التحقيق في التمثيل الغذائي Xenobiotics في ساليس ألبا يترك عن طريق التصوير الطيفي الشامل

Summary

تستخدم هذه الطريقة التصوير الطيفي الكتلي (MSI) لفهم عمليات التمثيل الغذائي في أوراق S. alba عند التعرض للزينوبيوتكس. تسمح هذه الطريقة بالتوطين المكاني للمركبات ذات الاهتمام ونواتج الأيض المتوقعة داخل أنسجة محددة سليمة.

Abstract

تستخدم الطريقة المقدمة التصوير الطيفي الكتلي (MSI) لتحديد الملف الأيضي لأوراق S. alba عند تعرضها للزينوبيوتكس. وباستخدام نهج غير محدد الهدف، يتم تحديد الأيض النباتي والزينوبيات ذات الأهمية وتوطينها في الأنسجة النباتية للكشف عن أنماط توزيع محددة. ثم, في التنبؤ سيليكو من الأيض المحتملة (أي, يتم تنفيذ الأيض والموارنات) من xenobiotics المحددة. عندما يقع المستقلب الزينوبيوتي في الأنسجة، يتم تسجيل نوع الإنزيم المشارك في تغيير النبات. وقد استخدمت هذه النتائج لوصف أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية التي تحدث في أوراق ألبا S. استجابة لتراكم الزينوبيوتيك في الأوراق. تم التنبؤ بالميثابات في جيلين ، مما يسمح لتوثيق التفاعلات البيولوجية المتعاقبة لتحويل الزينوبيولوجيات في أنسجة الأوراق.

Introduction

يتم توزيع الزينوبيوتكس على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم بسبب الأنشطة البشرية. بعض هذه المركبات قابلة للذوبان في الماء وتمتصها التربة¹، وتدخل السلسلة الغذائية عندما تتراكم في الأنسجة النباتية^2،3،4. تؤكل النباتات من قبل الحشرات والحيوانات العاشبة ، والتي هي فريسة للكائنات الحية الأخرى. وقد وصفت تناول بعض xenobiotics وتأثيرها على صحة النبات⁵،^6،7،8، ولكن مؤخرا فقط في مستوى الأنسجة⁹. لذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح أين أو كيف يحدث التمثيل الغذائي للزينوبيوتكس، أو إذا ترتبط الأيض النباتية محددة لتراكم xenobiotic في أنسجة محددة¹⁰. وعلاوة على ذلك، فإن معظم البحوث قد تجاهلت التمثيل الغذائي للxenobiotics والأيض في النباتات، لذلك لا يعرف سوى القليل عن هذه التفاعلات في الأنسجة النباتية.

المقترح هنا هو وسيلة للتحقيق في ردود الفعل الأنزيمية في العينات البيولوجية التي يمكن أن تكون مرتبطة توطين الأنسجة من الركائز والمنتجات من ردود الفعل. يمكن أن ترسم هذه الطريقة الملف الأيضي الكامل لعينة بيولوجية في تجربة واحدة ، حيث أن التحليل غير مستهدف ويمكن التحقيق فيه باستخدام قوائم مخصصة من التحليلات ذات الاهتمام. شريطة قائمة المرشحين تعقبها في مجموعة البيانات الأصلية. إذا لوحظ تحليل واحد أو عدة من الفائدة في العينة، يمكن أن يوفر توطين الأنسجة المحددة معلومات مهمة عن العمليات البيولوجية ذات الصلة. ويمكن بعد ذلك تعديل التحليلات ذات الأهمية في السيليكو باستخدام القوانين البيولوجية ذات الصلة للبحث عن المنتجات/الأيضات المحتملة. ثم يتم استخدام قائمة الأيض التي تم الحصول عليها لتحليل البيانات الأصلية من خلال تحديد الإنزيمات المعنية وتوطين ردود الفعل في الأنسجة ، مما يساعد على فهم عمليات التمثيل الغذائي التي تحدث. لا توجد طريقة أخرى توفر معلومات عن أنواع التفاعلات التي تحدث في العينات البيولوجية ، وتوطين المركبات ذات الاهتمام ، والأيض ذات الصلة. ويمكن استخدام هذه الطريقة على أي نوع من المواد البيولوجية مرة واحدة الأنسجة الطازجة وسليمة وتتوفر ويمكن أن تكون المركبات ذات الأهمية المؤينة. وقد نشر البروتوكول المقترح في فيليت وآخرون^{في 12} وهو مفصل هنا لكي تستخدمه الأوساط العلمية.

Protocol

1. إعداد العينة

1. الحصول على العينة البيولوجية وإما الاحتفاظ بها طازجة وسليمة (على سبيل المثال، لا تجبرها على أنبوب) أو تجميدها. وينطبق البروتوكول المقترح على أي نوع من العينات البيولوجية الصلبة (أي الأنسجة النباتية أو الحيوانية أو البشرية) لترجمة المركبات في أنسجة محددة.
2. تبرد عملية قطع الباب إلى -20 درجة مئوية. حافظ على حامل العينة والشفرة في نفس درجة الحرارة.
3. إذا لزم الأمر، تضمين الكائن في M1 تضمين المتوسطة للحفاظ عليه أثناء القطع.
   1. صب بعض مصفوفة في قالب من البلاستيك وضعت في غرفة cryomicrotome. بسرعة إضافة العينة وصب بعض أكثر تضمين المتوسطة لتغطية ذلك. الحفاظ على عينة في وسط القالب كما يتماسك مصفوفة في حين تهدئة.
      ملاحظة: تضمين غير ضروري لكافة الكائنات البيولوجية. الكائنات المتجانسة مثل أدمغة الماوس لا تحتاج إلى تضمين المتوسطة ويمكن قطع المجمدة.
4. ضع العينة المضمنة أو المجمدة على حامل cryomicrotome وقطعها بشفرة حادة. سمك 5-30 ميكرومتر جيد لعينات النباتات، والتي يصعب قطعها بسبب عدم التجانس. تكييف سمك القطع ودرجة الحرارة للعينة، مما يجعل عدة تخفيضات للعثور على أفضل الظروف. وفي المثال المقدم، قطعت العينة عند -20 درجة مئوية. فكر في إبقاء العينة تحت الصفر لتجنب تدهور العينة.
   ملاحظة: يمكن أن يساعد استخدام المجهر ذو المنظار الموضوع بجوار عملية استئصال الباب التبريد في تحديد جودة الشرائح. يجب أن تبقى الأنسجة سليمة.
5. قم بتحريك الشريحة بعناية إلى شريحة مغلفة ب ITO باستخدام ملقط أو فرشاة طلاء صغيرة ، ثم ضع إصبعا تحت الشريحة لتسخين العينة وتجفيفها. إبقاء الشريحة في غرفة cryomicrotome حتى تكون جميع العينات جاهزة. أخرج الشريحة من الغرفة ببطء لتجنب الصدمة الحرارية.
   ملاحظة: للتحقق من أي جانب من الشريحة مغلف ب ITO، ضع قطرة ماء على الشريحة في درجة حرارة الغرفة (RT). سيبقى القطرة مستديرة على الجانب المغلف ب ITO أو تتسطح على الجانب غير المصقول.
6. رسم علامات على الشريحة باستخدام قلم علامة رقيقة أو سائل التصحيح ومسحها ضوئيا مع ماسح ضوئي عالي الدقة قبل ترسب المصفوفة. سيتم استخدام العلامات لتحديد موضع العينة الدقيق على الشريحة عندما تكون في مطياف الكتلة. أفضل طريقة للحصول على نقاط مرجعية دقيقة هي رسم الصليب.

2. ترسب مصفوفة

1. إعداد مصفوفة MALDI: تزن 70 ملغ من α-سيانو-4-هيدروكسي سيناميك (HCCA) مصفوفة وتمييعه في 10 مل من محلول الماء والميثانول (50:50) مع 0.2٪ TFA. Sonicate المصفوفة لمدة 10 دقائق في RT. قد يكون هناك مصفوفة صلبة اضافية بعد sonication.
   ملاحظة: يمكن استخدام أنواع مختلفة من مصفوفات MALDI اعتمادا على التحليلات من الفائدة.
2. تنظيف مصفوفة ترسب الروبوت مع الميثانول 100٪.
3. باستخدام الميثانول ومسح الدقة، وتنظيف الشريحة، وعقد العينات دون لمسها ودون إزالة علامات. إضافة غطاء نظيف فوق الشريحة في منطقة بدون عينة. ثم يتم وضع هذا الجزء من الشريحة على الكاشف البصري لتتبع ترسب المصفوفة.
   ملاحظة: لتتبع بصريا سمك المصفوفة، يجب أن تكون الشريحة وأغطية نظيفة جدا.
4. استخدام الروبوت لترسب مصفوفة: ضع فقط 6 مل من محلول المصفوفة في الخزان، وإضافة 2 مل من الميثانول 100٪ لحجم إجمالي قدره 8 مل.
   ملاحظة: تسجيل سمك مصفوفة على طول ترسب تلقائي ويمكن استردادها باستخدام عصا USB. لا يتم تفصيل تطوير طريقة الرش هنا.

3. الحصول على البيانات

1. ضع 1 ميكرولتر من المصفوفة على لوحة MALDI لمعايرة مطياف الكتلة باستخدام قمم المصفوفة كمراجع. لا يتم تفصيل تطوير طريقة الاستحواذ على مطياف الكتلة هنا.
   1. إدراج لوحة MALDI في المصدر، انقر فوق"تحميل الهدف"في برنامج ftmsControl، وانتظر لوحة ليتم تحميلها.
   2. اختر موضع بقعة المصفوفة بالنقر على البقعة في الصورة التي تمثل لوحة MALDI.
   3. الإشارة إلى اسم العينة والمجلد في علامة التبويب"معلومات نموذج"من البرنامج.
   4. ابدأ عملية الاستحواذ بالنقر فوق"اكتساب".
   5. حرك اللوحة قليلا أثناء عملية الاستحواذ باستخدام مؤشر الماوس على علامة التبويب"فيديو MALDI"بحيث نقاط الليزر في بقع مختلفة.
   6. عند الانتهاء من عملية الاستحواذ، انتقل إلى علامة التبويب"معايرة"واختر قائمة معايرة HCCA في الوضع التربيعي وانقر فوق تلقائي. يشار إلى نتيجة المعايرة العالمية في إطار"مؤامرة المعايرة"ويجب أن تكون أقل من 0.2 ppm ل SolariX XR 7T.
   7. إذا كانت المعايرة جيدة، فانقر فوق"قبول"وحفظ الطريقة.
2. بمجرد الانتهاء من ترسب المصفوفة على العينات، ضع الشريحة في محول الشريحة واسترجاع موضع العلامات باستخدام غطاء بلاستيكي.
3. في برنامج flexImaging، قم بإعداد تشغيل تصوير جديد باستخدام النافذة الأولى التي تفتح مع البرنامج.
   1. قم بتسمية تشغيل التصوير، وحدد دليل النتائج، وانقر فوق التالي.
   2. أشر إلى حجم النقطية (أي منطقة القياس المعرفة من قبل المستخدم)، واختر الطريقة التي سيتم استخدامها (معايرة في القسم 3.1)، وانقر فوق التالي.
   3. تحميل الصورة البصرية للشريحة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.6 بعد مسح الشريحة وانقر فوق التالي.
   4. تفتح الصورة في إطار أوسع. استخدام علامات على الشريحة لتعليم موقف الشرائح: في ftmsControl، ضع الهدف من إطار الفيديو MALDI على الموضع الدقيق للعلامة، ثم العودة إلى felxImaging وانقر على نفس النقطة بالضبط على الصورة البصرية. كرر هذا لثلاث نقاط مستقلة. يتم وضع الغطاء البلاستيكي الذي يحمل العلامات على لوحة MALDI لاستعادة موقعها وتسهيل التدريس.
      ملاحظة: إذا تم إجراء العلامات مع علامة، إضافة سائل تصحيح أبيض في الجزء الخلفي من الشريحة يمكن جعلها تبرز أثناء التدريس.
4. رسم المناطق ذات الاهتمام في العينات في برنامج flexImaging باستخدام"إضافة مناطق القياس"أدوات.
5. حفظ تشغيل التصوير و"تسلسل AutoXecute"إذا كان العديد من العينات التي سيتم تحليلها.
6. إطلاق تسلسل باستخدام"AutoXecute الدفعة عداء"إذا تم تحليل عدة عينات.
   ملاحظة: مزامنة البيانات بانتظام إلى موقع آمن.

4. معالجة البيانات

1. استيراد البيانات الأولية إلى برنامج التصور (مختبر SCiLS) وإنشاء مجموعة بيانات. ويتم ذلك في خطوتين منفصلتين في هذا البرنامج.
   1. استخدام"دفعة المستورد"أداة وحدد البيانات الخام، تشير إلى الدليل الهدف، وانقر على"استيراد".
   2. بعد الاستيراد، يمكن الجمع بين عدة مجموعات بيانات لمزيد من التحليل. لدمج مجموعات البيانات، استخدم"ملف| جديد| مجموعة البيانات" أداة.
   3. حدد نوع الأداة المستخدمة للاستحواذ، وأضف مجموعات البيانات المستوردة بالنقر فوق "+" ، ورتب الصور بالنقر فوق الكائنات وسحبها.
   4. تحقق من إعدادات النطاق الشامل أو قم بتعديلها إذا لزم الأمر عن طريق الإشارة إلى نطاق الاهتمام. انقر فوق التالي لمشاهدة ملخص الاستيراد ثم قم بتشغيل الاستيراد.
2. تصور م / ض من الاهتمام في الأنسجة المختلفة لعينة و / أو في عينات مختلفة. ببساطة انقر على الأطياف لتحديد م / ض من الفائدة أو اكتب القيمة في مربع م / ض .
   1. إجراء اختبارات إحصائية إذا لزم الأمر للبحث عن قيم ضخمة أو تمييزية بين الأنسجة المختلفة و / أو عينات مختلفة لتحديد m / z من الفائدة. تتوفر الأدوات في القائمة "Tool" ولن يتم وصفها في هذا البروتوكول.
3. تصدير m/z الفائدة (مثل، المركبات الضخمة والتمييزية) كملف .csv من علامة التبويب كائن. ويمكن أيضا تصدير مجموعة البيانات بأكملها إذا لم تكن كبيرة جدا (أي الحد الأقصى 60000 سطر). انقر على رمز"تصدير"على الجانب الأيمن من منطقة الاهتمام المشار إليها بسهم أحمر.
4. استيراد ملف .csv لإنشاء مجموعة بيانات جديدة في برنامج التعليق التوضيحي (Metaboscape). انقر على "المشاريع | استيراد مشروع CSV". كن على علم بأنه سيتم النظر فقط في m/z بالضبط، ويتم فقدان الملف الشخصي النظيري.
   ملاحظة: يسمح إصدار البرنامج 5.0 باستيراد البيانات مباشرة من برنامج التصور، مما يتيح التعليق التوضيحي الأكثر دقة، لأنه يمكن اعتبار ملف التعريف النظيري.
5. قم بإضافة تعليق توضيحي مع قوائم تحليل مخصصة، والتي يمكن اشتقاقها من قواعد البيانات المتاحة للجمهور. يتم إعطاء قالب بواسطة البرنامج لإنشاء قوائم تحليل.
6. استخدام برنامج التنبؤ (توقع المستقلب) لأداء في التنبؤ سيليكو من الأيض من المركبات المشروحة. هناك حاجة إلى الصيغة المطورة لمجمع الفائدة ، إما رسمها المستخدم في البرنامج أو استيرادها كملف .mol. ثم الأسلوب هو بروتوكول خطوة بخطوة بسيطة.
7. استرداد قائمة الأيض, إنشاء قائمة تحليل, واستخدامها في برنامج التعليق التوضيحي للتعليق على البيانات الخام مع الأيض المتوقع. بدلا من ذلك, إذا كانت قائمة الأيض قصيرة, البحث يدويا عن ذلك في الخطوة 4.8.
8. تصور توزيع الأنسجة من الأيض في البيانات الخام في برنامج التصور.
9. استعادة أسماء الإنزيمات المشاركة في عمليات التمثيل الغذائي في برنامج التنبؤ عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على المستقلب المتوقع من الفائدة.

النتائج

تم تطبيق هذا البروتوكول على الأوراق الطازجة عينات من شجرة ألبا S. تتعرض لxenobiotics في البيئة. يتم تصوير العملية في الشكل 1. الخطوة الأولى هي إعداد شرائح رقيقة من عينة من الاهتمام. غالبا ما يكون قطع عينات النباتات أكثر صعوبة من عينات الحيوانات ، حيث أن الأنسجة غير متجانسة وي?...

Discussion

الجزء الحاسم من هذا البروتوكول هو إعداد العينة: يجب أن تكون العينة ناعمة وسليمة. القطع هو الجزء الأكثر صعوبة، حيث أن درجة حرارة وسمك العينة يمكن أن تختلف تبعا لنوع العينة التي تمت دراستها. الأنسجة الحيوانية عادة ما تكون متجانسة وأسهل لقطع. غالبا ما تتضمن عينات النباتات هياكل مختلفة ، وبالت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed