная с клеткой ДНК представляет собой наиболее значительную фракцию. Оптимизация фильтрующего материала и размера пор широко обсуждается и обсуждается, как и оптимальный метод (методы) экстракции захваченной эДНК из фильтра ^4,5,6.

Третьим подходом к захвату eDNA является флокуляция, процесс, который веками использовался для осветления жидкостей, включая воду, пиво и вино. В нескольких исследованиях использовалась флокуляция для захвата вируса из природных или питьевых источников воды 7,8,9,10,11. В этих исследованиях в качестве улавливающих агентов обычно использовалось предварительно флокулированное обезжиренное молоко или хлорид железа. Методы с использованием хлорида железа обычно приводят к последующим молекулярным проблемам анализа из-за ингибирования реакции ПЦР^12,13. Методы с использованием предварительно хлопья обезжиренного молока требуют предварительной подготовки флокулянта, контроля рН, и до сих пор применялись только для захвата вируса ^7,8,9.

В последнее время изучен флокуляционный захват бактерий и вирусов на основе использования хлорида лантана (III) 12,13,14,15. Авторы продемонстрировали, что таким методом можно собрать жизнеспособные патогены, так как связывание хлорида лантана было эффективным при низкой концентрации (0,2 мМ). Кроме того, флокуляция лантана обратима с помощью хелатирования в мягких условиях, в отличие от флокуляции хлорида железа.

Таким образом, флокуляция с использованием хлорида лантана для улавливания биологических частиц привлекательна, учитывая, что требуется лишь небольшое количество добавленного концентрированного флокулянта, не требуется строгий контроль pH, а объемы образцов можно масштабировать от миллилитров до галлонов. Применительно к захвату эДНК легко восстанавливаются клеточные, субклеточные (митохондрии и хлоропласты), а также растворенные ДНК. Бактерии и вирусы собираются одновременно, что позволяет проводить тестирование патогенов и (или) дополнительные экологические исследования из одной пробы воды. Представлен протокол флокуляции с использованием хлорида лантана, который позволяет собирать растворенные и связанные с частицами нуклеиновые кислоты из проб воды.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Обеззараживание оборудования и подготовка флокуляционных реагентов

1. Тщательно вымойте все бутылки, трубки и другой ранее использованный инвентарь средством для мытья посуды и горячей водой.
2. Опрыскайте все флаконы, трубки и другое ранее использованное оборудование 6% раствором лимонной кислоты для удаления минеральных отложений, дайте постоять 20 минут и промойте водопроводной водой.
3. Во все флаконы (примерно 10% от объема емкости) добавить раствор разбавленной в 10 раз бытовой хлорной извести (0,5-0,6% конечной концентрации гипохлорита натрия), взболтать, дать настояться не менее 1 ч, затем слить воду и промыть водопроводной водой до тех пор, пока от отбеливателя не останется и следа. Затем один раз смойте деионизированной водой.
4. Просушите все бутылки.
5. Поместите все флаконы и крышки для сбора в шкаф биологической безопасности и облучайте ультрафиолетовыми бактерицидными лампами в течение 2 часов, вращая каждый флакон и крышку на четверть оборота каждые полчаса.
6. Наденьте крышки на бутылки и неплотно закрутите. Взвесьте каждую бутылку и запишите ее пустой вес на бутылке.
7. Приготовьте 100 мМ раствор гептагидрата лантана (III) хлорида, растворив 3,71 г в 100 мл деионизированной воды. Чтобы свести к минимуму воздействие химического вещества на воздух, так как хлорид лантана гигроскопичен, заклеивайте бутылку лентой между использованиями.
   ВНИМАНИЕ: Хлорид лантана содержит сигнальное слово, предупреждающее об опасности. H315 вызывает раздражение кожи. H319 вызывает серьезное раздражение глаз. H335 может вызвать раздражение дыхательных путей. Используйте средства индивидуальной защиты. Для получения дополнительной информации см. паспорт безопасности материала.
8. Приготовьте 1 М раствор гидрокарбоната натрия, растворив 84,01 г гидрокарбоната натрия в 1 л деионизированной воды. Фильтр простерилизовать и хранить при комнатной температуре.

2. Отбор проб и флокуляция

1. Соберите пробы с каждого участка плюс одну полевую заготовку (пробу с питьевой водой, заполненную на месте для контроля загрязнения), наполнив бутылки соответствующего размера. Отрегулируйте количество отбираемых проб в соответствии с планом эксперимента и целевым назначением. Не переполняйте бутылки за плечо бутылки, чтобы обеспечить расширение при замораживании образцов.
2. Записывайте соответствующие метаданные, включая дату, время и местоположение по GPS. Наклейте этикетки на контейнеры с образцами.
3. Добавьте 1 М раствор бикарбоната натрия в каждый образец и заполните поле. Добавьте 10 мл на 500 мл образца.
4. Закупорьте бутылки крышками и перемешайте.
5. Добавьте 100 мМ хлорида лантана в каждый образец и заполните поле. Добавьте 1 мл на 500 мл образца.
6. Закупорить крышкой и тщательно перемешать. Закрепите колпачок изолентой изолентой.
7. Хранить на льду до возвращения в полевую лабораторию, затем образцы могут храниться в течение ночи в холодильнике и вертикальном положении, чтобы хлопья могли осесть на дно контейнера, или замораживать при температуре -20 °C для отправки во вторую лабораторию для дальнейшей обработки. Образцы должны быть заморожены в вертикальном положении, чтобы жидкость могла расшириться и предотвратить разрыв контейнера.

3. Переработка хлопьев

1. Разморозьте замороженные образцы при комнатной температуре в холодильнике или переместите незамороженные образцы в подходящую зону рабочего стола, которая включает в себя перистатический насос и трубку для аспирации надосадочной жидкости для проб. Убедитесь, что трубки, проходящие через перистальтический насос, сливаются в большое ведро на полу. Заборник должен быть оборудован чистой пластиковой соломинкой для питья для контроля притока.
2. Используйте перистальтический насос для удаления надосадочной жидкости, используя соломинку для питья, чтобы сначала направить всасывание чуть ниже поверхности жидкости и переместить впуск соломинки вниз вместе с уровнем жидкости. Удалите остатки надосадочной жидкости, осторожно переместив воздухозаборник так, чтобы он упирался в понтил (приподнятую ямочку на дне флакона). Это обеспечивает максимальное удаление жидкости, в то время как хлопья собираются по периферии (см. Рисунок 1).

Рисунок 1: Сбор хлопьев, осевших при единичной плотности . Хлопья, содержащие клеточный материал и эДНК, оседают на дне флакона с образцом и готовы к извлечению после удаления надосадочной жидкости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

3. Прикрепите чистую соломинку для питья и повторите удаление надосадочной жидкости для каждого образца.
4. Используйте чистую дозатор объемом 20 мл и контроллер дозатора, чтобы полностью перенести суспензию хлопьев в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Используйте промывки с деионизированной водой небольшого объема (примерно 5 мл), чтобы убедиться, что из бутылки с пробой удалены любые остаточные хлопья.
5. Отрегулируйте все пробирки объемом 50 мл до равных объемов с деионизированной водой и соберите хлопья центрифугированием при плотности 2 500 x g в течение 20 минут.
6. Слейте надосадочную жидкость и сделайте трубки стоящими перевернутыми на чистом бумажном полотенце для стекания.
7. Ресуспендируйте хлопья в 1 мл 0,5 М ЭДТА, pH 8,0 путем вихревого перемешивания, а затем добавьте 4 мл 1x раствора TE, pH 8,0 и снова перемешайте. Переложите ресуспендированные хлопья в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл, добавьте 50 мкл 10% линейного полиакриламида и вортекс. Добавьте 5 мл 100% изопропанола, перемешайте и дайте постоять на льду 20 минут.
8. Центрифугируйте при 6 000 x g в течение 20 минут для сбора ДНК и клеточных частиц. Слейте надосадочную жидкость и дайте ей постоять перевернутой на чистых бумажных полотенцах, чтобы она стекала. Дайте немного подсохнуть, но не пересушите.
9. Начните процесс экстракции ДНК из хлопьев с помощью коммерческого набора, в котором используется взбивание бусин и связывание спин-колонки емкостью 25 мкг.
   1. Во-первых, повторно суспендируйте хлопья в 800 мкл буфера для лизиса, входящего в комплект, и полностью перенесите суспензию в трубку для взбивания шариков. Борт взбивает суспензию хлопьев за короткое время с охлаждением между ними. Гомогенаты могут храниться в замороженном виде на этом этапе или продолжать работу с протоколом набора.
   2. Сначала выделите ДНК из спиновой колонки с помощью 100 μл, а затем повторно проведите элюат через спиновую трубку.
   3. Наконец, вымывайте остаточную ДНК из колонки с помощью дополнительной аликвоты элюирующего буфера в объеме 100 мкл, чтобы получить общий объем 200 мкл. Это максимизирует восстановление.
10. Сбор, подготовка и анализ eDNA для демонстрации производительности этого протокола и его производительности по сравнению с широко используемым методом фильтрации.
    1. Приготовьте реакции, содержащие 1x мастер-смесь для количественной ПЦР, 25 мкг/мл бычьего тромбина^14,16, 0,4 мкМ прямого и обратного праймеров и 2 мкл матрицы (1% восстановленной ДНК образца). Построение стандартных кривых с использованием серийных разведений очищенных и количественно обеспеченных ПЦР-ампликонов, полученных с использованием ваучерной ДНК. В качестве альтернативы мишени могут быть синтезированы коммерчески.
    2. Используйте метод сравнительной количественной оценки, если стандарт недоступен. Для этого примера проведите термоциклирование с использованием условий реакции 95 °C в течение 10 мин, а затем 40 циклов при 95 °C в течение 10 с, 57 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, хотя эти условия должны быть скорректированы для других анализов. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения производителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Восемь проб воды объемом 500 мл (по 450 мл каждая), взятых из аквариума, в котором содержались две восточные расписные черепахи (Chrysemys picta picta), были использованы для получения eDNA с использованием описанного протокола. Еще восемь проб воды объемом 500 мл были отфильтрова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несмотря на то, что этот метод прост, некоторые шаги имеют решающее значение для успеха. Сбор и перенос хлопьев должен быть выполнен полностью, чтобы не потерять ДНК. Остаточный материал необходимо собирать с помощью стратегических промывок. В описанном протоколе исп?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA, pH 8.0	Available from several commercial sources
1 x TE Buffer, pH 8.0	Available from several commercial sources
15 ml Conical Centrifuge Tubes	Single use
16 oz. PET Clear Square Bottles	Reusable with cleaning and decontamination
38/400 Polypropylene Cap with Pressure Sensitive Liner	Leave caps loosely attached until use. Cap tightly to seal pressure sensitive liner.
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Single use
6% Citric Acid Solution	Use to remove mineral deposits from reusable sample bottles.
Fecal/Soil Microbe Kit	Use inhibitor removal resin or column
Lanthanum (III) chloride heptahydrate	100 mM Stock Solution
Peristaltic DC Pump	Any peristaltic pump will do, or can be syphoned
Polyacryl Carrier	10% linear polyacrylamide
Sodium Bicarbonate	1 M, filter sterilized and stored at room temperaruture