Salix alba Leaves'ta Kizobiyotik Metabolizmasının Kütle Spektrometresi Görüntüleme Yoluyla Araştırılması

Özet

Bu yöntem, ksenobiyotiklere maruz kaldığında S. alba yapraklarındaki metabolik süreçleri anlamak için kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kullanır. Yöntem, belirli, bozulmamış dokular içinde ilgi çekici bileşiklerin ve tahmin edilen metabolitlerin mekansal lokalizasyonuna izin verir.

Özet

Sunulan yöntem, ksenobiyotiklere maruz kaldığında S. alba yapraklarının metabolik profilini oluşturmak için kütle spektrometresi görüntüleme (MSI) kullanır. Hedefsiz bir yaklaşım kullanılarak, bitki metabolitleri ve ilgi çekici ksenobiyotikler, belirli dağılım kalıplarını ortaya çıkarmak için bitki dokularında tanımlanır ve lokalize edilir. Daha sonra, tanımlanan ksenobiyotiklerden potansiyel metabolitlerin (yani katabolitlerin ve konjugelerin) siliko tahmini yapılır. Dokuda bir ksenobiyotik metabolit bulunduğunda, bitki tarafından değiştirilmesinde rol oynayan enzim türü kaydedilir. Bu sonuçlar, yapraklardaki ksenobiyotik birikime yanıt olarak S. alba yapraklarında meydana gelen farklı biyolojik reaksiyon türlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Metabolitler iki nesilde tahmin edildi ve art arda gelen biyolojik reaksiyonların belgelenmesine izin vererek yaprak dokularındaki ksenobiyotikleri dönüştürdü.

Giriş

Kizobiyotikler, insan faaliyetleri nedeniyle dünya çapında yaygın olarak dağıtılmaktadır. Bu bileşiklerin bazıları suda çözünür ve toprak¹tarafından emilir ve bitki dokularında biriktiklerinde besin zincirine girer 2^,3,4. Bitkiler, diğer organizmaların avı olan böcekler ve otçullar tarafından yenir. Bazı ksenobiyotiklerin alımı ve bir bitkinin sağlığı üzerindeki etkileri⁵, 6^,7,8,ancak son zamanlarda doku düzeyinde⁹olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, ksenobiyotik metabolizmasının nerede veya nasıl oluştuğu veya spesifik bitki metabolitlerinin belirli dokularda ksenobiyotik birikimle ilişkili olup olmadığı hala belirsizdir¹⁰. Dahası, çoğu araştırma ksenobiyotiklerin metabolizmasını ve bitkilerdeki metabolitlerini gözden kaçırmıştır, bu nedenle bitki dokularındaki bu reaksiyonlar hakkında çok az şey bilinmektedir.

Burada önerilen, biyolojik örneklerde alt tabakaların ve reaksiyonların ürünlerinin doku lokalizasyonu ile ilişkilendirilebilen enzimmatik reaksiyonları araştırmak için bir yöntemdir. Yöntem, bir deneyde biyolojik bir örneğin tam metabolik profilini çizebilir, çünkü analiz hedefsizdir ve özel ilgi analit listeleri kullanılarak araştırılabilir. Sağlanan, özgün veri kümesinde izlenen adayların bir listesidir. Örnekte bir veya birkaç ilgi analitleri dikkat çekiyorsa, spesifik doku lokalizasyonu ilgili biyolojik süreçler hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. İlgi analitleri daha sonra olası ürünleri / metabolitleri aramak için ilgili biyolojik yasalar kullanılarak silikoda değiştirilebilir. Elde edilen metabolitlerin listesi daha sonra ilgili enzimleri tanımlayarak ve dokulardaki reaksiyonları lokalize ederek orijinal verileri analiz etmek için kullanılır, böylece meydana gelen metabolik süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olur. Başka hiçbir yöntem, biyolojik örneklerde meydana gelen reaksiyon türleri, ilgi bileşiklerinin lokalizasyonu ve ilgili metabolitleri hakkında bilgi sağlamaz. Bu yöntem, taze ve bozulmamış dokular mevcut olduğunda ve ilgi bileşikleri iyonize edilebilir. Önerilen protokol Villette ve ark.^12'de yayınlandı ve bilim topluluğu tarafından kullanılmak üzere burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protokol

1. Numune hazırlama

1. Biyolojik numuneyi alın ve taze ve sağlam tutun (örneğin, bir tüpe zorlamayın) veya dondurun. Önerilen protokol, belirli dokulardaki bileşikleri lokalize etmek için her türlü katı biyolojik örnek (örneğin, bitki, hayvan veya insan dokuları) için geçerlidir.
2. Kriyomikrotom'u -20 °C'ye soğutin. Numune tutucuyu ve bıçağı aynı sıcaklıkta tutun.
3. Gerekirse, kesme sırasında korumak için nesneyi M1 gömme ortamına gömün.
   1. Kriyomikrotom odasına yerleştirilmiş plastik bir kalıba biraz matris dökün. Örneği hızla ekleyin ve örtmek için biraz daha gömme ortamı dökün. Matris soğurken katılaştıkça numuneyi kalıbın ortasında muhafaza edin.
      NOT: Gömme tüm biyolojik nesneler için gerekli değildir. Fare beyinleri gibi homojen nesnelerin gömme ortamına ihtiyacı yoktur ve donmuş olarak kesilebilir.
4. Gömülü veya dondurulmuş numuneyi kriyomikrotom tutucusuna yerleştirin ve keskin bir bıçakla kesin. 5-30 μm kalınlığı, heterojenlikleri nedeniyle kesilmesi zor olan bitki örnekleri için iyidir. Kesme kalınlığını ve sıcaklığını numuneye uyarlayın, en iyi koşulları bulmak için birkaç kesim yaptı. Sağlanan örnekte, örnek -20 °C'de kesilmiştir. Numune bozulmasını önlemek için numuneyi 0 °C'nin altında tutmayı düşünün.
   NOT: Kriyomikrotomun yanına yerleştirilen dürbün mikroskobu kullanımı, dilimlerin kalitesini belirlemeye yardımcı olabilir. Dokular bozulmadan kalmalı.
5. Dilimi, torpil veya küçük bir boya fırçası kullanarak ITO kaplı bir slayda dikkatlice taşıyın, ardından numuneyi ısıtmak ve kurutmak için slaydın altına bir parmak yerleştirin. Tüm numuneler hazır olana kadar slaydı kriyomikrotom odasında tutun. Isı şokunun önüne geçesiniz diye kaydırağı yavaşça hazneden çıkarın.
   NOT: Kaydırağın hangi tarafının ITO kaplı olduğunu kontrol etmek için, oda sıcaklığında (RT) kaydırağın üzerine bir damla su yerleştirin. Damla, ITO kaplı tarafta yuvarlak kalacak veya kaplamasız tarafta düzleştirilecektir.
6. İnce bir işaret kalemi veya düzeltme sıvısı kullanarak slaytta işaretler çizin ve matris biriktirmeden önce yüksek çözünürlüklü bir tarayıcıyla tarayın. İşaretler, kütle spektrometresindeyken numunenin slayttaki tam konumunu belirlemek için kullanılacaktır. Kesin referans noktaları elde etmenin en iyi yolu bir haç çizmektir.

2. Matris ifadesi

1. MALDI matrisini hazırlayın: 70 mg α-cyano-4-hidroksinnamik asit (HCCA) matrisini tartın ve% 0.2 TFA ile 10 mL su ve metanol çözeltisinde (50:50) seyreltin. Matrisi RT'de 10 dakika sonicate edin. Sonication sonra ekstra katı matris olabilir.
   NOT: İlgi analitlerine bağlı olarak farklı MALDI matrisleri kullanılabilir.
2. Matris biriktirme robotını % 100 metanol ile temizleyin.
3. Metanol ve hassas bir silme kullanarak, slaytı temizleyin, örnekleri dokunmadan ve izleri çıkarmadan tutun. Örneksiz bir alanda slaydın üzerine temiz bir kapak kılıfı ekleyin. Slaytın bu kısmı daha sonra matris biriktirmeyi izlemek için optik dedektörün üzerine yerleştirilir.
   NOT: Matris kalınlığını optik olarak izlemek için slayt ve kapak kapağı çok temiz olmalıdır.
4. Matris biriktirme için robotu kullanın: matris çözeltisinin sadece 6 mL'sini rezervuara yerleştirin ve toplam 8 mL hacim için 2 mL% 100 metanol ekleyin.
   NOT: Biriktirme boyunca matris kalınlığının kaydedilimi otomatiktir ve bir USB bellek kullanılarak kurtarılabilir. Bir püskürtme yönteminin geliştirilmesi burada ayrıntılı olarak yer alamamaktadır.

3. Veri toplama

1. Matris tepelerini referans olarak kullanarak kütle spektrometresini kalibre etmek için matrisin 1 μL'lik kısmını bir MALDI plakasına yerleştirin. Kütle spektrometresinde bir edinme yönteminin geliştirilmesi burada ayrıntılı olarak açıklanmış değildir.
   1. MALDI plakasını kaynağa yerleştirin, ftmsControl yazılımında "Hedefi Yükle" yi tıklatın ve plakanın yüklenmesini bekleyin.
   2. Maldi plakasını temsil eden görüntüdeki noktaya tıklayarak matris noktasının konumunu seçin.
   3. Yazılımın "Örnek Bilgi" sekmesinde örnek adı ve klasörü belirtin.
   4. " Edinme " yi tıklatarakedinimebaşlayın.
   5. "MALDI video" sekmesindeki fare işaretçisini kullanarak alma sırasında plakayı hafifçe hareket ettirin, böylece lazer farklı noktalara işaret eder.
   6. Alım tamamlandığında, "Kalibrasyon" sekmesine gidin, İkinci Dereceden Modda HCCA kalibrasyon listesini seçin ve Otomatik'i tıklatın. Küresel kalibrasyon sonucu "Kalibrasyon Grafiği" penceresinde belirtilir ve SolariX XR 7T için 0,2 ppm'den az olmalıdır.
   7. Kalibrasyon iyiyse, "Kabul Et" i tıklayın ve yöntemi kaydedin.
2. Numunelerdeki matris biriktirme tamamlandıktan sonra, slaydı bir slayt adaptörüne yerleştirin ve plastik bir kapak kullanarak işaretlerin konumunu alın.
3. FlexImaging yazılımında, yazılımla açılan ilk pencereyi kullanarak yeni bir görüntüleme çalıştırması ayarlayın.
   1. Görüntüleme çalıştırmasını adlandırın, Sonuç Dizini'ni seçin ve İleri'yi tıklatın.
   2. Raster boyutunu belirtin (yani, kullanıcı tanımlı ölçüm bölgesi), kullanılacak yöntemi seçin (bölüm 3.1'de kalibre edildi) ve İleri 'yitıklatın.
   3. Slaydı taradıktan sonra 1.6.
   4. Görüntü daha geniş bir pencerede açılır. Slaytların konumunu öğretmek için slayttaki işaretleri kullanın: ftmsControl'de, MALDI video penceresinin hedefini bir işaretin tam konumuna yerleştirin, ardından felxImaging'e geri dönün ve optik görüntüde aynı noktaya tıklayın. Bunu üç bağımsız nokta için tekrarlayın. İşaretleri taşıyan plastik kapak, konumunu geri kazanmak ve öğretimi kolaylaştırmak için bir MALDI plakasına yerleştirilir.
      NOT: İşaretler bir işaretleyici ile yapılmışsa, slaytın arkasına beyaz düzeltme sıvısı eklemek, öğretim sırasında öne çıkmalarını sağlayabilir.
4. "Ölçüm Bölgeleri Ekle" araçlarını kullanarak flexImaging yazılımındaki örneklere ilgi alanlarını çizin.
5. Birkaç örnek analizedilecekse,görüntüleme çalıştırmasını ve " Otomatik Kesme Sırası " nı kaydedin.
6. Birkaç örnek analiz edilirse , "AutoXecute Batch Runner" kullanarak bir dizi başlatın.
   NOT: Verileri düzenli olarak güvenli bir konumla senkronize edin.

4. Veri işleme

1. Ham verileri görselleştirme yazılımına (SCiLS Lab) alın ve bir veri kümesi oluşturun. Bu, bu yazılımda iki ayrı adımda yapılır.
   1. "Toplu İçe Aktarıcı" aracını kullanın ve ham verileri seçin, hedef dizini belirtin ve "İçeri Aktar" ı tıklatın.
   2. İçe aktarma işleminden sonra, daha fazla analiz için birkaç veri kümesi birleştirilebilir. Veri kümelerini birleştirmek için "Dosya" | Yeni mi| Veri Kümesi" aracı.
   3. Edinme için kullanılan enstrüman türünü seçin, "+" öğesini tıklatarak içe aktarılan veri kümelerini ekleyin ve nesneleri tıklatıp sürükleyerek görüntüleri düzenleyin.
   4. Kütle aralığı ayarlarını kontrol edin veya gerekirse ilgi aralığını belirterek değiştirin. Alma özetini görmek ve içe aktarmayı başlatmak için İleri'yi tıklatın.
2. Bir numunenin farklı dokularında ve/veya farklı örneklerde ilginin m/z'lerini görselleştirin. İlgi çekici m/z'yi seçmek için spektruma tıklamanız veya değeri m/z kutusuna yazmanızyeterlidir.
   1. İlgi çekici m/z'yi belirlemek için farklı dokular ve/veya farklı örnekler arasında kolokalize veya ayrımcı değerleri aramak için gerekirse istatistiksel testler yapın. Araçlar "Araç" menüsünde mevcuttur ve bu iletişim kuralında açıklanmayacaktır.
3. İlgilenen m/z'yi (örneğin, kolokalize, ayrımcı bileşikler) Nesne sekmesinden .csv dosyası olarak dışa aktarın. Çok büyük değilse (yani, en fazla 60.000 satır) tüm veri kümesi de dışa aktarılabilir. Kırmızı bir okla gösterilen ilgi bölgesinin sağ tarafındaki "Dışa Aktar" simgesine tıklayın.
4. Ek açıklama yazılımında (Metaboscape) yeni bir veri kümesi oluşturmak için .csv dosyasını içeri aktarın. "Projeler | CSV projesini içeri aktarın". Sadece tam m/z'nin dikkate alınacağını ve izotopik profilin kaybolduğunu unutmayın.
   NOT: 5.0 yazılım sürümü, izotopik profil dikkate alınabileceğinden, daha doğru bir ek açıklama sağlayan görselleştirme yazılımından doğrudan veri alınmasına izin verir.
5. Genel kullanıma açık veritabanlarından türetilebilen özel yapım analit listeleriyle açıklama ekleme. Analiz listeleri oluşturmak için yazılım tarafından bir şablon verilir.
6. Açıklamalı bileşiklerin metabolitlerinin siliko tahmini gerçekleştirmek için tahmin yazılımını (Metabolit Predict) kullanın. İlgi bileşiminin geliştirilen formülüne, yazılımdaki kullanıcı tarafından çizilmiş veya .mol dosyası olarak içe aktarılmıştır. O zaman yöntem basit bir adım adım protokoldür.
7. Metabolit listesini kurtarın, bir analit listesi oluşturun ve tahmin edilen metabolitlerle ham verilere açıklama eklemek için ek açıklama yazılımında kullanın. Alternatif olarak, metabolitlerin listesi kısaysa, 4.8 adımında manuel olarak arayın.
8. Görselleştirme yazılımındaki ham verilerde metabolitlerin doku dağılımını görselleştirin.
9. Tahmin yazılımındaki metabolik süreçlerde yer alan enzimlerin adlarını, öngörülen ilgi metabolitine sağ tıklayarak kurtarın.

Sonuçlar

Bu protokol, ortamda ksenobiyotiklere maruz kalan bir S. alba ağacından örneklenen taze yapraklara uygulandı. İşlem Şekil 1'de tasvir edilir. İlk adım, ilgi örneğinin ince dilimlerini hazırlamaktır. Dokular heterojen olduğundan ve su ve/ veya hava içerebildiğinden, bitki örneklerinin kesilmesi genellikle hayvan örneklerinden daha zordur. Bu zorluk, numunenin etrafında homojen bir blok oluşturan gömme ortamı kullanılarak gerçekleştirilendir. Matris birikimi, ...

Tartışmalar

Bu protokolün kritik kısmı örnek hazırlamadır: numune yumuşak ve sağlam olmalıdır. Numunenin sıcaklığı ve kalınlığı çalışılan numunenin türüne bağlı olarak değişebileceğinden, kesim en zor kısımdır. Hayvan dokuları genellikle homojendir ve kesilmesi daha kolaydır. Bitki örnekleri genellikle farklı yapılar içerir ve bu nedenle bıçak yumuşak, sert veya boş vasküler dokularla karşılaştığından bozulmadan tutulması daha zordur. Hidrofilik dokularda buz oluşumunu ve yok olmas?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips	Bruker Daltonics	267942
Cryomicrotome	Thermo Scientific
Excel	Microsoft corporation
flexImaging	Bruker Daltonics
ftmsControl	Bruker Daltonics
GTX primescan	GX Microscopes
HCCA MALDI matrix	Bruker Daltonics	8201344
ImagePrep	Bruker Daltonics
ITO-coated slides	Bruker Daltonics	237001
M1-embedding matrix	ThermoScientific	1310
Metabolite Predict	Bruker Daltonics
Metaboscape	Bruker Daltonics
Methanol	Fisher Chemicals		No specific reference needed
MX 35 Ultra blades	Thermo Scientific	15835682
Plastic molds			No specific reference needed
SCiLS Lab	Bruker Daltonics
SolariX XR 7Tesla	Bruker Daltonics		The method proposed is not limited to this instrument
Spray sheets for ImagePrep	Bruker Daltonics	8261614
TFA	Sigma Aldrich		No specific reference needed